基因工程相關(guān)技術(shù)課件

蘇金生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室E-mail：sujin923@.cn基因工程相關(guān)技術(shù)基因工程相關(guān)技術(shù)疾病相關(guān)基因功能研究體外表達(dá)活性蛋白干細(xì)胞修飾靶向治療研究相互作用分子的研究基因功能研究調(diào)控機(jī)制的研究分子機(jī)制臨床應(yīng)用基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的主要研究?jī)?nèi)容基因工程相關(guān)技術(shù)基因工程相關(guān)技術(shù)重組DNA技術(shù)DNA序列分析的方法PCR技術(shù)外源基因的表達(dá)基因沉默基因工程相關(guān)技術(shù)基因的特征重組DNA技術(shù)—分離單基因基因1基因2基因3剪切人DNA剪切胰島素基因復(fù)制基因1基因2基因3DNA基因工程相關(guān)技術(shù)人DNA片段切割DNA復(fù)制分離+篩選獲得基因復(fù)制轉(zhuǎn)入細(xì)菌分離單細(xì)菌分離單基因策略基因工程相關(guān)技術(shù)Ori染色體DNA染色體DNA細(xì)菌

復(fù)制起始序列(OriginofReplication，Ori)DNA復(fù)制元件

載體DNA

(VectorDNA)重組DNA

(RecombinantDNA)基因工程相關(guān)技術(shù)人DNA載體DNA重組DNA限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶基因工程相關(guān)技術(shù)分重組DNA分子接人DNA載體DNA切接重組DNA技術(shù)的步驟基因工程相關(guān)技術(shù)分重組DNA分子人DNA載體DNA切接重組DNA技術(shù)的步驟轉(zhuǎn)篩轉(zhuǎn)篩分切接轉(zhuǎn)篩基因工程相關(guān)技術(shù)細(xì)菌克隆DNA克隆重組DNA技術(shù)獲取大量相同DNA分子的過(guò)程=基因克隆=DNA克隆基因工程相關(guān)技術(shù)5’---A-G-C-T-A-G-A-A-T-T-C-T-T-A-C-C---3’3’---T-C-G-A-T-C-T-T-A-A-G-A-A-T-G-G---5’限制性核酸內(nèi)切酶（RestrictionEndonuclease）EcoRIenzymeG-A-A-T-T-CC-T-T-A-A-G5’---A-G-C-T-A-G3’---T-C-G-A-T-C-T-T-A-AA-A-T-T-C-T-T-A-C-C---3’G-A-A-T-G-G---5’-OH3’5’P--P5’3’OH-EcoliStrainR#I互補(bǔ)的5’突出末端基因工程相關(guān)技術(shù)限制酶識(shí)別序列特征A5’----3’----TTCGAHin

dIII

A----5’----3’AGCTT5’----CTGCAG3’----G----3’ACGTC----5’Pst

I

5’----AG3’----TCCT----3’GA----5’Alu

I

平末端長(zhǎng)度為4~8bp特征為回文結(jié)構(gòu)粘性末端限制性核酸內(nèi)切酶基因工程相關(guān)技術(shù)細(xì)菌存在限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶細(xì)菌B噬菌體？如何區(qū)分外源DNA與自身DNA？問(wèn)題探討限制性核酸內(nèi)切酶基因工程相關(guān)技術(shù)細(xì)菌限制/修飾體系細(xì)菌基因組噬菌體DNAEcoRI甲基化酶EcoRI核酸酶限制性核酸內(nèi)切酶基因工程相關(guān)技術(shù)匹配的粘性末端可直接連接基因工程相關(guān)技術(shù)同尾酶識(shí)別的序列不同，但能切出相同的粘性末端BamHⅠBglⅡ5’-G

GATC

C-3’3’-C

CTAG

G-5’5’-AGATC

T-3’3’-TCTAG

A-5’XbaI/NheIXhoI/SalI常用同尾酶基因工程相關(guān)技術(shù)同裂酶識(shí)別位點(diǎn)的序列相同的限制性內(nèi)切酶完全同裂酶識(shí)別位點(diǎn)和切點(diǎn)完全相同5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’HindⅢHsuⅠ5’-A

AGCTT-3’3’-TTCGAA-5’5’-C

CCGGG-3’3’-GGGCC

C-5’XmaⅠSmaⅠ

5’-CCC

GGG-3’3’-GGG

CCC-5’不完全同裂酶識(shí)別位點(diǎn)相同，但切點(diǎn)不同基因工程相關(guān)技術(shù)影響限制性內(nèi)切酶反應(yīng)的因素因素解決策略DNA樣品中的污染：蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高鹽濃度增加酶量、增大反應(yīng)體積或延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間酶保存液中的甘油酶的體積限制在總反應(yīng)體積的1/10以內(nèi)基因工程相關(guān)技術(shù)T4DNALigase來(lái)源于T4噬菌體催化粘端或平端雙鏈DNA的5’-磷酸末端和3’-OH末端之間以磷酸二酯鍵結(jié)合

基因工程相關(guān)技術(shù)染色體DNA細(xì)菌Ori載體DNA（VectorDNA）為攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)其無(wú)性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子根據(jù)來(lái)源分類

質(zhì)粒DNA

噬菌體DNA

病毒DNA基因工程相關(guān)技術(shù)質(zhì)粒

DNA存在于細(xì)菌染色體之外的環(huán)狀雙鏈DNA分子，可獨(dú)立自主地進(jìn)行自我復(fù)制可從一個(gè)細(xì)菌轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)菌廣泛存在于原核細(xì)胞，對(duì)宿主的生存不是必需的所攜帶的遺傳信息可賦予宿主一些遺傳性狀，如抗藥性按復(fù)制方式分類：嚴(yán)緊型，1-10拷貝/細(xì)胞;松弛型，10-1000拷貝/細(xì)胞載體DNA基因工程相關(guān)技術(shù)噬菌體DNA是細(xì)菌病毒DNA，有雙鏈（λ噬菌體）和單鏈（M13），可插入的片段大，感染能力強(qiáng)，最適于構(gòu)建基因文庫(kù)載體DNA基因工程相關(guān)技術(shù)病毒DNA根據(jù)宿主細(xì)胞分為：哺乳動(dòng)物病毒：在哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中表達(dá)目的基因昆蟲病毒：在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)目的基因桿狀病毒載體腺病毒載體慢病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體不整合入宿主細(xì)胞的基因組中，順時(shí)表達(dá)目的基因，適用于基因治療整合入宿主細(xì)胞的基因組中，穩(wěn)定表達(dá)目的基因，適用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物載體DNA基因工程相關(guān)技術(shù)抗性基因Ori目的DNA載體DNA克隆載體抗性基因Ori目的DNA啟動(dòng)子序列表達(dá)載體基因工程相關(guān)技術(shù)強(qiáng)啟動(dòng)子序列核糖體結(jié)合序列翻譯起始點(diǎn)標(biāo)簽序列多克隆位點(diǎn)原核表達(dá)載體基因工程相關(guān)技術(shù)真核表達(dá)載體真核啟動(dòng)子多克隆位點(diǎn)真核細(xì)胞篩選標(biāo)記原核細(xì)胞篩選標(biāo)記真核復(fù)制起始子原核復(fù)制起始子真核轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)基因工程相關(guān)技術(shù)載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)能自主復(fù)制具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定有克隆位點(diǎn)（限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)，插入外源DNA），常具有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)分子量小，以容納較大的外源DNA能在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在，有較高的拷貝數(shù)基因工程相關(guān)技術(shù)分重組DNA分子人DNA載體DNA切接重組DNA技術(shù)的步驟轉(zhuǎn)篩分切接轉(zhuǎn)篩基因工程相關(guān)技術(shù)基因組DNA

篩選基因組DNA文庫(kù)胰島素基因生長(zhǎng)激素基因血紅蛋白基因存在于轉(zhuǎn)化細(xì)菌內(nèi)由載體攜帶所有基因組DNA的集合分離目的DNA的方法-1(GenomicDNALibrary)基因工程相關(guān)技術(shù)人胰島素染色體細(xì)菌胰島素基因原核啟動(dòng)子序列真核基因與原核基因的區(qū)別？存在內(nèi)含子序列如何獲取無(wú)內(nèi)含子的基因序列？mRNA反轉(zhuǎn)錄基因工程相關(guān)技術(shù)分離cDNA(ComplementaryDNA)以mRNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成的DNA基因工程相關(guān)技術(shù)篩選

cDNA文庫(kù)特點(diǎn)具有組織細(xì)胞特異性比基因組文庫(kù)小分離目的DNA的方法-2基因工程相關(guān)技術(shù)化學(xué)合成

DNA已知核苷酸序列已知氨基酸序列優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便；并且可以合成自然界不存在的核酸序列缺點(diǎn)：合成長(zhǎng)度有限，一般用于小分子活性多肽基因的合成分離目的DNA的方法-3基因工程相關(guān)技術(shù)

已知DNA獲取---PCR

問(wèn)題：如何在體外大量擴(kuò)增單基因？分離目的DNA的方法-4基因工程相關(guān)技術(shù)引物dNTP模板DNA

耐高溫

DNA聚合酶PCR反應(yīng)要素PCR反應(yīng)過(guò)程變性

(95℃,30s）退火（55℃,30s）延伸（72℃,1min）30循環(huán)分離目的DNA的方法-4基因工程相關(guān)技術(shù)PCR獲取目的基因流程N(yùn)CBI/Genebank序列查詢根據(jù)載體確定限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物(引入酶切位點(diǎn)序列)模板制備PCR擴(kuò)增獲取目的基因分離目的DNA的方法-4基因工程相關(guān)技術(shù)序列查詢基因工程相關(guān)技術(shù)基因工程相關(guān)技術(shù)PCR---“隨心所欲”改造目的基因引入與載體相匹配的酶切位點(diǎn)引物5‘端與模板可以不完全匹配制造點(diǎn)突變引入標(biāo)簽序列分離目的DNA的方法-4基因工程相關(guān)技術(shù)引物設(shè)計(jì)5‘-ctgagatgatcctgattcccagaatgctcttggtgctgttcctgctgctgcctatcttgagttctgcaaactcaggttaagctgatgctcagctgctggagaagagatacgaagaaccgtccctcattccaagaaatccaccttctgctccttcaacaaggcgacgag

tgatgct-3’GC含量50%左右引物長(zhǎng)度18～24bp5’端可引入不匹配的序列，3’端嚴(yán)格匹配上游相同，下游反向互補(bǔ)引物設(shè)計(jì)的通用原則：分離目的DNA的方法-45’CTCGA保護(hù)堿基上游：ctgagatgatcctgattcccag3’酶切位點(diǎn)GGATCC5’CTCGACTCGAGtcactggtcgccttgttgaagg3’下游：引物基因工程相關(guān)技術(shù)95℃95℃50~60℃72℃72℃2min30s30s1min15min30~35cycles模板:100ng水:補(bǔ)至25μL25μL10×PCRbuffer:2.5μL2.5mMdNTP:2μL上下游引物:

2μLDNA聚合酶:1U分離目的DNA的方法-4基因工程相關(guān)技術(shù)瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR結(jié)果降低退火溫度提高退火溫度95℃95℃50~60℃72℃72℃2min30s30s1min15min30~35cycles無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物有非特異擴(kuò)增產(chǎn)物分離目的DNA的方法-4基因工程相關(guān)技術(shù)分重組DNA分子人DNA載體DNA切接重組DNA技術(shù)的步驟轉(zhuǎn)篩分切接轉(zhuǎn)篩基因工程相關(guān)技術(shù)1.載體的選擇和MCS的分析2.分析目的基因內(nèi)的酶切位點(diǎn)酶切策略3.選擇在載體MCS存在、在基因內(nèi)部不存在識(shí)別

序列的限制酶4.最好選用兩種不同的限制性內(nèi)切酶，實(shí)現(xiàn)定向克隆基因工程相關(guān)技術(shù)ATGTAAXbaI

EcoRIPCMVBGHpA啟動(dòng)子序列轉(zhuǎn)錄終止序列多克隆位點(diǎn)定向克隆酶切策略雙酶切時(shí)，若兩種酶的最佳酶切條件不同，可分步酶切，以提高酶切效率，減少載體自連基因工程相關(guān)技術(shù)酶切策略ATGTAAPCMVBGHpA啟動(dòng)子序列轉(zhuǎn)錄終止序列多克隆位點(diǎn)非定向克隆

EcoRI

EcoRI需要鑒定基因的連入方向載體自連的幾率十分高基因工程相關(guān)技術(shù)堿性磷酸酶PPOHOH目的DNA

OH

P5’3’磷酸二酯鍵切除DNA末端磷酸基，防止載體DNA自連3’5’

HO

HO載體DNA酶切策略基因工程相關(guān)技術(shù)酶切DNA的純化瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段的純化基因工程相關(guān)技術(shù)互補(bǔ)的粘性末端平末端目的DNA與載體直接連接---基因工程相關(guān)技術(shù)如何連接不匹配的粘性末端MismatchedStickyEnds不匹配的粘性末端Bluntendandstickyend平端+粘端粘端變平對(duì)于5’粘性末端，利用大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段，在3’端-OH端延伸，補(bǔ)平末端凹陷，轉(zhuǎn)變成平末端。對(duì)于3’粘性末端的片段，利用T4DNA聚合酶的3’→5’外切酶的活性可切去未配對(duì)的序列，變成平末端基因工程相關(guān)技術(shù)修飾末端后連接---加同聚物尾法基因工程相關(guān)技術(shù)PCR產(chǎn)物的直接連接----T/A克隆

TaqDNA聚合酶的末端轉(zhuǎn)移酶活性通常在PCR產(chǎn)物的3’端產(chǎn)生一個(gè)A突出末端含3’-T突出端的載體為商品化的載體基因工程相關(guān)技術(shù)酶切DNA的連接目的基因：載體DNA：T4DNA連接酶：10×緩沖液：6μL2μL1μL1μL4℃或16℃過(guò)夜基因工程相關(guān)技術(shù)分重組DNA分子人DNA載體DNA切接重組DNA技術(shù)的步驟轉(zhuǎn)篩分切接轉(zhuǎn)篩基因工程相關(guān)技術(shù)轉(zhuǎn)化(transformation)

以質(zhì)粒做載體，將攜帶外源基因的重組體導(dǎo)入細(xì)菌的過(guò)程。轉(zhuǎn)染(transfection)

指將重組表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過(guò)程。感染(infection)

病毒DNA做載體時(shí)，若在體外先行包裝成有感染力的病毒顆粒，而后感染受體細(xì)胞的過(guò)程IntroduceRecombinantDNAintoaHostCell基因工程相關(guān)技術(shù)DNA必須避免被宿主核酸酶降解宿主細(xì)胞處于感受態(tài)

SuccessfulTransformationinE.coli感受態(tài)細(xì)胞(competentcell)：經(jīng)一定方法（一般是CaCl2法）處理后具備接受外界DNA能力的大腸桿菌細(xì)胞。限制酶缺陷菌株重組酶缺陷菌株受體菌多為從大腸桿菌K-12改造來(lái)的安全宿主菌。轉(zhuǎn)化基因工程相關(guān)技術(shù)Aftergrowthat37℃for10~15h挑取細(xì)菌克隆進(jìn)行鑒定基因工程相關(guān)技術(shù)基因組DNA胰島素基因生長(zhǎng)激素基因血紅蛋白基因

問(wèn)題：如何篩選含目的基因的克??？基因組DNA文庫(kù)基因工程相關(guān)技術(shù)篩選目的克隆-1豐富培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基問(wèn)題：如何分離精氨酸合成酶的基因？野生型細(xì)菌DNA精氨酸合成酶精氨酸缺陷大腸桿菌標(biāo)志補(bǔ)救精氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷細(xì)菌基本培養(yǎng)基基因工程相關(guān)技術(shù)人基因組DNA文庫(kù)胰島素基因篩選目的克隆-2胰島素部分氨基酸序列硝酸纖維膜復(fù)制核酸分子雜交DNA探針胰島素部分基因序列DNA探針基因工程相關(guān)技術(shù)目的克隆的分析基因組DNA文庫(kù)重組DNA限制酶切分析DNA序列測(cè)定基因工程相關(guān)技術(shù)核苷酸序列測(cè)定每個(gè)反應(yīng)讀取500~1000bp對(duì)獲得的序列進(jìn)行比

對(duì)分析基因工程相關(guān)技術(shù)篩選和分析目的克隆方法抗生素初步篩選區(qū)分轉(zhuǎn)化細(xì)菌和非轉(zhuǎn)化細(xì)菌標(biāo)志補(bǔ)救核酸分子雜交目的克隆分析限制酶切分析

DNA序列測(cè)定依據(jù)基因的特性篩選免疫學(xué)方法基因工程相關(guān)技術(shù)Blast比對(duì)分析基因工程相關(guān)技術(shù)基因工程相關(guān)技術(shù)外源基因的表達(dá)重組DNA原核表達(dá)真核表達(dá)原核表達(dá)系統(tǒng)真核表達(dá)系統(tǒng)：

酵母，昆蟲細(xì)胞，哺乳動(dòng)物細(xì)胞

大腸桿菌優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)量高，操作省時(shí)缺點(diǎn)：表達(dá)真核蛋白缺乏翻譯后修飾表達(dá)產(chǎn)物常形成不溶的包涵體形式優(yōu)點(diǎn)：表達(dá)產(chǎn)物具有天然構(gòu)象和適當(dāng)?shù)姆g后修飾缺點(diǎn)：產(chǎn)量低，生產(chǎn)成本高基因工程相關(guān)技術(shù)原核表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用活性蛋白質(zhì)藥物蛋白結(jié)構(gòu)研究用于X射線晶體衍射和NMR樣品的制備抗原的制備制備抗體基因工程相關(guān)技術(shù)原核表達(dá)載體的選擇考慮表達(dá)量是否需要獲得可溶形式的蛋白選擇標(biāo)簽，確定純化方式常用的原核標(biāo)簽：6個(gè)組氨酸的短肽，GST選用T7噬菌體啟動(dòng)子的表達(dá)系統(tǒng)與高度可溶的多肽聯(lián)合一起表達(dá)，如谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)基因工程相關(guān)技術(shù)融合蛋白（fusionprotein）通過(guò)重組DNA技術(shù)技術(shù)得到的兩個(gè)基因重組后的表達(dá)產(chǎn)物表達(dá)融合蛋白的優(yōu)點(diǎn)：融合蛋白較穩(wěn)定，不易被細(xì)菌的蛋白酶水解利于純化原核部分可利用蛋白酶切掉可產(chǎn)生分泌型產(chǎn)物Tag:

GST,6×His,GFP目的蛋白linker基因工程相關(guān)技術(shù)His-tag融合蛋白的金屬螯合親合層析純化His-tag融合蛋白操作簡(jiǎn)單His-tag對(duì)目的蛋白本身特性幾乎沒有影響，而GST融合蛋白易形成二聚體His-tag非常小，不改變目的蛋白自身的可溶性His-tag非常小，在融合蛋白結(jié)晶后對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)沒有影響。His-tag是蛋白純化的首選標(biāo)簽：基因工程相關(guān)技術(shù)包涵體指細(xì)菌表達(dá)的蛋白在細(xì)胞內(nèi)凝集，形成無(wú)活性的固體顆粒。

重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，由于缺乏真核生物中翻譯后修飾所需酶類，致使中間體大量積累。定義：表達(dá)量越高越容易形成包涵體形成原因：解決策略：變性復(fù)性基因工程相關(guān)技術(shù)真核表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用獲得純化目的蛋白用于治療或結(jié)構(gòu)研究研究該基因在細(xì)胞中的作用和作用機(jī)制中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO）細(xì)胞應(yīng)用最廣泛PichiaPastoris是較常用的酵母表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)

水平可達(dá)12g/L基因工程相關(guān)技術(shù)真核表達(dá)載體真核啟動(dòng)子多克隆位點(diǎn)真核細(xì)胞篩選標(biāo)記原核細(xì)胞篩選標(biāo)記真核復(fù)制起始子原核復(fù)制起始子真核轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)真核表達(dá)載體又稱穿梭載體基因工程相關(guān)技術(shù)重組DNA轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染(transfection)

指將重組表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過(guò)程。轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染(liposometransfection)磷酸鈣共沉淀法(calciumphosphatetransfection)電穿孔法(electroporation)常用的轉(zhuǎn)染方法：基因工程相關(guān)技術(shù)脂類包埋DNA，通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單、毒性低和包裝容量大，目前有多種商品

化試劑盒缺點(diǎn)：試劑相對(duì)比較昂貴?；蚬こ滔嚓P(guān)技術(shù)HEPES緩沖鹽水與含有CaCl2和DNA的溶液緩慢混合，會(huì)形成含磷酸鈣和DNA的沉淀，粘附于細(xì)胞表面，通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。磷酸鈣沉淀法優(yōu)點(diǎn)：不需要昂貴的儀器和試劑缺點(diǎn)