基因工程復習資料

第一章緒論1.基因工程的定義：在體外對不同生物的遺傳物質(zhì)(基因)進行剪切、重組、連接，然后插入到載體分子中(細菌質(zhì)粒、病毒或噬菌體DNA),轉(zhuǎn)入微生物、植物或動物細胞內(nèi)進行無(1)目的基因的獲取：從復雜的生物基因組中，經(jīng)過酶切消化或PCR擴增等步驟，分離出(2)重組體的制備：將目的基因的DNA片斷插入到能自我復制并帶有選擇性標記(抗菌素抗性)的載體分子上。(3)重組體的轉(zhuǎn)化：將重組體(載體)轉(zhuǎn)入適當?shù)氖荏w細胞中。(4)克隆鑒定：挑選轉(zhuǎn)化成功的細胞克隆(含有目的基因)。(5)目的基因表達：使導入寄主細胞的目的基因表達出我們所需要的基因產(chǎn)物。(1)基因工程在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應用：提高植物的光合作用率；提高豆科植物的固氮效率；(2)基因工程在工業(yè)中的應用：1)纖維素的開發(fā)利用：克隆各種參與纖維素降解的酶的基因，導入釀酒酵母，就可能利用2)釀酒工業(yè)：用外源基因改造釀酒酵母，產(chǎn)生優(yōu)質(zhì)的啤酒?；蛴冕劸平湍干a(chǎn)蛋白質(zhì)等。(4)基因工程在環(huán)境保護中的作用：1)檢測水污染：用重組細菌或轉(zhuǎn)基因魚等檢測水污染(5)基因工程商業(yè)化的發(fā)展第二章基因工程主要技術原理1.質(zhì)粒和基因組DNA的提取方法與純化步驟，主要試劑2)破膜：溶液IⅡ(0.2NNaOH1.0%SDS)3)中和：溶液Ⅲ(3M醋酸鈉pH4.8)4)離心5)轉(zhuǎn)移：將上清轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中7)沉淀：用0.6倍體積的異戊醇或2倍體積的乙醇(可以加入1/10體積的3M醋酸銨輔助沉淀)細胞裂解(10%SDS和蛋白酶K。SDS是陰離子型去垢劑(detergent),可以使細胞膜崩解。)—>沉淀DNA(0.6倍體積的異丙醇或2倍乙醇(可以加入1/10體積的3M醋酸氨輔助沉淀))松散后直接使用。)—>細胞裂解(0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50℃溫育。)—>(用2倍體積的無水乙醇或0.6倍體積的異丙醇。(加入1/10體積的3M醋酸氨可以輔助沉組織粉碎(用液氮冷凍后研磨成細粉末。)—>細胞裂解(用2%CTAB/2-ME(十六烷基三甲基溴化銨2巰基乙醇)或1%SDS和蛋白酶K。65℃溫育。)—>沉淀DNA(用0.6倍體積的異丙醇(-20℃)。(可以加入1/10體積的3M醋酸氨輔助沉淀))處有特異的紫外吸收峰,對于純DNA:OD260/OD280=1.8,若低于1.8說明有蛋白質(zhì)雜質(zhì)(2)瓊脂糖凝膠電泳估計溴化乙錠(EB)能插入DNA分子中。與已核酸分子中的磷酸基團是離子化的，所以，DNA和RNA實際上呈多聚陰離子狀態(tài)聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體(Acrylamide)和交聯(lián)劑N2,N2甲叉雙丙烯酰胺(N2,N2-菌落/噬菌斑原位雜交：直接將菌落(噬菌斑)原位轉(zhuǎn)移到固組織/細胞原位雜交：用標記的已知核酸序列為探針，使其與細PCR技術的基本原理：類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的④靶基因的特異性與保守性。·引物內(nèi)部不能有大于3bp的反向·ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤對策：重新準備模板；更換酶并避免反復凍原因：引物設計不合適；靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關；酶的質(zhì)和量，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增對策：重新設計引物，降低引物量；適當提高退火溫度，減少循環(huán)次數(shù)；減低酶量或調(diào)換減少循環(huán)次數(shù)。RT-PCR:RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈式擴增(PCR)相結合的技術。中全部表達的mRNA,通過PCR擴增的方法，轉(zhuǎn)換成cDNA雙鏈，再利用變性聚丙烯酰胺凝8.RACE原理及應用9.Sanger雙脫氧鏈終止鏈。該酶能夠用2‘,3’-雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)作底物并將其聚合到新生寡核苷酸鏈DNA有少至1個堿基的差異時，其Tm值的改變影響到雜交時的熒光信號值，從而可11.酵母雙雜交系統(tǒng)原理、應用單獨的AD也不能激活UAS的下游基因，它們之間只有通過某種方式結合在一應用：1)已知蛋白之間相互作用的檢測：2)蛋白質(zhì)的功能域研究：通過對其中某一個蛋白質(zhì)作缺失或定點突變，再用此系統(tǒng)第三章基因工程的酶學基礎限制性核酸內(nèi)切酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探針標記2.核酸內(nèi)切限制酶種類使用時的注意事項I型限制性內(nèi)切酶切割位點：在距離特異性識別位點約1000-1500bp處隨即切開一條單鏈。Ⅱ型限制性內(nèi)切酶識別位點序列：未甲基化修飾的雙鏈DNA上的特殊靶序列(多數(shù)是回文序列),與DNA來源切割位點：就是識別位點處。切開雙鏈DNA,形成粘性末端(stickyend)或平(齊)末端 (bluntend)。粘性末端分為5’端凸出(如EcoRI切點)和3’端凸出(如PstI切點)。并且識別順序往往超過6個堿基對。)Ⅲ型限制性內(nèi)切酶噬菌體所感染，而其自身的DNA由于被一種特殊的酶所修飾(甲基化)而得以保護，這種a.取少量酶(方法or稀釋)b.最后加酶、盡快操作c.減少反應體積d.反應時間的延長e.分裝(對于多個反應)大多數(shù)為37℃;一部分為50-65℃少數(shù)25-30℃;高溫作用酶于37℃時活性多數(shù)10-50%EDTA終10mM;加熱(37℃酶65℃20min,otherwise80℃20min)6.星活性、引起星活性的因素改變的特殊性稱星活性。(非特異性切割)①高濃度甘油(>5%)②酶過量(>100U/μg)③低離子強度(<25mM)PMSO(二甲基亞砜)、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺(dimethylacetamide)、二甲基甲酰胺⑥用其它二價陽離子代替Mg2+①大腸桿菌連接酶：粘性末端，平末端(效率低)③需要能量：動物或噬菌體中是ATP,大腸桿菌中是NAD+。3~10倍，增加插入片段與載體的接觸機會，減少載體自我連接的現(xiàn)象。平末端DNA分子的連接反應中，最適1～2個單位。粘性末端DNA片斷之間的連接，酶濃度0.1個單位。8.粘性末端DNA片段的連接、平末端DNA片段的連接方法；粘性末端DNA片段的連接：待連接的兩個DNA片段的末端如果是用同一種平末端DNA片段的連接：待連接的兩個DNA片段的末端如果是用同一種限制性核酸內(nèi)切酶具平末端的DNA片段之間連接反應的操作過程基本上同具粘性末端DNA片段之間連接的操作過程，但是一般只用T4DNA連接酶，且需要加大酶用量。·加大連接酶用量(10倍大于粘性末端的連接)加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機會加入10%PEG8000,促進大分子之間的有效作用大腸桿菌DNA聚合酶I:性質(zhì)①條單鏈多肽(109kDa)性質(zhì)：⑩NA聚合酶1的酶解片段性質(zhì)①來源：T4噬菌體感染的大腸桿菌細胞114kD(降解單鏈更快)用途賬模板的引物延伸高了3倍。用途：合成cDNA:以oligodT為引物(在74°C復制DNA,在95°C的半衰期為40分鐘。TaqDNA聚合酶在鎂離子存在的條件下①需要3'-OH用于：在3'末端添加同聚物，形成粘性末端，用于DNA連接·如果ATP的γ磷酸帶有2p標記，就會被轉(zhuǎn)移到DNA的5'端。(1)細菌性堿性磷酸酶Bacterialalkalinephosphatase,(2)小牛腸堿性磷酸酶Calfintestinalalkaline包括單鏈DNA外切酶,雙鏈核酸外切酶(1)核酸外切酶Ⅲ:在DNA雙鏈的末端產(chǎn)生出單鏈區(qū)域(1)定位RNA(2)用mRNA測定基因中的(3)降解限制酶切形成的單鏈突出端(4)切掉雙鏈核酸中的單鏈區(qū)C.綠豆核酸酶切口平移標記，在dsDNA上隨機產(chǎn)生切口；在閉環(huán)DNA上引入單切口以使分子截短(在亞硫酸氧鹽介導的誘變前);建立隨機克隆，以便安插在M13phage上測序分析；蛋白：DNA復合物(DNA酶足跡法);除去RNA樣品中的DNA(RNase-free)于體外轉(zhuǎn)錄(合成)與外源DNA同源的RNA,·從而用作雜交探針，體外翻譯系統(tǒng)中的mR第四章基因克隆的載體2.理想載體至少必備的條件①能在宿主細胞中自主復制②容易進入宿主細胞③容易插入外來核酸片段④容易從宿主細胞中分離純化，便于重組操作⑤具有合適的篩選標記⑥具有針對受體細胞的親緣性或親和性(可轉(zhuǎn)移性)(1)自主復制性：攜帶有自己的復制起始區(qū)(ori)它能獨立于宿主細胞的染色體DNA而(2)生物不相容性(Incompatibility):有時不同的質(zhì)?？赏瑫r共存在于一個細菌內(nèi)，但同群質(zhì)粒(不同的，但親緣性高)不能共存于同一細胞，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性。(3)可轉(zhuǎn)移性部分質(zhì)粒含有tra基因，指令宿主細胞產(chǎn)生菌毛，合成細胞表面物質(zhì)，促(4)穩(wěn)定性質(zhì)粒在宿主細胞中保持著一定的拷貝數(shù)。(5)寄生性質(zhì)粒只能在宿主的細胞內(nèi)復制(6)表現(xiàn)型不同的質(zhì)粒有不同的表型，如對抗生素的抗性等(7)可擴增性(8)攜帶特殊的遺傳標記野生型的質(zhì)粒DNA上往往攜帶一個或多個遺傳標記基因，這使6.質(zhì)粒類型(1)按轉(zhuǎn)移性分接合型質(zhì)粒能在天然條件下自發(fā)地從一個細胞轉(zhuǎn)移到另一個細胞(接合作用),如F、(2)按復制機理分：嚴緊控制型質(zhì)粒，松弛控制型質(zhì)粒。嚴緊型質(zhì)粒的復制受到宿主細胞蛋白質(zhì)合成的嚴格控制，復制隨細菌染色體的復制同步進(3)按功能分：F質(zhì)粒、R質(zhì)粒、Col(colicin)質(zhì)粒(可產(chǎn)生大腸桿菌素)、Ent質(zhì)粒(可產(chǎn)生腸毒素)。(1)加入合適的選擇標記基因，通常是抗生素基因。(2)增加或減少合適的酶切位點，便于重組。(3)縮短長度，切去不必要的片段，增加裝載量。(4)改變復制子，由嚴緊變?yōu)樗沙谛?，以增加拷貝?shù)。內(nèi)含一個(Ori)、一個抗氨芐青霉素(A藍白斑篩選的原理：受體菌lacz突變：缺失α肽。載體lacz'的α互補：質(zhì)粒載體上的lacz'編碼α肽，與這個缺失突變的β-半乳糖苷酶“互補”,使它能形成4聚體，又能分解Xgal,8.單鏈DNA噬菌體的特點9.M13系列載體的優(yōu)點(1)有MCS,便于克隆不同的酶切片段(4)克隆能力大(5)可以克隆雙鏈DNA分子中的每一條鏈。子代M13噬菌體中包含的是單連+DNA。(1)MCS的中部已經(jīng)被切開，各有一個3'端突出的T。(3)克隆的PCR產(chǎn)物能被兩側(cè)的EcoRI切下來回收。(4)含有G418抗性，可在真核生物中表達。(1)λ噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體(3)λ-DNA為線狀雙鏈DNA分子，全長48502個核苷酸，兩端各有一個12核苷酸的互補(4)λ-DNA上至少有61個基因，左邊是外殼蛋白的基因，右邊是負責裂解宿主細胞、DNA(1)插入型載體：插入位點位于載體合成活性阻遏物區(qū)域(cl基因)內(nèi)。插入型載體長·用于體外包裝的蛋白質(zhì)可直接從感染了λ噬污染后，均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒，這也是基于安12.粘粒即cos質(zhì)粒的生物學性質(zhì)45kb(最少不能低于30kb)。酵母系統(tǒng)的選擇標記；大腸桿菌的復制子；大腸桿菌的選擇標記；YAC載體的裝載量為細菌人造染色體通常是在大腸桿菌性因子F質(zhì)粒的基礎上構建的，包括大腸桿菌的復制子，14.動物病毒載體(反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒)特點(1)屬于正鏈RNA病毒，顯著的特點是具有2倍體基因組。(2)病毒RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生雙鏈DNA分子，可整合到染色體DNA上成為原病毒，隨染色(1)可將DNA插入宿主基因組的隨機位點上。(2)侵染范圍廣、感染率高，幾乎大100%。(4)包裝的外源DNA可達10Kb?！す餐攸c是都帶有倒置的末端重復序列(ITR),在病毒的復制過程中起非常重要的作用(1)比較安全，無致病、致癌、致畸作用。(2)宿主范圍廣，不僅能感染有分裂能力的細胞，也能感染不能分裂的細胞(如神經(jīng)細胞(3)可以在呼吸道和腸道中繁殖，可以通過口服或噴霧的方式感染。(4)載體中的插入片斷可達7.5kb(有包裝容量限制)。(5)腺病毒容易制備、純化。(6)基因組結構和功能了解得清楚?；虼虬休d體中含有抗G418的基因，胸腺激酶基因(tk1&tk2),TK能把9-鳥嘌呤轉(zhuǎn)化成有毒的化合物，從而殺死宿主細胞。在載體整第五章目的基因的克隆與基因文庫的構建將目的基因的一條鏈分成若干40-50堿基的片斷，另一條設計成與之交錯互補的根據(jù)目的基因的全序列，分別合成40-50堿基長的單鏈DNA片段，拼接模塊數(shù)大幅度減少，(1)目的基因的直接克隆(2)通過RT-PCR進行cDNA的克隆適合擴增真核生物基因(原核生物不易得到mRNA,也不含有polyA尾)。(3)制備DNA探針，進行分子檢測等。mRNA差異顯示PCR:(2)5'端的隨即引物：10個核苷酸，擴增第二鏈。(3)隨機引物與錨定引物成對擴增實驗結果：在測序膠上，每組擴出50-100條長度為100-500bp的帶。240組則能分出20000多條帶!(4)隨機-錨定引物PCR的產(chǎn)物電泳比較①物理切割法：超聲波(300bp)或機械攪拌(8kb)。(2)載體與基因組DNA大片段的連接(3)將重組子導入到相應的宿主細胞保存和擴增。cDNA文庫：利用某種生物的總mRNA合成cDNA,再將這些cDNA與載體原理：利用mRNA都含有一段polyA尾巴，將mRNA從總RNA(rRNA、tRNA等)中分D.去掉發(fā)卡結構：用核酸酶S1可以切掉發(fā)卡結構。(5)導入細菌細胞中進行保存和擴增。第六章基因的重組與轉(zhuǎn)移(2)齊平末端的連接①同聚加尾法形成“粘性末端”②與T載體直接連接：用TaqDNA聚合酶(1)轉(zhuǎn)化(transformation):以質(zhì)粒為載體，將攜帶外源(3)轉(zhuǎn)導(transduction):以噬菌體作為媒介講一個細胞(供體)的遺傳物質(zhì)傳遞給另一個細胞(受體)的過程。根癌農(nóng)桿菌中存在Ti質(zhì)粒，將外源基因插入Ti質(zhì)粒后構建的重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化土壤農(nóng)桿菌，有10%的細胞能吸收DNA沉淀。脂質(zhì)體有商業(yè)試劑盒(如LifeTechnologies)直接把外源DNA注射到宿主細胞核里，使其整合第七章重組子的篩選和鑒定(4)放射性抗體測定法、免疫沉淀測定法等免2.抗藥性標記插入失火選擇法、β-半乳糖苷酶顯色反應選擇法以及根據(jù)插入序列的表型特(1)四環(huán)素抗性插入失活(環(huán)絲氨酸殺死生長的細菌，但不殺死停止生長的細菌)(2)氨芐青霉素抗性插入失活液選擇。(挑選藍色克隆)β-半乳糖苷酶使Xgal分解成藍色產(chǎn)物。插入外源根據(jù)插入序列的表型特征選擇：利用插入的外源基因的表達產(chǎn)物特性進原理：(1)彌補缺陷(2)增加新性狀3.凝膠電泳檢測法和R-環(huán)檢測法等物理檢測法5.放射性抗體測定法、免疫沉淀測定法等免疫化學法菌落形成沉淀圈。對于不能分泌到菌體外的蛋白質(zhì)可先進行原位溶菌處理(溶菌酶、原噬菌第八章外源基因表達系統(tǒng)用于基因擴增或高效表達的受體細胞(recA-)啟動子序列：大腸桿菌的所有啟動子中都有基因工程常用的原核啟動子(最佳啟動子必須具備的條件):●必須是一種強啟動子能使外源基因的蛋白產(chǎn)量達到細胞總蛋白的10%-30%以上。S-D序列：核糖體結合位點(RBS),mRNA上與核糖體16sRNA結合是序列。影響外源基因衰減子:衰減發(fā)生處的一種內(nèi)部終止子序列。衰減子是位于細菌操縱子上游的一段核苷酸序列。原核生物中通過翻譯前導肽而實現(xiàn)控制DNA的轉(zhuǎn)錄的調(diào)控方式稱衰減作4.包涵體表達、分泌型表達、融合型表達等原核表達各自優(yōu)包涵體的水難溶性及其密度遠大于其它細胞碎片和細胞成分，菌重組異源蛋白在大腸桿菌細胞內(nèi)的穩(wěn)定性主要取決于包涵體形才能回收得到具有正確空間構象(因而具有生物活性)的目標蛋白，因此包涵體變復性操作(2)然而，這也是一個技術難題，尤其當目標蛋白分子中的Cys殘基數(shù)目較高時，體外復10倍?！つ康牡鞍滓子诜蛛x利用受體蛋白成熟的抗體、配·目的蛋白溶解性好由于受體蛋白·目的蛋白需要回收融合蛋白(1)優(yōu)化表達載體的設計：在構建表達載體時對決定轉(zhuǎn)錄起始的啟動子序列和決定mRNA(2)提高稀有密碼子tRAN的表達作用。多數(shù)密碼子具有簡并性，而不同基因使用同義密(3)提高外源基因mRNA的穩(wěn)定性。盡可能減少核酸外切酶可能對mRNA的降解或改變外源基因mRNA的結構，使之不易被降解。(4)提高外源基因表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性。降低水解酶對外源基因表達產(chǎn)物的降解。(5)優(yōu)化發(fā)酵過程。在工藝方面和生物學方面進行優(yōu)化。Yep:以2μ質(zhì)粒上的復制元件為復制子的質(zhì)粒稱為Yep·YCp質(zhì)粒具有較高的有絲分裂穩(wěn)定性，但拷貝數(shù)只有1-5個含有酵母菌染色體DNA同源序列的YIp質(zhì)粒的構建為Yip。革蘭氏陰性土壤桿菌農(nóng)桿根瘤菌(A.tumefaciens)感染所致，其致瘤特性是由該菌細胞內(nèi)整個質(zhì)粒160-240kbtmr的編碼產(chǎn)物負責：合成植物分裂素外源基因能高效表達病毒基因組和重組分子常發(fā)生重排和缺失現(xiàn)象9.營養(yǎng)缺陷型的哺乳動物受體細胞篩選原理含有胸腺嘧啶核苷激酶(TK)編碼基因缺陷的受體細胞(tk-)不能在含有次氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基上(HAT培養(yǎng)基)生長，載體上的標記基因tk能與之遺中國倉鼠卵巢細胞(CHO),其優(yōu)勢有·COS細胞的特點：長素與分裂素之比高，則根部發(fā)育；生長素這項技術有一定的局限性，即大多數(shù)單子葉農(nóng)作物(如谷類作物)很難從原生質(zhì)再生出完整基因治療(1)基因置換：指將特定的目的基因?qū)胩囟毎?，通過定位重組，以導入的正常基因置(2)基因添加：通過導入外源基因使靶細胞表達其本身不表達的基因。(3)基因干預：采用特定的方式抑制某個基因的表達，或者通過破壞某個基因的結構而使(4)自殺基因治療：將“自殺”基因?qū)胨拗骷毎?，這種基因編碼的酶能使無毒性的藥(5)基因免疫治療：通過將抗癌免疫增強細胞因子或MHC基因?qū)肽[瘤組織，以增強腫瘤(6)耐藥基因治療：耐藥基因治療是在腫瘤治療時，為提高機體耐受化療藥物的能力，把3.基因治療的途徑①exvivo途徑：這是指將含外源基因的載體在體外導入人體自身或異體細胞(或異種細胞),經(jīng)體外細胞擴增后，輸回人體。exvivo基因轉(zhuǎn)移途徑比較經(jīng)典、安全，而且效果較易控制，但是步驟多、技術復雜、難度大，不容易推廣；②invivo途徑：這是將外源基因裝配于特定的真核細胞表達載體，直接導入體內(nèi)。這種載體可以是病毒型或非病毒性，甚至是裸DNA。invivo基因轉(zhuǎn)移