PCR實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本管理、生物安全和防污染策略

PCR實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本管理、生物平安和防污染策略

廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科

李友瓊

標(biāo)本采集時(shí)間對(duì)擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果

的影響在疾病開展過程中，標(biāo)本采集過早或過晚都可能會(huì)給出假陰性結(jié)果。

標(biāo)本采集部位的準(zhǔn)備標(biāo)本采集部位的清潔消毒可去掉污染的微生物或其他雜物，但應(yīng)適度，過度清潔消毒有可能會(huì)去掉或破壞靶微生物，故標(biāo)本采集部位的準(zhǔn)備應(yīng)由訓(xùn)練有素的人員進(jìn)行。標(biāo)本的類型和采集量標(biāo)本的類型：血清〔漿〕、分泌物、痰、尿和腦脊液等。標(biāo)本的采集量：應(yīng)根據(jù)所測(cè)病原體而定。一般來(lái)說，如果標(biāo)本的量對(duì)病原體培養(yǎng)夠用的話，那么其量亦足以用于核酸提取及其后的擴(kuò)增檢測(cè)對(duì)于定量檢測(cè)來(lái)說，對(duì)標(biāo)本的收集要求更為精確。采集質(zhì)量的評(píng)價(jià)血清〔漿〕標(biāo)本：溶血、脂血等；分泌物、痰：評(píng)價(jià)評(píng)價(jià)內(nèi)容包括細(xì)胞組成，所需類型細(xì)胞的數(shù)量和核酸總量。評(píng)價(jià)方法：包括肉眼觀察，顯微鏡下觀察和化學(xué)分析等。采樣及運(yùn)輸容器標(biāo)本的采集材料如棉簽應(yīng)為一次性使用；運(yùn)輸容器亦應(yīng)為密閉的一次性裝置；采集所用的防腐劑、抗凝劑及相關(guān)試劑材料不應(yīng)對(duì)核酸擴(kuò)增及檢測(cè)過程造成干擾。標(biāo)本采集中的防污染

采集中要特別注意污染，防止混入操作者的頭發(fā)、表皮細(xì)胞、痰液等；如使用玻璃器皿，必須經(jīng)高溫滅菌，以使用可能存在的RNase失活。標(biāo)本運(yùn)送樣本一經(jīng)采集，那么應(yīng)盡可能快的送至檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室。樣本中如參加適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑，如用于RNA測(cè)定參加GITC的血清〔漿〕樣本和用于DNA測(cè)定的EDTA抗凝血等，那么可在室溫下運(yùn)送過郵寄。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)待測(cè)靶核酸的特性，對(duì)各種臨床樣本的運(yùn)送條件作出相應(yīng)的規(guī)定。

第一節(jié)臨床標(biāo)本的處理和保存一、血清〔漿〕標(biāo)本1.DNA標(biāo)本DNA標(biāo)本的獲取、處理和保存，可按照一本的血清標(biāo)本處理程序即可。2.保存全血樣本用于DNA提取檢測(cè)，可4℃下短期保存如用于RNA檢測(cè)，那么應(yīng)在取血后盡快提取RNA。

容器的使用2.RNA標(biāo)本處理和保存對(duì)于RNA測(cè)定，標(biāo)本的獲取、處理和方式對(duì)測(cè)定結(jié)果有決定性影響。研究說明，用于RNA測(cè)定的血漿標(biāo)本最好是使用EDTA抗凝〔嚴(yán)禁使用肝素，因其對(duì)PCR擴(kuò)增有幾只，且很難在核酸提取過程中完全去除〕，抗凝后6小時(shí)內(nèi)分離血漿保存；如使用血清標(biāo)本，那么需盡快〔2小時(shí)〕別離血清后保存。保存時(shí)間短時(shí)〔1-2周〕可放-20℃下，較長(zhǎng)期時(shí)應(yīng)在-70℃下。二、全血標(biāo)本以全血作為

待測(cè)標(biāo)本時(shí)1.抗凝劑的選擇以全血作為待測(cè)標(biāo)本時(shí)，一般使用EDTA-Na2或枸櫞酸鈉，不可使用肝素。2.保存全血樣本用于DNA提取檢測(cè)，可4℃下短期保存，如用于RNA檢測(cè)，那么應(yīng)在取血后盡快提取RNA。

三、外周血單個(gè)核細(xì)胞外周血單個(gè)核細(xì)胞可從抗凝全血制備，主要有兩條途徑，一是使用淋巴細(xì)胞別離液別離制備；二是使用紅細(xì)胞裂解液，裂解全血中的紅細(xì)胞，經(jīng)生理鹽水?dāng)?shù)次洗滌，即可看到單個(gè)核細(xì)胞。保存外周血單個(gè)核細(xì)胞如暫不提取核酸，可保存于-70℃下。四、痰特點(diǎn)痰屬于分泌物，痰標(biāo)本中含有大量粘蛋白和雜質(zhì)。處理1、如作結(jié)核桿菌DNA測(cè)定標(biāo)本，提取核酸前，需對(duì)標(biāo)本進(jìn)行初步處理，即用1mmol/LNaOH液化。需注意的是，液化時(shí)不能加熱，液化時(shí)間不能過長(zhǎng)。保存液化標(biāo)本如不立即用于核酸提取，可保存于-70℃下。2、如用于非結(jié)核桿菌如肺炎支原體的PCR檢測(cè)，痰標(biāo)本的處理只能室溫懸浮于生理鹽水中，充分震蕩混勻，促使大塊粘狀物下沉，取上清離心，所得到的沉淀物即可用于核酸提取。五、棉拭子使用PCR方法檢測(cè)性疾病病原體時(shí)，臨床標(biāo)本一般為棉拭子，可將棉拭子置于適量生理鹽水中，充分震蕩洗滌后，取上清立即離心，其后的沉淀即可用于DNA提取。保存如不立即用于核酸提取，那么需保存于-70℃下。六、膿液膿液的處理依情況而定。如用于分枝桿菌〔如結(jié)核桿菌〕核酸測(cè)定的標(biāo)本，粘稠的膿液可采用痰標(biāo)本的處理模式，先進(jìn)行液化，再離心取沉淀提取DNA；水樣的膿液那么直接離心，沉淀用于生理鹽水洗2-3次后，即可用于DNA提取。對(duì)于用于非分枝桿菌測(cè)定的膿液標(biāo)本，如過于粘稠，那么參加適量生理鹽水，充分振蕩后，靜置，取上清立即離心，沉淀用于DNA提?。蝗鐬樗畼樱敲窗瓷鲜鲋苯与x心取沉淀即可。保存沉淀標(biāo)本的保存條件同樣為-70℃。七、體液臨床體液標(biāo)本包括胸水，腹水，腦脊液，尿液等，可按水樣標(biāo)本的方式直接離心取沉淀提取核酸。沉淀樣本的保存同上。八、組織組織分新鮮組織塊和石蠟切片。新鮮組織塊的處理步驟首先用生理鹽水洗兩次，然后將其搗碎或切碎，參加生理鹽水后劇烈震蕩混勻，離心，棄上清，再加蛋白酶K消化后提取核酸。保存新鮮組織最好是保存于50%乙醇中，具體作法是，先用生理鹽水將組織洗一次，切成寬度小于1cm的小片，參加適量的生理鹽水，然后，邊搖邊參加無(wú)水乙醇至濃度為50%，這樣固定的組織標(biāo)本室溫下可保存數(shù)日，4℃可保存6年。保存新鮮組織最好是保存于50%乙醇中，具體作法是，先用生理鹽水將組織洗一次，切成寬度小于1cm的小片，參加適量的生理鹽水，然后，邊搖邊參加無(wú)水乙醇至濃度為50%，這樣固定的組織標(biāo)本室溫下可保存數(shù)日，4℃可保存6年。石蠟切片用于核酸提取，需先用辛烷或二甲苯脫蠟，再用蛋白酶K消化后可進(jìn)行DNA提取。小結(jié)1、標(biāo)本的收集及適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，對(duì)用于PCR測(cè)定的核酸模板的成功提取，具有決定性作用。2、要著重強(qiáng)調(diào)的一點(diǎn)是，所有用于上述臨床標(biāo)本收集的容器如試管或離心管，均應(yīng)使用前高壓滅菌。PCR污染與對(duì)策

PCR反映的最大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與較高的靈敏性，但令人頭痛的問題是易污染，機(jī)器微量的污染即可造成假陽(yáng)性的產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)中設(shè)立的陰性對(duì)照可提示有無(wú)假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)。如果一次試驗(yàn)中的幾個(gè)陰性對(duì)照結(jié)果中出現(xiàn)一個(gè)或幾個(gè)陽(yáng)性結(jié)果，提示本次試驗(yàn)中其他標(biāo)本的檢驗(yàn)結(jié)果可能有假陽(yáng)性。造成假陽(yáng)性的原因包括樣品污染擴(kuò)增試劑污染擴(kuò)增產(chǎn)物交叉污染等常見的污染來(lái)源包括實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、加樣器、操作中形成的噴霧、DNA抽提、儀器、試劑及其他與擴(kuò)增產(chǎn)物接觸的物品。PCR污染與對(duì)策

污染的原因來(lái)自其他測(cè)試樣品污染：標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染，或標(biāo)本放置時(shí)，由于密封不嚴(yán)溢出容器外，或容器外貼有標(biāo)本而造成相互間交叉污染；標(biāo)本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染;微生物可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散，導(dǎo)致彼此間的污染。PCR污染與對(duì)策

污染的原因

:來(lái)自實(shí)驗(yàn)材料或者配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染?！斑z留”污染。這是PCR反響中最常見的污染問題。因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量大〔一般為1013拷貝/ml〕，高于PCR檢測(cè)的拷貝極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染，就可以造成假陽(yáng)性。PCR污染與對(duì)策

污染的原因:還有一種容易無(wú)視，最可能造成PCR產(chǎn)物污染的形成是氣溶膠污染，在空氣中與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作是比較劇烈地?fù)u動(dòng)反響管，開蓋時(shí)、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。一個(gè)氣溶膠顆粒可含48000拷貝，因而由其造成的污染是一個(gè)值得特別重視的問題。

PCR污染與對(duì)策

防治污染的方法:

嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)室分區(qū)及其他實(shí)驗(yàn)用品及吸樣槍應(yīng)專用。實(shí)驗(yàn)前實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用紫外線消毒以破壞殘留的DNA或RNA.

吸樣槍：由于操作時(shí)不慎將樣品或模板核酸吸入槍內(nèi)或黏在槍頭上，是一個(gè)嚴(yán)重的污染源，因而加樣或吸取模板核酸時(shí)要十分小心，吸樣要慢，吸樣時(shí)盡量一次性完成，忌屢次抽吸，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。PCR污染與對(duì)策

防治污染的方法:

分裝PCR試劑：所有的PCR試劑都應(yīng)小量分裝，PCR反響液應(yīng)預(yù)先配置好，然后小量分裝，-20℃保存，以減少重復(fù)加樣次數(shù)，防止污染時(shí)機(jī)，另外，PCR試劑，PCR反響液應(yīng)與樣品及PCR產(chǎn)物分開保存，不應(yīng)放于同一冰箱。防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭、離心管應(yīng)一次性使用PCR污染與對(duì)策

防治污染的方法:

每次PCR實(shí)驗(yàn)務(wù)必做陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、陰性對(duì)照它包括①標(biāo)本對(duì)照：被檢的標(biāo)本是血清就用鑒定正常血清作對(duì)照; 被檢的標(biāo)本是組織細(xì)胞就用相應(yīng)的組織細(xì)胞作對(duì)照。②試劑對(duì)照:在PCR試劑中不加模板DNA或RNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以監(jiān)測(cè)試劑是否污染。

選擇質(zhì)量好的Eppendorf管，以防止樣本外溢及外來(lái)核酸的進(jìn)入，翻開離心管前應(yīng)先離心，將管壁及管蓋的液體甩至管底部，開管動(dòng)作要輕，以防管內(nèi)液體濺出。PCR污染原因分析

實(shí)驗(yàn)室污染的檢測(cè)一、

如果陰性對(duì)照標(biāo)本的擴(kuò)增結(jié)果為陽(yáng)性原因：1、實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。2、實(shí)驗(yàn)室操作所致的樣本間的交叉污染，如強(qiáng)陽(yáng)性標(biāo)本氣溶膠加樣器所致的污染、強(qiáng)陽(yáng)性標(biāo)本經(jīng)操作者的手所致的污染、使用翻蓋離心管核酸提取時(shí)在較高溫時(shí)崩開等。3、擴(kuò)增反響試劑的污染。陽(yáng)性結(jié)果說明上述三個(gè)環(huán)節(jié)中有可能在一個(gè)或幾個(gè)環(huán)節(jié)中出了問題。PCR污染原因分析

試劑〔擴(kuò)增反響混合液〕擴(kuò)增的結(jié)果為陽(yáng)性原因：擴(kuò)增試劑發(fā)生污染，如想鑒別試驗(yàn)室是否發(fā)生污染，可將一個(gè)或多個(gè)空管翻開，靜置標(biāo)本制備區(qū)30~60分鐘，然后參加擴(kuò)增反響混合液擴(kuò)增，如為陽(yáng)性，那么說明實(shí)驗(yàn)室以前擴(kuò)增產(chǎn)物的存在，污染了整個(gè)實(shí)驗(yàn)室。試劑〔擴(kuò)增反響混合液〕，用水替代核酸樣本擴(kuò)增，如為陰性，說明試劑質(zhì)量是好。

關(guān)于PCR假陽(yáng)性問題PCR假陽(yáng)性的問題是比較單純的，一般僅涉及污染和引物的非特異性問題。而污染可以通過嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室管理，合理的環(huán)境設(shè)置，以及參加UNG酶抗污染根本可以解決，而引物的非特異性問題根本屬于廠家試劑質(zhì)量問題。PCR的假陰性卻不同，他涉及了PCR實(shí)驗(yàn)的人員和技術(shù)環(huán)節(jié)，十分復(fù)雜。就臨床而言，三大陽(yáng)檢出率低，或PCR檢測(cè)陰性經(jīng)常發(fā)生，可見假陰性問題的嚴(yán)重性。PCR假陰性問題總體來(lái)說有如下因素：

一

儀器因素PCR實(shí)驗(yàn)對(duì)儀器的依賴性是很高，離心機(jī)、擴(kuò)增儀都是造成PCR假陰性的因素。擴(kuò)增儀的主要的影響是孔間差，引起擴(kuò)增失敗或擴(kuò)增效率降低。而離心機(jī)的影響那么更容易被無(wú)視。國(guó)內(nèi)使用離心機(jī)很少使用離心加速度〔XXXg〕作為參考指標(biāo)，由于離心機(jī)的大小不同，有效離心半徑也不相同，因此同樣的轉(zhuǎn)速所產(chǎn)生的離心力相差很大〔有的在數(shù)倍以上〕，造成PCR假陰性。這個(gè)問題在其他實(shí)驗(yàn)也有，但因其他實(shí)驗(yàn)都是測(cè)大分子蛋白沉淀，對(duì)離心的速度要求較低所以不太明顯。建議使用小型臺(tái)式離心機(jī)的實(shí)驗(yàn)要注意這個(gè)問題。

試劑質(zhì)量問題

PCR實(shí)驗(yàn)的成功與否試劑的質(zhì)量至關(guān)重要，試劑的質(zhì)量問題涉及多個(gè)方面：細(xì)胞的裂解；模板的抽提；引物位點(diǎn)的選擇；Tap酶的活性等等。其中任一環(huán)節(jié)出了問題都會(huì)引起結(jié)果的假陰性。這些都是試劑質(zhì)量的問題，因此選用高質(zhì)量的PCR試劑非常重要。核酸模板問題

核酸模版質(zhì)量是制約PCR最重要的因素之一。核酸模板在擴(kuò)增區(qū)出現(xiàn)斷裂、蛋白粘附等模版質(zhì)量問題，都有可能引起擴(kuò)增失敗造成結(jié)果的假陰性或定量不準(zhǔn)確。無(wú)論什么提取方法都不可能得到完全理想化的核酸模板，因此核酸模板質(zhì)量雖然與試劑的質(zhì)量有關(guān)但它不可能由試劑質(zhì)量完全決定。核酸模板問題除了模板本身的問題外，還存在模板溶液中抑制Tap酶活性成分〔如某些蛋白、離子等〕作用，導(dǎo)致擴(kuò)增效率降低甚至擴(kuò)增失敗的問題。操作人員素質(zhì)問題PCR實(shí)驗(yàn)的環(huán)節(jié)很多，而且對(duì)每一環(huán)節(jié)的質(zhì)量要求都很高，例如少加、漏加試劑、離心不充分、循環(huán)參數(shù)設(shè)計(jì)錯(cuò)誤、由于RNA抽提降解、逆轉(zhuǎn)錄失敗等等都能造成結(jié)果的假陰性。因此要求PCR的實(shí)驗(yàn)操作人員有良好的素質(zhì)，能夠嚴(yán)格遵守操作規(guī)那么，并能敏銳的發(fā)現(xiàn)問題和解決問題。生物平安柜的使用生物平安柜biosafetycabinet防止操作過程中含有危害性或未知微生物氣溶膠散逸的空氣凈化平安裝置II級(jí)生物平安柜用于對(duì)人員、受試樣本及環(huán)境進(jìn)行保護(hù)且能滿足生物平安柜危險(xiǎn)度等級(jí)為1、2、3級(jí)的病原體操作的生物平安柜。II級(jí)生物平安柜的前窗開口區(qū)向內(nèi)吸入負(fù)壓氣流用以保護(hù)人員的平安；經(jīng)高效過濾器過濾的垂直氣流用以保護(hù)受試樣本的平安；排出氣流經(jīng)高效過濾器過濾是為了保護(hù)環(huán)境不受污染。生物平安柜知識(shí)簡(jiǎn)介II級(jí)生物平安柜二級(jí)生物平安柜是目前應(yīng)用最為廣泛飛柜型，是有前窗操作口的平安柜，操作者可以通過前窗操作口在平安柜內(nèi)進(jìn)行操作，對(duì)操作過程中的人員、產(chǎn)品及環(huán)境進(jìn)行保護(hù)。生物平安柜的使用與本卷須知正確的使用生物平安柜

應(yīng)遵循以下使用原那么：緩慢移動(dòng)原那么物品平行擺放原那么防止震動(dòng)原那么不同樣品柜內(nèi)移動(dòng)原那么防止明火使用原那么定期進(jìn)行平安柜防護(hù)效果的評(píng)估

生物平安柜操作程序一、制定操作步驟、列出明細(xì)表、準(zhǔn)備好所有材料二、用殺菌肥皂清洗雙手、戴手套；高危險(xiǎn)性操作要穿隔離服，戴兩副手套，手套和工作服可在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)將保護(hù)你不受到操作中生物因子的危害，也可以防止人體所攜帶寄生菌對(duì)平安柜工作區(qū)和實(shí)驗(yàn)樣品的污染。三、如果紫外燈正在工作，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后關(guān)閉紫外燈，將前窗開至工作高度病開啟熒光照明燈。確保平安柜進(jìn)氣和排氣區(qū)域沒有物體阻礙或干擾，開啟平安柜的風(fēng)機(jī)進(jìn)行預(yù)熱5分鐘，這程序可以清楚平安柜工作區(qū)內(nèi)可能經(jīng)空氣傳播的污染物，并有助于穩(wěn)定平安柜的氣流。調(diào)節(jié)工作椅的高度，是你的肩膀和前窗下緣平行，這樣可以確保你的面部在前窗的保護(hù)之下，病有給予你足夠的操作空間。四、使用適當(dāng)?shù)南疽喝?0%的乙醇擦拭工作區(qū)外表包括前方的進(jìn)氣格櫥。選擇適合并有效的消毒劑主要根據(jù)平安柜內(nèi)實(shí)驗(yàn)的微生物種類和實(shí)驗(yàn)內(nèi)容所決定。用消毒劑擦拭實(shí)驗(yàn)用品后再將他們移入平安柜內(nèi)的工作區(qū)域內(nèi)，檢查實(shí)驗(yàn)用品明細(xì)表，確保所有的實(shí)驗(yàn)用品都齊備，實(shí)驗(yàn)操作一旦開始后，在平安柜內(nèi)移入或取出任何物品都是不允許的，請(qǐng)?zhí)貏e注意前方的進(jìn)氣格櫥上不允許堆放任何實(shí)驗(yàn)物品，否那么會(huì)阻礙氣流的進(jìn)入，對(duì)氣流造成干擾會(huì)影響平安柜的性能。

五、平安柜的工作區(qū)域不允許放置過多的物品，平安柜工作區(qū)應(yīng)該劃分為三個(gè)區(qū)：潔凈區(qū)、工作區(qū)、污染區(qū)。這三個(gè)區(qū)域的界定可減少潔凈物接觸污染物品的可能，反之亦然。生物危害性物袋應(yīng)放在污染區(qū)；實(shí)驗(yàn)儀器和樣品應(yīng)放在工作區(qū)；實(shí)驗(yàn)供給