基因工程的基本操作程序（教學(xué)課件）高二下學(xué)期生物人教版（2019）選擇性必修3

3.2基因工程的基本操作程序1.轉(zhuǎn)化指目的基因進入受體細胞內(nèi)，并在受體細胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達的過程，此處“轉(zhuǎn)化”與肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實驗中的“轉(zhuǎn)化”含義相同，實質(zhì)都是基因重組。2.轉(zhuǎn)化的受體細胞受體細胞將目的基因?qū)胫参锛毎麑⒛康幕驅(qū)雱游锛毎麑⒛康幕驅(qū)胛⑸锛毎r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法花粉管通道法——顯微注射法——Ca2+處理法03將目的基因?qū)胧荏w細胞①用______________將________________________直接注入_______中。微量注射器含目的基因的DNA溶液子房②在植物受粉后的一定時間內(nèi)，剪去______，將____________滴加在_________上，使目的基因借助________________進入_______。柱頭DNA溶液花柱切面花粉管通道胚囊子房花粉柱頭花粉管精子卵細胞胚囊（1）將目的基因?qū)胫参锛毎?-花粉管通道法我國科學(xué)家獨創(chuàng)的將Bt基因?qū)朊藁毎姆椒ɑǚ酃芡ǖ婪ㄊ俏覈茖W(xué)家周光宇在1987年獨創(chuàng)的。將重組DNA滴加到植物受粉后形成的花粉管通道內(nèi)，進入卵細胞、合子或早期胚胎細胞中。此方法直接、簡便且經(jīng)濟，已應(yīng)用于水稻、小麥、棉花、大豆等多種植物中。03將目的基因?qū)胧荏w細胞冠癭瘤農(nóng)桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數(shù)雙子葉植物和裸子植物的受傷部位，并誘導(dǎo)產(chǎn)生冠癭瘤等。（1）將目的基因?qū)胫参锛毎r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法03將目的基因?qū)胧荏w細胞②農(nóng)桿菌特點：a.能在自然條件下侵染_____________和___________，而對大多數(shù)____________沒有侵染能力。雙子葉植物裸子植物單子葉植物b.農(nóng)桿菌細胞內(nèi)含有______，當它侵染植物細胞后，能將______上的______（____________）轉(zhuǎn)移到被侵染的細胞，并且將其________________________Ti質(zhì)粒Ti質(zhì)粒T-DNA可轉(zhuǎn)移的DNA整合到該細胞的染色體DNA上將目的基因插入__________________中，通過農(nóng)桿菌的________作用，就可以使目的基因__________________并整合到受體細胞的染色體DNA上，使目的基因能夠維持穩(wěn)定和表達。③利用農(nóng)桿菌進行轉(zhuǎn)化的思路：Ti質(zhì)粒的T-DNA轉(zhuǎn)化進入植物細胞（1）將目的基因?qū)胫参锛毎?-農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法隨著轉(zhuǎn)化方法的突破，農(nóng)桿菌侵染水稻、玉米等多種單子葉植物也取得了成功。載體：農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒（T-DNA)03將目的基因?qū)胧荏w細胞閱讀P81資料卡，完成以下填空表現(xiàn)出新性狀的植株植物組織培養(yǎng)第一次導(dǎo)入第二次導(dǎo)入第一次拼接第二次拼接將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上。(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA被拼接到受體細胞的染色體DNA上。(非人工操作)含目的基因的T-DNA導(dǎo)入受體細胞。將含目的基因的Ti質(zhì)粒重新導(dǎo)入農(nóng)桿菌。Ti質(zhì)粒T—DNA目的基因構(gòu)建基因表達載體重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法示意圖轉(zhuǎn)化的具體方法：a.可以將新鮮的從葉片上取下的圓形小片__________________，然后________________，并_____________。受體細胞為_______與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)篩選轉(zhuǎn)化細胞再生成植株體細胞b.可以將_______直接浸沒在___________________中一段時間，然后培養(yǎng)植株并獲得_______，再進行________、_________等。受體細胞為_______花序含有農(nóng)桿菌的溶液種子篩選鑒定受精卵（1）將目的基因?qū)胫参锛毎?-農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法03將目的基因?qū)胧荏w細胞03將目的基因?qū)胧荏w細胞操作程序：（2）將目的基因?qū)雱游锛毎?-顯微注射法構(gòu)建基因表達載體并提純利用顯微注射將基因表達載體注入動物的受精卵中早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植（移植到同期發(fā)情的母畜子宮內(nèi)）獲得具有新性狀的動物03將目的基因?qū)胧荏w細胞拓展：【其他方法】科學(xué)家也用病毒DNA

與目的基因一起構(gòu)建的載體，去感染受體動物細胞，也能使目的基因?qū)雱游锛毎麅?nèi)。如慢病毒載體、腺病毒載體等。（2）將目的基因?qū)雱游锛毎?3將目的基因?qū)胧荏w細胞選講（3）將目的基因?qū)胛⑸锛毎?---Ca2+處理法過程Ca2+處理細胞感受態(tài)細胞(細胞膜通透性增強)表達載體與感受態(tài)細胞混合感受態(tài)細胞吸收DNA分子03將目的基因?qū)胧荏w細胞Ca2+的作用：使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)（感受態(tài)細胞）。種類項目植物細胞動物細胞微生物細胞常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射法Ca2＋處理法受體細胞體細胞受精卵原核細胞轉(zhuǎn)化過程目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上→導(dǎo)入植物細胞→整合到受體細胞DNA中→表達目的基因表達載體提純→取受精卵→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動物Ca2＋處理細胞→感受態(tài)細胞→表達載體與感受態(tài)細胞混合→感受態(tài)細胞吸DNA分子【小結(jié)】03將目的基因?qū)胧荏w細胞成熟mRNA相應(yīng)酶去除內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄翻譯真核基因：編碼區(qū)（外顯子+內(nèi)含子）多肽鏈前體mRNA蛋白質(zhì)加工如果把一個真核生物的基因?qū)朐思毎斜磉_，一定會產(chǎn)生原來的蛋白質(zhì)嗎？提示：一般不能產(chǎn)生原來的蛋白質(zhì)原因：①原核生物細胞里沒有相應(yīng)的酶來去除內(nèi)含子；②原核生物沒有真核的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)（如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等）03將目的基因?qū)胧荏w細胞選講將基因表達載體導(dǎo)入受體細胞后，如何判斷導(dǎo)入是否成功？即使導(dǎo)入成功，如何判斷目的基因是否可以正常表達？檢查目的基因進入受體細胞后，是否穩(wěn)定維持和表達其遺傳特性。思考你認為可以從哪些方面/水平進行檢測？（1）檢測目的基因是否已經(jīng)導(dǎo)入（檢測DNA）（2）檢測目的基因是否已經(jīng)轉(zhuǎn)錄（檢測mRNA）（3）檢測目的基因是否已經(jīng)表達（檢測蛋白質(zhì)）（4）檢測目的基因是否已經(jīng)發(fā)揮作用（檢測個體是否獲得某種特性）04目的基因的檢測與鑒定檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體DNA上是否插入了目的基因檢測方法：利用PCR對目的基因擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定檢測內(nèi)容及方法----分子水平檢測04目的基因的檢測與鑒定例：提取棉花細胞DNA用與Bt基因相關(guān)的引物進行PCR擴增對擴增產(chǎn)物進行檢測①制作基因探針；②提取受體細胞全部DNA并用PCR擴增，與基因探針置于同一培養(yǎng)液；③高溫變性處理，使之全部變?yōu)閱捂?，觀察是否出現(xiàn)雜交DNA片段。探針與受體中的DNA分子雜交出現(xiàn)雜交帶：不出現(xiàn)雜交帶：已插入未插入或PCR擴增后用DNA分子雜交技術(shù)檢測DNA分子雜交技術(shù)：

DNA分子雜交技術(shù)原理（基因探針）變性1、提取目的基因的DNA片段用放射性同位素標記或熒光標記，作為基因探針；2、提取受體細胞全部DNA并用PCR擴增，與基因探針置于同一培養(yǎng)液；3、高溫變性處理，使之全部變?yōu)閱捂?，觀察是否出現(xiàn)雜交DNA片段。若出現(xiàn)雜交帶，則導(dǎo)入成功。04RT-PCR2.檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA檢測內(nèi)容及方法----分子水平檢測04目的基因的檢測與鑒定檢測方法：PCR擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測或分子雜交技術(shù)檢測瓊脂糖凝膠電泳過程:提取生物材料RNA逆轉(zhuǎn)錄成DNA后檢測是否有目的基因。RNA分子雜交技術(shù)1、制作基因探針；2、探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明轉(zhuǎn)錄出了mRNA。變性探針15N15N轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交分子（可檢測）原理：堿基互補配對原則3.檢測目的基因是否翻譯——通過抗原-抗體雜交檢測從轉(zhuǎn)基因生物提取出來的蛋白質(zhì)和相應(yīng)的抗體進行雜交，如果出現(xiàn)雜交帶，說明目的基因已經(jīng)翻譯。蘇云金芽孢桿菌提取Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)抗體標記抗體提取蛋白抗原抗體雜交脫分化04目的基因的檢測與鑒定檢測目的基因是否表現(xiàn)出相應(yīng)的性狀檢測抗蟲棉是否具有抗蟲性狀采摘抗蟲棉葉片飼喂棉鈴蟲觀察棉鈴蟲存活情況04目的基因的檢測與鑒定檢測內(nèi)容及方法----個體水平鑒定轉(zhuǎn)基因生物鑒定方法成功標志抗蟲植物抗病毒（菌）植物抗鹽植物抗除草劑植物獲取目的基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因生物飼喂害蟲（抗蟲接種實驗）害蟲死亡病毒（菌）接種實驗未染病鹽水澆灌正常生長噴灑除草劑正常生長提取細胞產(chǎn)物與天然產(chǎn)品進行功能活性比較功能、活性正?？瓜x鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等檢測內(nèi)容及方法----個體水平鑒定04目的基因的檢測與鑒定類型步驟檢測內(nèi)容方法分子水平檢測第一步轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因PCR或DNA分子雜交技術(shù)第二步目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNAPCR或分子雜交技術(shù)第三步目的基因是否翻譯形成蛋白質(zhì)抗原-抗體雜交技術(shù)個體水平鑒定抗蟲或抗病的接種實驗抗性以及抗性程度

抗性檢測，基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的功能活性比較

功能活性。檢測內(nèi)容及方法總結(jié):03目的基因的檢測與鑒定04目的基因的檢測與鑒定基因工程的基本操作程序目的基因的篩選與獲取基因表達載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細胞目的基因的檢測與鑒定前提核心關(guān)鍵保證利用PCR獲取和擴增目的基因、啟動子、終止子、標記基因農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(植物)、顯微注射法(動物)、感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化法(微生物);分子檢測：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯個體水平：是否具有抗性以及抗性強度等。第一步第二步第三步第四步半期復(fù)習(xí)周末完成3-2大書1.在實際種植過程中，棉鈴蟲是否對轉(zhuǎn)Bt基因的抗蟲棉產(chǎn)生了嚴重的抗性？證據(jù)是什么？

科研人員對長江流域種植的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉進行了監(jiān)測，2011年的數(shù)據(jù)顯示，大部分轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種的抗蟲性屬于中抗及高抗水平。2013年的數(shù)據(jù)表明，如果棉田周圍存在大量天然庇護所，靶標害蟲棉鈴蟲、紅鈴蟲等并未對轉(zhuǎn)Bt基因的抗蟲棉產(chǎn)生明顯抗性。在我國、澳大利亞、印度等國的多個實驗室中，通過毒素的連續(xù)抗性篩選，已經(jīng)培育出多個高抗水平的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種。

到社會中去2.科研工作者在沒有發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲出現(xiàn)抗性之前，就應(yīng)該想辦法應(yīng)對。他們想出的延緩棉鈴蟲對Bt抗蟲蛋白產(chǎn)生抗性的措施有哪些？這些措施的原理是什么？有效嗎？

科研人員想出的延緩棉鈴蟲對Bt抗蟲蛋白產(chǎn)生抗性的措施有很多，主要可以分為以下幾個方面。（1）基因策略。該策略是在分子水平上提高轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的抗蟲性和抗蟲持久性。包括在棉花中轉(zhuǎn)入多個殺蟲基因、構(gòu)建組織特異性表達的啟動子、提高殺蟲基因的表達量等。（2）田間策略。這是在種植時采取的措施，如提供庇護所、與其他作物（非抗品種）輪作或套種等。（3）國家宏觀調(diào)控策略。該策略包括實施分區(qū)種植管理、加強抗性監(jiān)測、進行嚴格的安全生評價等。

到社會中去【例5】用PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因植株是否成功導(dǎo)入目的基因時，得到以下電泳圖譜，其中1號為DNA標準樣液(Marker)，10號為蒸餾水。PCR時加入的模板DNA如圖所示。據(jù)此做出分析不合理的是(

)A.PCR產(chǎn)物的分子大小在250至500bp之間B.3號樣品為不含目的基因的載體DNAC.9號樣品對應(yīng)植株不是所需的轉(zhuǎn)基因植株D.10號的電泳結(jié)果能確定反應(yīng)體系等對實驗結(jié)果沒有干擾B選講【例6】下圖為轉(zhuǎn)基因抗凍番茄培育過程的示意圖（其中ampr為抗氨芐青霉素基因）。下列敘述錯誤的是（）A．④過程中可利用目的基因作為探針對植株進行篩選B．可同時選用限制酶PstI、SmaI對含目的基因的DNA進行剪切C．過程②可采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將含目的基因的表達載體導(dǎo)入受體細胞D．質(zhì)粒上的抗性基因有利于篩選含目的基因的細胞和促進目的基因的表達D選講【例7】通過引物設(shè)計運用PCR技術(shù)可以實現(xiàn)目的基因的定點突變.圖1為基因工程中獲取突變基因的過程，其中引物1序列中含有一個堿基T不能與目的基因片段配對，但不影響引物與模板鏈的整體配對，反應(yīng)體系中引物1和引物2的5'端分別設(shè)計增加限制性內(nèi)切酶a和限制性內(nèi)切酶b的識別位點.有關(guān)敘述正確的是（

）A.兩種引物中設(shè)計兩種限制酶識別位點有利于目的基因的定向插入B.在PCR反應(yīng)體系中還需要加入4種游離核糖核苷酸、解旋酶、Taq酶、ATP等C.第2輪PCR，引物1與圖中②結(jié)合并且形成兩條鏈等長的突變基因D.在第3輪PCR結(jié)束后，含突變堿基對且兩條鏈等長的DNA占1/8A選講【例9】實時熒光RT-PCR可用于RNA病毒的核酸檢測，其原理是∶在PCR復(fù)性過程中探針和引物一起與模板結(jié)合，探針兩側(cè)分別帶有熒光基團和抑制熒光發(fā)出的淬滅基團，新鏈延伸過程中，DNA聚合酶會破壞探針，導(dǎo)致熒光基團與淬滅基團分離而發(fā)出熒光。利用RT-PCR進行核酸檢測的相關(guān)過程如圖所示。下列說法錯誤的是（

）A．做RT-PCR之前，需要先根據(jù)cDNA的核苷酸序列合成引物和探針B．RNA不能作為PCR擴增的模板，故需要將樣本中的RNA反轉(zhuǎn)錄為DNA后再進行擴增C．若檢測結(jié)果有強烈熒光信號發(fā)出，說明被檢測者沒有感染病毒D．病毒的檢測還可以