《儀器分析技術(shù)》 課件 模塊三 紫外-可見分光光度法

模塊三紫外-可見分光光度法儀器分析技術(shù)目錄

Contents學(xué)習(xí)目標知識目標※

了解紫外-可見分光光度法的原理和適用范圍；※

熟悉紫外-可見分光光度儀的主要部件及基本操作；※

了解如何選擇紫外-可見分光光度法的測量條件。技能目標※

掌握紫外-可見分光光度法定性的分析及定量分析的方法；基本原理項目一紫外-可見光譜和分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系項目二紫外-可見分光光度計項目三測量條件的選擇項目四紫外分光光度法測定槐米中總黃酮含量項目實戰(zhàn)二維生素????????????注射液的紫外分光光度法定性鑒別項目實戰(zhàn)一測量條件的選擇項目五項目一基本原理任務(wù)一 紫外-可見分光光度法概述分析物質(zhì)在紫外-可見光區(qū)的（200～800

nm）分子吸收光譜；具有較高的靈敏度和較好的準確度；檢測范圍可達10-4～10-6

g/mL，高靈敏度儀器甚至可達10-7

g/mL；測定準確度一般為0.5%，采用性能較好的儀器測定準確度可達0.2%；在定性上可用于鑒別官能團和結(jié)構(gòu)式不同的化合物，也可以用來鑒別結(jié)構(gòu)相似的不同化合物；在定量上可以對多種混合組分不經(jīng)分離進行同時測定。此外，還可以配合其他分析檢測方法，用以推斷化合物的分子結(jié)構(gòu)。任務(wù)二 紫外-可見光譜的產(chǎn)生光譜名稱波長范圍躍遷類型輻射源分析方法X射線10

1～10

nmK和L層電子X射線管X射線光譜法遠紫外光10～200nm中層電子氕、氘、氚燈真空紫外光度法近紫外光200～400nm價電子氕、氘、氚燈紫外光度法可見光400～750nm價電子鎢絲燈比色及可見光度法近紅外線0.75～2.5

μm分子振動碳化硅熱棒近紅外光度法中紅外線2.5～5.0

μm分子振動碳化硅熱棒中紅外光度法遠紅外線5.0～1000

μm分子轉(zhuǎn)動、震動碳化硅熱棒遠紅外光度法微波0.1～100cm分子轉(zhuǎn)動電磁波發(fā)生器微波光譜法無線電波1～1000

m核磁共振光譜法2.紫外-可見光的基本特點紫外-可見光是一種電磁波，根據(jù)波長或者頻率排列可得如下表的電磁波譜表。電磁波譜范圍任務(wù)二 紫外-可見光譜的產(chǎn)生2.紫外-可見吸收光譜的產(chǎn)生（1）由原子外層電子選擇性地吸收某些波長的電磁波而引起的（2）特征是光譜為線狀光譜原子吸收光譜建立原子吸收分光光度法任務(wù)二 紫外-可見光譜的產(chǎn)生分子結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性引起分子吸收光譜的復(fù)雜性，呈帶狀光譜。具體原因：除了電子躍遷能級外，在同一電子能級中有幾個振動能級，在同一振動能級中又存在不同轉(zhuǎn)動能級。在電子能級變化時，不可避免地也伴隨分子的振動和轉(zhuǎn)動的能級的變化。由分子振動能級（能級間的能量差0.05～1

eV）和轉(zhuǎn)動能級（能級間的能量差小于0.05

eV）的躍遷而產(chǎn)生的吸收光譜為振動-轉(zhuǎn)動光譜或紅外吸收光譜。由電子能級躍遷而產(chǎn)生的光譜為紫外-可見吸收光譜。由價電子躍遷而產(chǎn)生的分子光譜稱為電子光譜。雙原子分子中電子振動和轉(zhuǎn)動能級示意圖A，B

—

電子能級；V′（0,1,

2,3,4），V″（0,

1,2,

3,4）—

振動能級；J′（0,

1,2,

3,4），J″（0,

1,2,

3,4）

—

轉(zhuǎn)動能級任務(wù)二 紫外-可見光譜的產(chǎn)生物質(zhì)的顏色是因為物質(zhì)對不同波長的光具有選擇性吸收作用而產(chǎn)生的。光的互補色示意圖單色光復(fù)合光紫外光可見光具有單一波長的光由不同波長的單色光組成的光波長在200～400

nm的光人能感覺到的光的波長在400～750

nm，它是由紅、橙、黃、綠、青、藍、紫等各種色光按一定比例混合而成的。任務(wù)三 光吸收定律1.朗伯-比爾定律（Lambert-Beer

law）分子吸收光譜法是基于在光程長度為b（cm）的透明池中，對溶液的透射比T或吸光度A進行定量分析。通常被分析物質(zhì)的濃度c與吸光度A呈線性關(guān)系，可用下式表示：A=-lgT=lg（I0/I）=εbc或A=-lgT=lg（I0/I）=

αbc式中

I0，I——

入射光強度與透射光強度；A——

吸光度；T——

透射比；b——

介質(zhì)厚度，cm；α——

吸收系數(shù)，L·g

1·cm

1，多用于含量測定；ε——

摩爾吸收系數(shù)，L·mol

1·cm

1，多用于分子結(jié)構(gòu)的研究。任務(wù)三 光吸收定律由于被分析物質(zhì)的溶液是放在透明的吸收池中測量，在空氣/吸收池壁以及吸收池壁/溶液的界面間會發(fā)生反射，導(dǎo)致入射光和透射光的損失。此外，光束的衰減也來源于大分子的散射和吸收池的吸收。故通常不能按上述公式所示的定義直接測定透射比和吸光度。在實際測量中，采用在另一相同的吸收池中放入溶劑，與被分析溶液的透射強度進行比較。這樣就可得到非常接近真實透射比和吸光度的實驗值。（2） ?

吸光物質(zhì)為均勻的非散射體系。（3） ?

吸光質(zhì)點之間沒有相互作用。（4）入射光和吸光物質(zhì)之間僅限于光吸收作用，無熒光和化學(xué)變化的發(fā)生。朗伯-比爾定律是建立在如下條件之上的：（1） ?

入射光為平行單色光，且為垂直照射。任務(wù)三 光吸收定律任務(wù)三 光吸收定律2.吸光度的加和性當(dāng)介質(zhì)中含有多種吸光組分時，只要各組分之間不存在相互作用，則在某一波長下介質(zhì)的總吸光度為各組分在該波長下的吸光度的總和。A=A1+A2+A3+…+

An這一規(guī)律稱為吸光度的加和性。根據(jù)這一規(guī)律，可以對多組分物質(zhì)進行測定。任務(wù)四 偏離朗伯-比爾定律的因素朗伯-比爾定律本身的局限性(一)嚴格地說，朗伯-比爾定律只適用于稀溶液。在高濃度（＞0.01

mol/L）時，吸收組分間的平均距離將會減小，粒子的電荷排布將因粒子之間的相互作用而發(fā)生改變，導(dǎo)致它們的摩爾吸收系數(shù)ε發(fā)生改變，從而吸收給定波長的能力發(fā)生變化。由于粒子間相互作用的程度與溶液濃度有關(guān)，故使吸光度和濃度間的線性關(guān)系偏離了朗伯-比爾定律。因此在吸收組分濃度較低，但其他組分（特別是電解質(zhì)）濃度高的溶液中也會對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響。任務(wù)四 偏離朗伯-比爾定律的因素(二) ?

化學(xué)偏離在某些物質(zhì)的溶液中，待分析物質(zhì)與溶劑發(fā)生締合、離解以及溶劑化反應(yīng)在大多數(shù)波長處，重鉻酸根離子和其他兩種鉻酸根粒子的摩爾吸收系數(shù)不相同(三) ?

儀器偏離主要是指由于單色光不純引起的偏離。事實上，通過波長選擇器從連續(xù)光源中分離出的波長，只是包括所需波長的波長帶，即從連續(xù)光源中獲得單一波長的輻射是很難辦到的。實驗證明，在吸收物質(zhì)的吸光度隨波長變化不大的光譜區(qū)內(nèi)，釆用多色光所引起的偏離不會十分明顯，相反在吸光度隨波長變化而產(chǎn)生較大變化的光譜區(qū)內(nèi)多色光所起的偏離則十分嚴重。光學(xué)因素(四)任務(wù)四 偏離朗伯-比爾定律的因素雜散光1雜散光（stray

light）是一些不在譜帶寬度范圍內(nèi)的與所需波長相隔較遠的光。雜散光也可使光譜發(fā)生變形變值。特別是在透射光很弱的情況下，會產(chǎn)生明顯的作用。散射光和反射光2光的散射可使透射光減弱。真溶液質(zhì)點小，散射光不強，可用空白對比補償。但渾濁溶液質(zhì)點大，散射光強，一般不易制備相同空白補償，常使測得的吸光度偏高，分析中不容忽視。反射也使透光強度減弱，使測得的吸光度偏高，一般情況下可用空白對比補償，但當(dāng)空白溶液與試樣溶液的折射率有較大差異時，可使吸光度值產(chǎn)生偏差，不能完全用空白對比補償。非平行光3任務(wù)四 偏離朗伯-比爾定律的因素透光率測量誤差(五)通過吸收池的光一般都不是真正的平行光，傾斜光通過吸收池的實際光程將比垂直照射的平行光的光程長，使厚度增大而影響測量值。這種測量時實際厚度的變異也是同一物質(zhì)用不同儀器測定吸光系數(shù)時，產(chǎn)生差異的主要原因之一。透光率測量誤差ΔT是測量中的隨機誤差，來自儀器的噪音（noise）。一類與光信號無關(guān)，稱為暗噪音（

dark

noise）；另一類隨光信號強弱而變化，

稱為散粒噪音（

signal

shotnoise）。任務(wù)四 偏離朗伯-比爾定律的因素控制溶液酸度1(六) ?

共存組分的干擾及消除在光度分析中，常常會因共存離子的干擾而影響測定，使測定結(jié)果產(chǎn)生嚴重誤差，這是造成光度分析誤差的重要原因之一。消除干擾的方法主要有以下幾種：實質(zhì)上是根據(jù)各種離子與顯色劑所形成的配合物穩(wěn)定性的差異，利用酸效應(yīng)來控制顯色反應(yīng)的究全程度，從而消除干擾、提高選擇性。如用4-[（5-氯-2-吡啶）偶氮-1,

3-二氨基苯（5-Cl-PADAR）測定Co2+，在弱酸性介質(zhì)中共存的Cu2+、Ni2+和Cr3+等離子也能與試劑生成有色配合物而干擾測定。加入掩蔽劑2任務(wù)四 偏離朗伯-比爾定律的因素常用的掩蔽劑主要是配合劑，有時氧化劑和還原劑也用作掩蔽劑。掩蔽劑的顏色以及它與干擾組分反應(yīng)產(chǎn)物的顏色不應(yīng)干擾被測組分的測定。此外，將二元配合物體系改變?yōu)槎嘣浜衔矬w系，選擇適當(dāng)?shù)臏y量波長和參比溶液等方法也可消除共存離子的干擾。當(dāng)上述方法都無效時，則需將干擾組分分離除去。項目二紫外-可見光譜和分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系任務(wù)一 躍遷類型當(dāng)分子中的價電子吸收一定能量的電磁輻射時，就由較低能級（E0）躍遷到較高能級（E'），吸收的能量與這兩個能級的能量差（

ΔE

）

相等，

一般為1

～20

eV。分子中的價電子包括形成單鍵的σ電子、雙鍵的π電子和非成鍵的n電子（

也稱p電子、孤對電子）。分子軌道可以認為是兩個原子結(jié)合成分子時，兩個原子的原子軌道以線性組合而生成的兩個分子軌道。分為具有較低能量的成鍵軌道和具有較高能量的反鍵軌道。H2的成鍵和反鍵軌道分子中價電子能級及躍遷示意圖任務(wù)一 躍遷類型兩個原子的p軌道平行地重疊起來，組成兩個分子軌道時，該分子軌道稱為π成鍵軌道和π*反鍵軌道。π鍵的電子重疊比σ鍵的電子重疊少，鍵能弱，躍遷所需的能量低。分子中n電子的能級基本上保持原來原子狀態(tài)的能級，稱為非鍵軌道。非鍵軌道比成鍵軌道所處能級高，比反鍵軌道能級低。由上所述，分子中不同軌道的價電子具有不同能量，處于低能級的價電子吸收一定能量后，就會躍遷到較高能級。任務(wù)一 躍遷類型σ→σ*躍遷處于σ成鍵軌道上的電子吸收光能后躍遷到σ*反鍵軌道。分子中σ鍵較為牢固，故躍遷需要較大的能量，吸收峰在遠紫外區(qū)（＜150

nm）。飽和烴類吸收峰波長一般都小于150

nm，如乙烷的λmax在135

nm。在200～400

nm范圍內(nèi)沒有吸收。0102的π→π*躍遷一般發(fā)生在波長200

nm左右（紫外區(qū)），其特征是吸光系數(shù)ε很大，一般ε＞104，為強吸收。具有共軛雙鍵的化合物，π→π*躍遷所需能量降低。共軛鍵越長，躍遷所需能量越小。π→π*躍遷處于π成鍵軌道上的電子躍遷到π*反鍵軌道上，所需的能量小于σ→σ*躍遷所需的能量，孤立任務(wù)一 躍遷類型n→π*躍遷含有雜原子不飽和基團，其非鍵軌道中孤對電子吸收能量后，向π*反鍵軌道躍遷，這種躍遷吸收峰一般在近紫外區(qū)（200～400

nm）。吸收強度弱，ε小，在10～100。0304道躍遷，這種躍遷可以吸收的波長在200

nm左右。n→σ*躍遷含—OH，

—NH2

，

—X，

—S等基團的化合物，其雜原子中孤對電子吸收能量后向σ*反鍵軌任務(wù)一 躍遷類型電荷遷移躍遷指用電磁輻射照射化合物時，電子從給予體向接受體相聯(lián)系的軌道上躍遷，因此電荷遷移躍遷實質(zhì)是一個內(nèi)氧化還原過程，而相應(yīng)的吸收光譜稱為電荷遷移吸收光譜。電荷遷移吸收光譜最大的特點是摩爾吸光系數(shù)較大，一般????????????????＞104

，用于定量分析，可以提高檢測的靈敏度。0506102，位于可見光區(qū)。配位場躍遷必須在配體的配位場作用下才有可能產(chǎn)生的躍遷，稱為配位場躍遷。與電荷遷移躍遷比較，由于選擇規(guī)則的限制，配位場躍遷吸收的摩爾吸光系數(shù)較小，一般ε＜任務(wù)二 光譜特征及有關(guān)術(shù)語吸收光譜（absorption

spectrum）又稱吸收曲線，是以波長λ（nm）為橫坐標，以吸光度A（或透光率T）為縱坐標所描繪的曲線，吸收光譜一般都有如下特征：紫外吸收光譜示意圖1—吸收峰；2—吸收谷；3—肩峰；4—末端吸收吸收峰、吸收谷肩峰（shoulder

peak）末端吸收（end

absorption）生色團（chromophore）助色團（auxochrome）紅移（red

shift）/長移（bathochromic

shift）藍（紫）移（blue

shift）/短移（hypsochromic

shift）增色效應(yīng)或濃色效應(yīng)（hyperchromic

effect）減色效應(yīng)或淡色效應(yīng)（hypochromic

effect）強帶和弱帶（strong

band

and

weak

band）任務(wù)三 光譜帶及其與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系1.光譜帶的類型任務(wù)三 光譜帶及其與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系2.

影響吸收帶的因素共軛效應(yīng)分子中的共軛體系由于大π鍵的形成，各能級間能量差減小，躍遷所需能量降低。使吸收峰向長波方向移動，吸收強度隨之加強的現(xiàn)象，稱為共軛效應(yīng)。助色效應(yīng)當(dāng)助色團生色團相連時，由于助色團的n電子與生色團的π電子共軛，使吸收峰向長波方向移動，吸收強度隨之加強的現(xiàn)象，稱為助色效應(yīng)。超共軛效應(yīng)由于烷基的σ電子與共軛體系中的π電子共軛，使吸收峰向長波方向移動，吸收強度加強的現(xiàn)象，稱為超共軛效應(yīng)。但其影響遠遠小于共軛效應(yīng)。高溫?zé)胱品ㄈ軇┏绊懳辗逦恢猛?，還影響吸收強度及光譜形狀，所以一般應(yīng)注明所用溶劑。極性溶劑使n→π*和π→π*躍遷吸收峰位置向不同方向移動，一般使π→π*躍遷吸收峰向長波方向移動；而使n→π*躍遷吸收峰向短波方向移動，后者的移動一般比前者移動大。任務(wù)三 光譜帶及其與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系溶

劑正己烷氯

仿甲

醇水波長位移π→π*230

nm238

nm237

nm243

nm向長波移動n→π*329

nm315

nm309

nm305

nm向短波移動異亞丙基丙酮的溶劑效應(yīng)項目三紫外-可見分光光度計任務(wù)一 儀器構(gòu)成1.光源分光光度計通常采用6～12

V低壓鎢絲燈或者鹵鎢絲燈作為光源，其發(fā)射的復(fù)合光波長較長，在360～2500

nm。白熾燈的發(fā)光強度與供電電壓的3～4次方成正比，所以供電電壓要穩(wěn)定。通常在儀器內(nèi)同時配有電源穩(wěn)壓器。氫燈或氘燈：氫燈是一種氣體放電發(fā)光的光源，發(fā)射從150

nm至約400

nm的連續(xù)光譜。2.單色器（分光系統(tǒng)）單色器的作用是從光源發(fā)出的復(fù)合光中分出所需要的單色光。紫外-可見分光光度計的單色器通常由入射狹縫、準直鏡、色散元件（棱鏡或光柵）、聚焦鏡和出射狹縫組成，色散元件是單色器的核心。目前大多紫外-可見分光光度計采用光柵單色器。從單色器所獲單色光的純度還受到出射狹縫寬度的影響。任務(wù)一 儀器構(gòu)成3.吸收池吸收池又稱比色皿，是用于盛裝參比溶液和試樣溶液的玻璃器皿。通常隨儀器配有厚度（光程長度）為0.5

cm、1

cm、2

cm和3

cm四種規(guī)格的比色皿。比色皿的表面對入射光有一定的反射作用。因為這種反射作用很小，加之進行光度分析時，都采用同質(zhì)料和同厚度的比色皿分別盛裝試液與參比溶液，因此可以抵消因器皿表面反射光而引起的誤差。使用比色皿時要注意保持清潔、避免磨損它的光學(xué)面，以保持其光學(xué)面透明。測定時應(yīng)選擇同一規(guī)格中透射比相差小于

0.5%

的比色皿使用。4.信號顯示系統(tǒng)作用是檢測光電流強度的大小，并以一定的方式顯示或記錄下來。任務(wù)一 儀器構(gòu)成5.檢測系統(tǒng)通常是使通過吸收池后的透射光投射到檢測器上，利用光電效應(yīng)而得到與透射光強度成正比的光電流進行測量，因而檢測器又稱光電轉(zhuǎn)換器。光電比色計和簡易紫外-可見分光光度計以硒光電池為檢測器，響應(yīng)范圍為300～800

nm，尤其對500～600

nm的光最為靈敏。硒光電池在較長時間連續(xù)照射后，會出現(xiàn)“疲勞”現(xiàn)象，靈敏度降低。普通紫外-可見分光光度計采用光電管為檢測器，它具有靈敏度高、光敏范圍廣及不易疲勞等優(yōu)點。中、高檔紫外-可見分光光度計廣泛采用光電倍增管為檢測器。由于光電倍增管中有多個倍增極，對微弱的光電流有很強的放大作用，因而較光電管更為靈敏，適用波長范圍為160～700

nm。任務(wù)二 紫外-可見分光光度計的類型1.儀器類型（a）單光束（b）雙光束（c）雙波長各類分光光度計工作原理示意圖根據(jù)儀器的結(jié)構(gòu)與功能不同紫外-可見分光光度計任務(wù)二 紫外-可見分光光度計的類型單光束分光光度計簡易分光光度計都屬于這種類型。單光束分光光度計結(jié)構(gòu)簡單，價格低廉，特別適合于固定測定波長的定量分析。但測量時由于光源和系統(tǒng)的不定性，會引起測量誤差；此外也無法進行吸收光的自動掃描，因此不適合用于經(jīng)常變更測量波長的定性分析。雙光束分光光度計?雙光束儀器對透過參比和試液的光強測量幾乎同時進行，補償了因光源和檢測系統(tǒng)的不穩(wěn)定而造成的影響，因而具有較高的測量精度。但其光路設(shè)計要求嚴格，價格也比較昂費。任務(wù)二 紫外-可見分光光度計的類型雙波長分光光度計???雙波長分光光度計是用兩種波長λ1和λ2的單色光交替照射樣品溶液（不需要使用參比溶液）。經(jīng)光電倍增管和電子控制系統(tǒng)，測得的是樣品溶液在兩種波長下的吸光度之差ΔA；只要波長選擇得當(dāng)，吸光度之差ΔA就是扣除了背景吸收的吸光度。雙波長分光光度計不僅能測定高濃度試樣、多組分混合試樣，還能測定渾濁試樣，并且準確度高。任務(wù)二 紫外-可見分光光度計的類型2.吸光度校正波長校正可采用輻射光源法校正。常用氫燈（486.13、656.28

nm）、氘燈（486.00、656.10

nm）或石英低壓汞燈（253.65、435.88、546.07

nm）校正。鐠釹玻璃在可見區(qū)有特征吸收峰，也可用來校正。苯蒸氣在紫外區(qū)的特征吸收峰也可用于校正。在吸收池內(nèi)滴一滴液體苯，蓋上吸收池蓋，待苯揮發(fā)后繪制苯蒸氣的吸收光譜。以重鉻酸鉀水溶液的吸收曲線為標準值校正。將0.0303

g重鉻酸鉀溶于1

L0.05

mol/L氫氧化鉀中，以1

cm吸收池，在25

°C測定不同波長下的吸光度如下表。任務(wù)二 紫外-可見分光光度計的類型波長/nm吸光度透光率波長/nm吸光度透光率波長/nm吸光度透光率2200.44635.8%3000.14970.9%3800.93211.7%2300.17167.4%3100.04889.5%3900.69520.2%2400.29550.7%3200.06386.4%4000.39640.2%2500.49631.9%3300.14971.0%4200.12475.1%2600.63323.3%3400.31648.3%4400.05488.2%2700.74518.0%3500.55927.6%4600.01896.0%2800.71219.4%3600.83014.8%4800.00499.1%2900.42837.3%3700.98710.3%5000.000100%重鉻酸鉀溶液的吸光度項目四測量條件的選擇任務(wù)一 儀器構(gòu)成測量波長的選擇影響靈敏度和準確性，一般確定測量波長的方法是先制作吸光物質(zhì)的吸收曲線，選擇最大吸收波長的光作為入射光，這稱為“最大吸收原則”。選擇最大吸收波長的光進行分析，不僅靈敏度最高，而且能夠減少或消除由非單色光引起的對朗伯-比爾定律的偏離，準確度好。若在最大吸收波長處存在其他吸光物質(zhì)干干擾時，則應(yīng)根據(jù)“吸收最大，干擾最小”的原則選擇測量波長。丁二酮肟鎳（a）和酒石酸鐵（b）的吸收光譜任務(wù)二 參比溶液的選擇參比溶液又稱空白溶液，用以調(diào)節(jié)儀器的工作零點，以消除由于吸收池、溶劑和試劑對光的吸收、反射或散射所造成的誤差。如果參比溶液選擇得當(dāng)，還可以消除某些共存物質(zhì)的干擾。當(dāng)試樣溶液、顯色劑及所用的其他試劑在測定波長處均無吸收時，可選用蒸餾水（即純?nèi)軇┳鳛閰⒈纫海?）若顯色劑或其他試劑對入射光有吸收，應(yīng)選用試劑空白為參比液（2）若試樣中其他組分有吸收，而顯色劑無吸收且不與其他組分作用，則應(yīng)選用不加顯色劑的試樣溶液作參為比液（3）若顯色劑和試液都有吸收，或反應(yīng)產(chǎn)物有吸收，可在一份試液中加入適當(dāng)試劑將被測組分掩蔽起來，然后按相同的操作方法加入顯色劑和其他試劑，以此消除干擾。（4）任務(wù)三 吸光度讀數(shù)范圍的選擇任何分光光度計都有一定的測量誤差，一般來說，透射率讀數(shù)誤差ΔT是一個常數(shù)，但在不同的讀數(shù)范圍內(nèi)所引起的濃度的相對誤差（Δc/c）卻是不同的。濃度測量的相對誤差Δc/c不僅與儀器的讀數(shù)誤差ΔT

有關(guān)，而且與試液本身的透射率T

有關(guān)。當(dāng)T為20%～65%時，Δc/c＜2%；當(dāng)T=36.8%時，Δc/c=1.32%，濃度相對誤差最小。因此，為了減小濃度的相對誤差，提高測量準確度，一般應(yīng)控制待測液的吸光度在0.2～0.7。當(dāng)溶液的吸光度不在此范圍時，可以通過改變稱樣量、稀釋溶液以及選擇不同厚度的吸收池來控制吸光度。項目五定性與定量分析方法任務(wù)一 定性分析方法無機元素主要是用發(fā)射光譜法，也可采用經(jīng)典的化學(xué)分析方法。有機化合物紫外-可見分光光度法的應(yīng)用也有一定的局限性，但它可用于鑒定共軛生色團，以此推斷未知化合物的物的結(jié)構(gòu)骨架。一般有兩種方法：①

比較吸收光譜曲線；②

用經(jīng)驗規(guī)則計算最大吸收波長，然后與實測值比較。吸收光譜曲線的形狀、吸收峰的數(shù)目以及最大吸收波長的位置和相應(yīng)的摩爾吸收系數(shù)，是進行定性鑒定的依據(jù)，其中，最大吸收波長????????????????及相應(yīng)的????????????????

是定性鑒定的主要參數(shù)。在得到相同的吸收光譜時，應(yīng)考慮其并非同一物質(zhì)的可能性。而在吸收光譜有明顯差別時，可以肯定兩物不是同一種物質(zhì)。任務(wù)二 定量分析1.定量分析的方法在確定的最佳顯色反應(yīng)條件下和最佳測量條件下，分別測定一系列的含有不同含量被測物的標準溶液的吸光度。以標準溶液中被測組分的含量為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制A-c曲線，該曲線即為校準曲線。由朗伯-比爾定律可知，校準曲線的斜率為εb，在測定中b保持為定值不變，故可由曲線的斜率求出ε。當(dāng)需要對某未知液的濃度cx進行定量測定時，只需在相同條件下測得未知液的吸光度A，就可直接在校準曲線上查得或計算得出未知液的濃度cx。任務(wù)二 定量分析在待測組分濃度過高的情況下，可采用示差光度法分析。實際測得的試液的吸光度（示差吸光度）Af為Af

=Ax

-

As=

kb(cx-

cs)

=

kbΔc所測示差吸光度Af，與濃度差Δc成正比，制作Af-Δc曲線（也可直接利用以空白溶液作為參比制作的稀溶液校準曲線），根據(jù)Af得到Δc值，進而從cx=cs+Δc求出待測試液的濃度cx。示差光度法擴展了讀數(shù)標尺，使吸光度讀數(shù)落在測量誤差較小的區(qū)域，從而使高濃度待測組分測量的準確度大大提高。但對儀器光源要求較高。任務(wù)二 定量分析當(dāng)試樣中含有多種吸光組分時，如果各測定組分的吸收曲線之間相互重疊，也可利用吸光度的加和性，對多組分進行同時測定。設(shè)混合物中含有x和y兩種組分，測定時根據(jù)x組分和y組分的吸收曲線，選擇各組分的λmax為測量波長λ1和λ2，分別在兩個波長下測定混合物的總吸光度，根據(jù)吸光度的加和性聯(lián)立下列方程Al

1

=

Ax

,

l

1

+

Ay

,

l

1Al

2

=

Ax

,

l

2

+

Ay

,

l

2A

=εbc分別測得純x和純y溶液在λ1和λ2兩個波長處的摩爾吸收系數(shù)，解方程組即可以求得兩組分的濃度c1和c2。任務(wù)二 定量分析原理：在單波長分光光度法中，通常是先用參比溶液調(diào)節(jié)儀器零位，然后將試液推入光路測定。設(shè)波長為λ1和λ2的兩束單色光的強度相等，則有Al1=el1bc+Ab1Al2=el2bc+

Ab2

式中

Ab1，Ab2——

背景或干擾物質(zhì)的吸收。若波波長選擇合適，使Ab1等于Ab2，則

DA

=

(el

1

-

el

2

)bc可見ΔA與吸光物質(zhì)的濃度成正比，且基本上消除了試樣背景和干擾的影響。波長λ1和λ2的組合和選擇是方法的關(guān)鍵用雙波長分光光度法以形成有色配合物測定某組分時，若沒有共存組分干擾，選擇配合物吸收峰作為測量波長λ1，選擇顯色劑吸收峰作為測量波長λ2，可獲取比單波長法更高的靈敏度。任務(wù)二 定量分析催化光度法是一種動力學(xué)分析方法，通過測量反應(yīng)速率進行定量分析。許多化學(xué)反應(yīng)在催化劑催化下可以加快反應(yīng)速率，而催化反應(yīng)的速率在一定范圍內(nèi)與催化劑的濃度成正比關(guān)系，因而以光度法或其他方法檢測催化反應(yīng)速率就可以實現(xiàn)對催化劑濃度的測定。任務(wù)二 定量分析2.定量分析的應(yīng)用紫外-可見分子吸收光譜法不僅可對那些本身在紫外-可見光區(qū)有吸收的無機和有機化合物進行定量分析，而且利用許多試劑可與非吸收物質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)生紫外和可見光區(qū)有強烈吸收的產(chǎn)物，即“顯色反應(yīng)”，從而對非吸收物質(zhì)進行定量測定。紫外-可見吸收光譜法定量分析法的依據(jù)是朗伯-比爾定律，即物質(zhì)在一定波長處的吸光度與它的濃度呈線性關(guān)系。因此，通過測定溶液對一定波長入射光的吸光度，就可求出溶液中物質(zhì)濃度和含量。由于最大吸收波長λmax處的摩爾吸收系數(shù)最大，通常都是測量λmax的吸光度，以獲得最大靈敏度。在紫外-可見吸收光譜法中，對單一物質(zhì)的定量分析比較簡單，一般選用工作曲線法和標準加入法進行定量分析。任務(wù)三 定量分析3.無機離子分析在一定的條件下，幾乎所有的金屬離子都能與特定的化學(xué)試劑-顯色劑作用形成有色化合物，從而可通過紫外-可見分光光度法對其進行定量測定。紫外-可見分光光度法測定無機離子時，根據(jù)待測定離子的性質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)娘@色劑和顯色反應(yīng)條件，在一定的測定波長和條件下，制作校準曲線，并在同樣的條件下對試樣進行測定。對某些極痕量的過渡金屬離子，在沒有合適的顯色反應(yīng)可達到靈敏度的要求時，利用催化光度法也許可以進行測定。任務(wù)三 定量分析4.生化物質(zhì)分析紫外-可見分光光度法是應(yīng)用最普遍的分析臨床、食品和藥物等領(lǐng)域生化物質(zhì)的方法。臨床醫(yī)學(xué)檢測中人體許多重要的生化指標，如葡萄糖、膽固醇、尿素、蛋白質(zhì)、甘油三酯、血色素、轉(zhuǎn)氨酶和淀粉酶等，都采用傳統(tǒng)的比色反應(yīng)技術(shù)進行測定。紫外-可見分光光度法測定生化物質(zhì)時，有些可以直接選擇適當(dāng)?shù)娘@色劑，形成有色化合物進行測定；大多數(shù)則需要與酶反應(yīng)進行聯(lián)合，經(jīng)過轉(zhuǎn)化之后或在酶作用下再與適當(dāng)?shù)娘@色劑作用，從而形成有色化合物進行測定。與生物免疫技術(shù)相結(jié)合的酶聯(lián)免疫法，使紫外-可見分光光度法得到了更大的發(fā)展。項目實戰(zhàn)一維生素????????????注射液的紫外分光光度法定性鑒別項目實戰(zhàn)一1.實戰(zhàn)目的010203掌握紫外-可見分光光度計的進行定性分析的方法;掌握紫外-可見分光光度法可用于定性的特征點；掌握紫外-可見分光光度法在定性分析中應(yīng)注意的事項；

04掌握紫外-可見分光度法定性分析的基本思路。2.實戰(zhàn)內(nèi)容（1）

維生素????????????概述維生素B12又叫鈷胺素，是唯一含金屬元素的維生素。本品為Coα-[α-（5,

6-二甲基苯并咪唑基）]

-Coβ氰鈷酰胺。按干燥品計算，含C63H88CoN14O14P不得少于96.0%。（2）紫外分光光度計定性鑒別維生素????????????的方法①

維生素B12吸收光譜上有三個吸收峰：（278±1）nm、（361±1）nm、（550±1）nm，三個吸收峰都可以根據(jù)吸收曲線掃描得到。按照定性分析方法對三個特征峰都要進行檢測，計算標準品和樣品三個吸收峰的特征值。②

對比吸收光譜的一致性：取樣品配制成與對照品濃度一致的待測液，上機分別描繪二者的吸收光譜，核對其一致性。項目實戰(zhàn)一3.儀器與試劑儀器：754型紫外-可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）。試劑：維生素B12標準品、維生素B1