細胞粘附因子

第十六章

細胞因子與細胞粘附因子的測定是由活化的免疫細胞和某些基質(zhì)細胞分泌的高活性、多功能、小分子多肽基本概念細胞因子：細胞粘附因子：介導細胞間或細胞與細胞外基質(zhì)間粘附作用的膜性或可溶性分子第一節(jié)生物學測定方法基于DNA檢測的分子生物學測定法：

DNA擴增法

RNA印跡法原位雜交法核酸酶保護分析生物活性測定法

分類根據(jù)細胞因子對特定的生物學活性,應用相應的指示系統(tǒng),同時與標準品對比測定,從而得知樣品中細胞因子的活性水平,一般以活性單位(U/ml)表示生物學測定法原理有助于細胞因子檢測的活性作用包括有助于細胞因子檢測的活性作用包括刺激細胞增殖或集落形成的活性維持細胞生長和存活的特性抑制細胞生長或破壞細胞的效應促進細胞趨化或抗病毒作用以細胞因子依賴性細胞株為靶向，通過觀察特定的細胞因子刺激或抑制依賴性細胞株增殖來評估細胞因子的活性水平。生物學測定法原理一、促進細胞增殖和增殖抑制法直接計數(shù)法

簡便、直觀、費時、主觀因素影響大、難以標準化和自動化細胞代謝活性測定方法

3H-TdR、125I-UdR摻入法或MTT細胞代謝產(chǎn)物測定法代謝產(chǎn)物熒光強度測定法和指示細胞表面標記或可溶性分子測定法一、促進細胞增殖和增殖抑制法細胞增殖檢測方法分類

通過檢測細胞DNA合成的增加或減少來判斷細胞增殖的方法。在細胞的增殖過程中，DNA合成的增加使得指示細胞對核苷或堿基的需求增多，若將核苷標記上可以示蹤的同位素（3H/125I），通過檢測細胞內(nèi)的同位素含量，則可反映細胞增殖的程度。結(jié)果客觀易于自動化；適用于大標本量的測定

優(yōu)點缺點(1)同位素摻入法（3H-TdR）方法的特異性受依賴細胞株影響；放射性污染常見細胞因子3H-TdR摻入檢測法所需細胞及參考試驗條件細胞株所需濃度（細胞數(shù)/ml）3H-TdR前培養(yǎng)時間3H-TdR后培養(yǎng)時間檢測細胞因子D10G4.12×1054818-20IL-1L9292×1055616IL-1CTLL-2105244-6IL-2FDC-P1,32DCL-275×104244-8IL-3CT.4S105244-6IL-4CH125×103486IL-5B135×1043612IL-5T88-M1×1052412IL-5BCL1105726IL-5Clone-K,I×N/2bx105244-6IL-7TS13×104666IL-9T10105726IL-11UT-71.5×105726SCF（干細胞因子）CCL-64*5×108728TGF-βDA3.15,IF5×104244-8GM-CSFM14/NES60.45×104244-8M-CSF/G-CSF特點：不使用放射性核素，以細胞代謝變化為增殖指征指示細胞的增殖情況與線粒體代謝活性相關

測定步驟類似相同點不同點(2)MTT比色法與同位素摻入法相比摻入物：MTT而非3H-TdR；反應條件：選用的細胞及其濃度、培養(yǎng)時間不同細胞株/原代細胞細胞終濃度（細胞數(shù)/ml）加入MTT前溫育時間（h）檢測細胞因子B9，MH60,BSF2,TTD15×104/2×10596/48IL-6B9-115×10496IL-11B9-1-35×10496IL-13KYM-1D42×10372MV-3D95×103120TGF-βWEHI-164/clone132×10372TNF32D/Mp110S1×10344L9292×10556TNFCTLL-210522-24IL-2小鼠基質(zhì)細胞,32DCL-271.5×10572IL-3細胞增殖或抑制活性檢測的MTT比色法常用靶細胞二、細胞毒活性測定法對指示細胞具有破壞作用的細胞因子，若與細胞共育將會導致細胞死亡。因此，待測細胞因子作一系列稀釋后加至指示細胞培養(yǎng)體系，以檢測培養(yǎng)細胞的死細胞數(shù)作為判斷指標，死細胞數(shù)量與細胞因子的活性呈正比。試驗時，與細胞增殖或抑制方法一樣，以已知活性的細胞因子標準品為對照。死、活細胞情況可用同位素51Cr釋放法判斷，或應用臺盼蘭染色死細胞后直接計數(shù)。也可通過結(jié)晶紫、萘酚藍黑、MTT、NBB等著染活細胞，再用脫色液脫出染料后酶標儀比色測定吸光值。死細胞數(shù)、51Cr釋放量越高或比色測定的吸光值越低，表明待測細胞因子的細胞毒活性則越高。應用系列稀釋的細胞因子標準品，制作其活性與劑量關系的標準曲線，以此作為待測品活性的定量測定基礎。

基本原本法常用于TNF等的測定三、抗病毒活性測定法WISH、Hep2/c人干擾素L929小鼠干擾素Ratec

大鼠干擾素A549MDBK多種族的IFN-α和IFN-γ常用于檢測抗病毒活性的細胞株有：本法常用于IFN等的測定，IFN可誘導細胞產(chǎn)生抑制病毒RNA和DNA合成的酶，保護細胞不受病毒感染，產(chǎn)生細胞病變效應（CPE）。

常用于攻擊細胞的病毒：檢測抗病毒活性的方法:VSV、EMCV及Sindbisvirus等細胞病變效應(CPE)、抑制病毒蝕斑形成或抑制病毒的產(chǎn)量

TNF-α和TNF-β與同一受體結(jié)合，故兩者生物學活性相似用TNF-α與TNF-β特異性中和抗體作阻斷試驗，以區(qū)別兩類TNFTNF活性測定靶細胞：小鼠成纖維細胞株L929、L-M、WEHI164.13注意：

若選用L929細胞，其不宜生長過密。細胞被某種因素激活后，代謝增強，線粒體脫氫酶活性也增強，著色也會加深，

MTT染色時，必須考慮待檢樣品中有無激活靶細胞的因素細胞毒活性測定法常用于TNF等的測定三、抗病毒活性測定法細胞病變程度分為5個等級即：“0”，表示無明顯CPE；“1+”，CPE≤25％；“2+”，CPE為25～50％；“3+”，CPE為50～75％；“4+”，CPE為75～100％。根據(jù)病變程度找出CPEI50的標本稀釋范圍，并以此計算出距離比例和確定IFN效價。該法操作復雜、影響因素較多，在試驗前應對所用的病毒進行滴定。

標本稀釋度log4兩孔平均CPE細胞病變抑制程度細胞病變抑制積累細胞病變積累細胞病變抑制率30416016/16(100%)40412012/12(100%)504808/8(100%)61.52.541.54/5.5(73%)72.51.51.541.5/5.5(27%)800080/8(0%)細胞病變抑制法結(jié)果判斷舉例*

*結(jié)果：CPEI50稀釋度介于4-6-4-7之間，距離比例為(73-50)/(73-27)=0.50，效價為46.5；同法計算IFN標準品的CPEI50稀釋度，將IFN效價換算成國際單位，IFN國際單位=樣品CPEL50的稀釋度/標準品CPEI50稀釋度×標準品的單位。四、趨化活性測定法趨化性(chemotaxis)：誘導細胞向趨化因子化學濃度高的方向作定向移動,可采用瓊脂糖和微孔小室趨化試驗測定細胞因子的趨化活性化學增活現(xiàn)象(chemokinesis)：增強細胞的隨機運動,可采用瓊脂糖小滴化學動力學試驗檢測。趨化因子誘導細胞移動的方式：五、生物學活性測定方法學評價敏感性較高特異性不高操作繁瑣易受干擾第二節(jié)免疫學測定法免疫學測定原理細胞因子(或受體)與相應的特異性抗體(單克隆抗體或多克隆抗體)結(jié)合，通過同位素、熒光或酶等標記技術加以放大和顯示，從而定性或定量顯示細胞因子(或受體)的水平。實驗周期短干擾因素少適應于大量標本檢測易標準化敏感性高結(jié)果不表示生物學活性受到McAb的限制優(yōu)點生物學活性檢測方法相比ELISA法夾心法競爭法間接法分類：免疫學檢測的方法多采用根據(jù)抗體性質(zhì)和特異性不同可有以下幾種不同的夾心法ELISA1.PcAb與McAb夾心法2.McAb與PcAb夾心法3.雙McAb夾心法4.細胞、McAb夾心法ELISA夾心法ELISA法是應用最為廣泛的非均相酶標免疫分析技術，一步或多步的抗原抗體反應和一步酶促反應構(gòu)成ELISA的基本步驟，可作定性或定量分析。ELISA法不僅可以用于細胞因子檢測，也可用于可溶性細胞因子受體或可溶性粘附因子的測定

ELISA法具有特異、簡便，易于推廣和標準化等優(yōu)點，可同時檢測大量標本且試驗廢棄物便于處理，成為敏感范圍可觸及的細胞因子測定的首選方法。此外，無生物學活性的細胞因子前體、分解片段以及與相應受體的結(jié)合物也可用此法檢測。其缺點是，敏感性偏低、不能判斷細胞因子的生物學活性。流式細胞分析法流式細胞分析法，是基于熒光抗體染色技術并借助流式細胞儀敏感的分辨力所建立的方法。該法主要用于細胞內(nèi)細胞因子和細胞表面粘附分子的檢測，通過特異性的熒光抗體染色，能簡單、快速地進行單個細胞水平的細胞因子或粘附因子的檢測，精確判斷不同細胞亞群細胞因子和膜分子的表達情況。1．分離和培養(yǎng)待檢細胞2．細胞固定3．封閉非特異性結(jié)合位點4．染色與分析基本步驟酶聯(lián)免疫斑點試驗(ELISPOT或ElisaSpot)在包被有待測細胞因子抗體的微孔板上，加入可分泌相應細胞因子的待測細胞，經(jīng)在有或無刺激物存在的條件下培養(yǎng)，待測細胞分泌細胞因子于其周圍，并被板上的特異性抗體捕獲。后續(xù)的反應如同ELISA，即在洗去細胞后視用于試驗的酶標抗體為一抗或二抗，分別作直接或間接法。

一個斑點代表一個細胞因子分泌細胞，斑點的顏色深淺程度與細胞分泌的細胞因子量相關

基本原理免疫學測定方法學評價區(qū)分不同分泌特性的細胞亞群：

Th1細胞IFN-γTh2細胞IL-4細胞表面的粘附分子或細胞因子受體：單克隆抗體技術直接或間接熒光抗體染色無需作細胞固定和非特異性結(jié)合位點的封閉待測細胞是新鮮分離或培養(yǎng)的活細胞，保持良好狀態(tài)免疫學測定方法學評價優(yōu)點：特異性高

操作簡便、快速，無需依賴細胞株影響因素較少且易控制，重復性好，方法容易標準化。缺點：所測定的只是細胞因子的蛋白含量結(jié)果與所用的抗體來源及親和力有很大的關系敏感性相對較低標本中細胞因子的可溶性受體，會影響特異性抗體對細胞因子的結(jié)合第三節(jié)

細胞因子與細胞粘附分子測定的臨床應用特定疾病的輔助診斷機體免疫狀態(tài)的評估臨床疾病治療效果的監(jiān)測和指導用藥疾病預防細胞因子的測定主要用于以下幾方面：一、臨床應用原則細胞因子和粘附分子的異質(zhì)性、功能交叉性和多樣性、來源的復雜性和組織細胞的非特異性，決定了在進行這些分子檢測時，必須對方法選擇和結(jié)果判斷作出綜合考慮。細胞因子的檢測方法多種多樣，各有利弊。高敏感性方法：特異性的降低、廢棄物難處理活性測定方法：定性試驗基因分析法：利于細胞內(nèi)定位分析、操作煩瑣（一）方法的聯(lián)合應用常用的臨床標本：抗凝全血，并分離獲得單個核細胞炎癥局部細胞因子的水平：局部分泌液細胞因子或粘附分子的細胞內(nèi)定位檢測：相應細胞相應細胞因子的基因和mRNA表達：相應細胞療效觀察和預后判斷：疾病急性期和恢復期雙份標本進行動態(tài)觀測免疫熒光染色和流