中瑞祥分光光度計(jì)儀器組成以及原理

第第頁中瑞祥分光光度計(jì)儀器構(gòu)成以及原理中瑞祥分光光度計(jì)儀器構(gòu)成以及原理儀器構(gòu)成分光光度計(jì)已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物試驗(yàn)室常規(guī)儀器。常用于核酸，蛋白定量以及細(xì)菌生長濃度的定量。儀器重要由光源、單色器、樣品室、檢測器、信號(hào)處理器和顯示與存儲(chǔ)系統(tǒng)構(gòu)成。原理分光光度計(jì)采納一個(gè)可以產(chǎn)生多個(gè)波長的光源，通過系列分光裝置，從而產(chǎn)生特定波長的光源，光線透過測試的樣品后，部分光線被汲取，計(jì)算樣品的吸光值，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。單色光輻射穿過被測物質(zhì)溶液時(shí)，被該物質(zhì)汲取的量與該物質(zhì)的濃度和液層的厚度（光路長度）成正比，其關(guān)系如下式：A=lg（I/I0）=lgT=kLc式中:A為吸光度；I0為入射的單色光強(qiáng)度；I為透射的單色光強(qiáng)度；T為物質(zhì)的透射率；k為摩爾汲取系數(shù)；L為被分析物質(zhì)的光程，即比色皿的邊長；c為物質(zhì)的濃度；物質(zhì)對光的選擇性汲取波長，以及相應(yīng)的汲取系數(shù)是該物質(zhì)的物理常數(shù)。當(dāng)已知某純物質(zhì)在肯定條件下的汲取系數(shù)后可用同樣條件將該供試品配成溶液，測定其汲取度,即可由上式計(jì)算出供試品中該物質(zhì)的含量。在可見光區(qū)，除某些物質(zhì)對光有汲取外，很多物質(zhì)本身并沒有汲取但可在肯定條件下加入顯色試劑或經(jīng)過處理使其顯色后再測定,故又稱比色分析。由于顯色時(shí)影響呈色深淺的因素較多，且常使用單色光純度較差的儀器，故測定時(shí)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)Ρ绕吠瑫r(shí)操作。常見用途核酸的定量核酸的定量是分光光度計(jì)使用頻率最高的功能?？梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA。核酸的最高汲取峰的汲取波長260nm。每種核酸的分子構(gòu)成不一，因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸，事先要選擇對應(yīng)的系數(shù)。如：1OD的吸光值分別相當(dāng)于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。測試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算，從而得出相應(yīng)的樣品濃度。測試前，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液的體積，爾后測試空白液和樣品液。然而，試驗(yàn)并非一帆風(fēng)順。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是試驗(yàn)者最頭痛的問題。靈敏度越高的儀器，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大。事實(shí)上，分光光度計(jì)的設(shè)計(jì)原理和工作原理，允許吸光值在肯定范圍內(nèi)變化，即儀器有肯定的精準(zhǔn)度和精準(zhǔn)明確度。如EppendorfBiophotometer的精準(zhǔn)度≤1.0%（1A）。這樣多次測試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動(dòng)，都是正常的。另外，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值，離子濃度等：在測試時(shí)，離子濃度太高，也會(huì)導(dǎo)致讀數(shù)漂移如TE，可大大穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避開存在一些細(xì)小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值最好在0.11.5A。在此范圍內(nèi)混合液不能存在氣泡，空白液無懸浮物，否則讀數(shù)漂移猛烈；必需使用相同的比色杯測試空白液和樣品，否