魏培海儀器分析高效液相色法

關(guān)于魏培海儀器分析高效液相色法

高效液相色譜法的特點(diǎn)

1.高壓：對(duì)流動(dòng)相施加高壓，使其迅速地通過色譜柱液；

2.高效：分離效率大高，甚至可實(shí)現(xiàn)手性分離；

3.高靈敏度：采用高靈敏度的檢測(cè)器;4.速度快：與經(jīng)典液相色譜法相比，高效液相色譜法所需的分析時(shí)間較少，一般少于1h；

5.應(yīng)用范圍更廣。第2頁,共79頁，星期六，2024年，5月HPLC與經(jīng)典LC的比較經(jīng)典液相色譜高效液相色譜

常壓或減壓

填料顆粒

柱效低

分析速度慢

色譜柱只用一次

不能在線檢測(cè)

高壓，15~35MPa

填料顆粒小，2~50μm

柱效高,n>30000塊/m

分析速度快

色譜柱可重復(fù)多次使用

能在線檢測(cè)第3頁,共79頁，星期六，2024年，5月HPLC與GC的比較相同點(diǎn)：具分離和分析功能，均可以在線檢測(cè)。

不同點(diǎn)：

分析對(duì)象GC：適于能氣化、熱穩(wěn)定性好、沸點(diǎn)較低的樣品，不適于高沸點(diǎn)、揮發(fā)性差、熱穩(wěn)定性差、離子型及高聚物的樣品。占有機(jī)物的20%。HPLC：不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，適于溶解后能制成溶液的樣品；分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差及高分子和離子型樣品。占有機(jī)物的80%以上。第4頁,共79頁，星期六，2024年，5月流動(dòng)相GC：流動(dòng)相為惰性氣體，如H2、N2、He、Ar；組分與流動(dòng)相無親合作用力，只與固定相作用。HPLC：流動(dòng)相為液體；流動(dòng)相與組分間有親合作用力，為提高柱的選擇性、改善分離度，增加了額外因素，如流動(dòng)相極性、pH值、不同比例的兩種或兩種以上液體的配比。流動(dòng)相種類較多，選擇余地廣。第5頁,共79頁，星期六，2024年，5月

GC：加溫操作。

HPLC：室溫；高壓（液體粘度大，峰展寬?。２僮鳁l件第6頁,共79頁，星期六，2024年，5月本章教學(xué)內(nèi)容高效液相色譜儀

；液相色譜中的固定相和流動(dòng)相；液相色譜法的主要類型

。第7頁,共79頁，星期六，2024年，5月本章知識(shí)目標(biāo)熟悉液相色譜法的分離原理、分析對(duì)象；熟悉液相色譜儀的基本構(gòu)造；熟悉液相色譜中的固定相、流動(dòng)相類型，掌握其選擇方法；了解液相色譜法中常用的檢測(cè)器類型和結(jié)構(gòu)。第8頁,共79頁，星期六，2024年，5月本章能力目標(biāo)

能根據(jù)基團(tuán)頻率判斷官能團(tuán)的存在；能掌握用液相色譜儀進(jìn)行樣品組分的分離和定量方法

。第9頁,共79頁，星期六，2024年，5月第一節(jié)高效液相色譜儀第10頁,共79頁，星期六，2024年，5月第11頁,共79頁，星期六，2024年，5月第12頁,共79頁，星期六，2024年，5月第13頁,共79頁，星期六，2024年，5月主要部件：高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)。輔助裝置：脫氣機(jī)、梯度洗脫裝置、自動(dòng)進(jìn)樣裝置、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。組成部件第14頁,共79頁，星期六，2024年，5月基本流程第15頁,共79頁，星期六，2024年，5月第16頁,共79頁，星期六，2024年，5月一、高壓輸液系統(tǒng)

包括：由貯液瓶、高壓泵、脫氣機(jī)、梯度洗脫等裝置。第17頁,共79頁，星期六，2024年，5月1．溶劑脫氣裝置作用：防止溶解在溶劑（流動(dòng)相、試樣）中的N2、O2進(jìn)入檢測(cè)器而使噪聲劇增。脫氣方式：氦氣鼓泡、超聲波脫氣、真空脫氣等。第18頁,共79頁，星期六，2024年，5月2．高壓泵作用：輸送流動(dòng)相。無脈動(dòng)或脈動(dòng)極小，保證輸出的流動(dòng)相具有恒定的流速。要求：具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等。第19頁,共79頁，星期六，2024年，5月第20頁,共79頁，星期六，2024年，5月作用：分離過程中改變流動(dòng)相的組成

，使所有峰都獲得最佳分離效果，分析時(shí)間縮短?；痉绞剑焊邏禾荻?、低壓梯度。2．梯度洗脫第21頁,共79頁，星期六，2024年，5月高壓梯度：利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。第22頁,共79頁，星期六，2024年，5月低壓梯度

：一臺(tái)高壓泵,通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。如雙元梯度、四元梯度等。第23頁,共79頁，星期六，2024年，5月二、進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣方式：隔膜注射器進(jìn)樣停留進(jìn)樣閥進(jìn)樣自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣第24頁,共79頁，星期六，2024年，5月1．隔膜注射器進(jìn)樣

色譜柱頂端裝一耐壓彈性隔膜，進(jìn)樣時(shí)用微量注射器刺穿隔膜將試樣注入色譜柱。優(yōu)點(diǎn)：裝置簡(jiǎn)單、價(jià)廉、死體積小。缺點(diǎn)：是允許進(jìn)樣量小，重復(fù)性差，只能用于低壓系統(tǒng)(<10MPa,壓力高了，密封墊會(huì)泄漏)。第25頁,共79頁，星期六，2024年，5月2．停留進(jìn)樣

停止流動(dòng)相流動(dòng)后再進(jìn)樣，以防止泄漏，可用于高壓。缺點(diǎn)：重新升壓后會(huì)產(chǎn)生不穩(wěn)，保留時(shí)間和峰形重復(fù)性比較差。第26頁,共79頁，星期六，2024年，5月3．閥進(jìn)樣

結(jié)構(gòu)和作用原理與氣相色譜中所用的六通閥相同。

優(yōu)點(diǎn)：進(jìn)樣準(zhǔn)確，重復(fù)性好，適用于定量分析，更換不同體積的定量管，可調(diào)整進(jìn)樣量。第27頁,共79頁，星期六，2024年，5月第28頁,共79頁，星期六，2024年，5月4．自動(dòng)進(jìn)樣

由計(jì)算機(jī)自動(dòng)控制定量閥，按預(yù)先編制好的程序進(jìn)行進(jìn)樣。優(yōu)點(diǎn)：可自動(dòng)完成幾十或上百個(gè)樣品的分析。在進(jìn)行大量樣品的分析時(shí)，使用自動(dòng)進(jìn)樣器操作可節(jié)省大量人力和時(shí)間。缺點(diǎn)：裝置成本高。第29頁,共79頁，星期六，2024年，5月第30頁,共79頁，星期六，2024年，5月三、色譜柱組成：包括柱管和固定相兩部分。柱管材料通常采用優(yōu)質(zhì)不銹鋼，柱長(zhǎng)一般為5~40cm，內(nèi)徑為1~6mm

。第31頁,共79頁，星期六，2024年，5月

色譜柱的兩端有燒結(jié)不銹鋼或多孔聚四氟乙烯過濾片，以防止柱內(nèi)的填料流出。填充好固定相后的柱子有方向性，在使用時(shí)，應(yīng)使流動(dòng)相的方向與柱子管外箭頭標(biāo)的方向一致。第32頁,共79頁，星期六，2024年，5月四、檢測(cè)器檢測(cè)器類型最高靈敏度（g/mL）溫度影響流速影響用于梯度洗脫紫外光度(UV)選擇性5

10-10低無可以示差折光(RI)通用性5

10-7有無不可熒光(FD)選擇性10-12~10-9低無可以紅外吸收(IR)選擇性~10-7低無可以極譜選擇性10-10~10-9有有困難電導(dǎo)選擇性10-9有有不可質(zhì)譜通用性~10-8無無可以第33頁,共79頁，星期六，2024年，5月1．紫外檢測(cè)器

應(yīng)用最廣：適于約有70％的樣品。

靈敏度高：線性范圍大：死體積?。海?mm×10mm，8μL）；對(duì)流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感。分類：固定波長(zhǎng)型、可調(diào)波長(zhǎng)型和二極管陣列檢測(cè)器。特點(diǎn)：第34頁,共79頁，星期六，2024年，5月固定波長(zhǎng)：254nm或280nm

固定波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器第35頁,共79頁，星期六，2024年，5月可調(diào)波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器第36頁,共79頁，星期六，2024年，5月第37頁,共79頁，星期六，2024年，5月二極管陣列檢測(cè)器第38頁,共79頁，星期六，2024年，5月第39頁,共79頁，星期六，2024年，5月第40頁,共79頁，星期六，2024年，5月2．熒光檢測(cè)器

工作原理：利用某些試樣具有熒光特性進(jìn)行檢測(cè)。特點(diǎn)：高靈敏度、高選擇性；對(duì)多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)；第41頁,共79頁，星期六，2024年，5月第42頁,共79頁，星期六，2024年，5月3．示差折光檢測(cè)器工作原理：折光指數(shù)與組成有關(guān)，連續(xù)檢測(cè)參比池和樣品池中流動(dòng)相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比；特點(diǎn)：通用型檢測(cè)器；靈敏度低、對(duì)溫度敏感、不能用于梯度洗脫。分類：偏轉(zhuǎn)式、反射式和干涉型三種。第43頁,共79頁，星期六，2024年，5月偏轉(zhuǎn)式：它是基于折射率隨介質(zhì)中的成分變化而變化，如入射角不變，則光束的偏轉(zhuǎn)角是流動(dòng)相(介質(zhì))中成分變化的函數(shù)。因此，測(cè)量折射角偏轉(zhuǎn)值的大小，便可得到試樣的濃度。第44頁,共79頁，星期六，2024年，5月第45頁,共79頁，星期六，2024年，5月第二節(jié)液相色譜中的固定相和流動(dòng)相一、液相色譜固定相二、液相色譜流動(dòng)相第46頁,共79頁，星期六，2024年，5月一、液相色譜固定相1．按固相材料的剛性程度分類剛性固體

硅膠：用于液固色譜的固定相，液相色譜的擔(dān)體，化學(xué)鍵合固定相基質(zhì)材料。

硬質(zhì)凝膠聚苯乙烯與二乙烯基苯交聯(lián)而成的多孔顆粒：只應(yīng)用在離子交換色譜和凝膠色譜中。第47頁,共79頁，星期六，2024年，5月2．按固相填料的疏松程度分類薄殼型微珠載體（表面多孔型）構(gòu)成：30～40μm的玻璃微球，表面附著一層厚度為1～2μm的多孔硅膠、多孔氧化鋁或分子篩等，形成殼形結(jié)構(gòu)。特點(diǎn)：①多孔層厚度小、孔淺、柱效高；②分配過程在載體表面進(jìn)行，出峰快；③顆粒大，裝柱容易，適于常規(guī)分析

。第48頁,共79頁，星期六，2024年，5月全多孔型載體

構(gòu)成：硅膠、氟化鋁或硅藻土的微粒凝聚而成多孔球體。特點(diǎn)：顆粒較細(xì)，整個(gè)微粒全部是多孔性物質(zhì)，表面積大，負(fù)荷量大。適合于復(fù)雜混合物分離和痕量分析。第49頁,共79頁，星期六，2024年，5月第50頁,共79頁，星期六，2024年，5月3．化學(xué)健合固定相

通過化學(xué)鍵的方式把有機(jī)分子結(jié)合到載體表面，形成一種新型固定相。它可以避免因機(jī)械涂布固定液，導(dǎo)致在色譜分離中使固定液流失的缺陷。第51頁,共79頁，星期六，2024年，5月化學(xué)鍵合相的載體主要是硅膠（表面有硅醇基）：第52頁,共79頁，星期六，2024年，5月第53頁,共79頁，星期六，2024年，5月第54頁,共79頁，星期六，2024年，5月時(shí)間，min固定相：C1固定相：C8固定相：C18硅膠-烷基鍵合相中烷基鏈長(zhǎng)對(duì)反相色譜分離的影響1-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯反相鍵合色譜中，鍵合相碳鏈越長(zhǎng)，分離效果越好。第55頁,共79頁，星期六，2024年，5月第56頁,共79頁，星期六，2024年，5月化學(xué)鍵合固定相的特點(diǎn)（1）傳質(zhì)快：表面無深凹陷，比一般液體固定相傳質(zhì)快；（2）壽命長(zhǎng)：化學(xué)鍵合，無固定液流失，耐流動(dòng)相沖擊；（3）耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，穩(wěn)定；（4）選擇性好：可鍵合不同官能團(tuán)，提高選擇性；（5）有利于梯度洗脫。第57頁,共79頁，星期六，2024年，5月二、液相色譜流動(dòng)相（1）稱為淋洗液，洗脫劑。流動(dòng)相組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離狀況；（2）親水性固定液常采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。（3）若流動(dòng)相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。1.液相色譜流動(dòng)相的特性第58頁,共79頁，星期六，2024年，5月①合適的溶解力與極性。②化學(xué)穩(wěn)定性要好，與固定相和被測(cè)組分不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。③與檢測(cè)器相匹配。④溶劑的純度要高。一般使用色譜純?cè)噭?。⑤溶劑的流?dòng)性要好，黏度要低。2.流動(dòng)相應(yīng)滿足以下要求第59頁,共79頁，星期六，2024年，5月3.流動(dòng)相類別

按流動(dòng)相組成分：?jiǎn)谓M分和多組分；按極性分：極性、弱極性、非極性；按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。常用溶劑：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、甲醇、乙腈、水。第60頁,共79頁，星期六，2024年，5月第三節(jié)液相色譜法的主要類型

一、液-固吸附色譜二、液-液分配色譜三、離子交換色譜四、離子色譜五、離子對(duì)色譜六、排阻色譜第61頁,共79頁，星期六，2024年，5月一、液-固吸附色譜

固定相：固體吸附劑為，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑；流動(dòng)相：各種不同極性的一元或多元溶劑；

基本原理：組分在固定相吸附劑上吸附與解吸；主要適用范圍：相對(duì)分子量中等的油溶性試樣，對(duì)具有不同官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性；缺點(diǎn)：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾。第62頁,共79頁，星期六，2024年，5月

分離機(jī)制：

各組分與流動(dòng)相分子爭(zhēng)奪吸附劑表面活性中心利用吸附劑對(duì)不同組分的吸附能力差異而實(shí)現(xiàn)分離吸附→解吸→再吸附→再解吸→無數(shù)次洗脫→分開

第63頁,共79頁，星期六，2024年，5月吸附系數(shù)

Ka與組分的性質(zhì)、吸附劑的活性、流動(dòng)相的性質(zhì)及溫度有關(guān)。吸附平衡

Xm+nYa→Xa+nYm

第64頁,共79頁，星期六，2024年，5月二、液-液分配色譜

固定相與流動(dòng)相均為液體（互不相溶）基本原理：組分在固定相和流動(dòng)相上的分配；流動(dòng)相：親水性固定液—疏水性流動(dòng)相疏水性固定液—親水性流動(dòng)相固定相：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用化學(xué)鍵合固定相：將各種不同基團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上。第65頁,共79頁，星期六，2024年，5月正相色譜——固定液極性>流動(dòng)相極性分離順序：極性小的組分先出柱；極性大的組分后出柱。分離對(duì)象：適于分離極性組分反相色譜——固定液極性<流動(dòng)相極性分離順序：極性大的組分先出柱；極性小的組分后出柱。分離順序：適于分離非極性組分第66頁,共79頁，星期六，2024年，5月三、離子交換色譜

固定相：陰離子離子交換樹脂或陽離子離子交換樹脂流動(dòng)相：陰離子離子交換樹脂作固定相—酸性水溶液

陽離子離子交換樹脂作固定相—堿性水溶液基本原理：組分在固定相上發(fā)生反復(fù)離子交換反應(yīng)，基于組分與離子交換劑之間親和力的差異進(jìn)行分離。應(yīng)用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。第67頁,共79頁，星期六，2024年，5月選擇性系數(shù)

注：Ks與離子的電荷數(shù)、水合離子半徑、流動(dòng)相性質(zhì)、離子交換樹脂性質(zhì)以及溫度有關(guān)固定離子可交換離子待測(cè)離子

以陽離子離子交換為例：

RSO3-H++X+→RSO3-X++H+第68頁,共79頁，星期六，2024年，5月第69頁,共79頁，星期六，2024年，5月四、離子色譜

傳統(tǒng)離子交換色譜存在著兩個(gè)難于解決的問題：(1)需要高濃度淋洗液洗脫且洗脫時(shí)間很長(zhǎng)；(2)洗脫后的組分缺乏靈敏、快速的在線檢測(cè)方法。第70頁,共79頁，星期六，2024年，5月1.離子色譜法原理

離子色譜法：以離子交換樹脂為固定相，以電解質(zhì)溶液為流動(dòng)相，用于分離陰陽離子。離子色譜中，應(yīng)用最為廣泛的的檢測(cè)器為電導(dǎo)檢測(cè)器。為消除流動(dòng)相中強(qiáng)電解質(zhì)背景離子對(duì)檢測(cè)器的干擾，常設(shè)置一個(gè)抑制柱，稱為雙柱型離子色譜法或化學(xué)抑制型離子色譜法。第71頁,共79頁，星期六，2024年，5月2.離子色譜法基本裝置離子色譜連續(xù)抑制裝置圖

(以測(cè)定陰離子為例)第72頁,共79頁，星期六，2024年，5月分離分析Br-為例分離柱上發(fā)生離子交換：NaOH洗脫：分離柱上流出Na+

（大量）

、Br-、OH-（大量）抑制柱上發(fā)生離子交換：進(jìn)入檢測(cè)器：H2O、HBr第73頁,共79頁，星期六，2024年，5月

雙柱；薄殼型陰離子交換樹脂分離柱(3×250mm),