細(xì)胞周期同步化常用的方法

細(xì)胞周期同步化常用的方法在一般培養(yǎng)條件下，群體中的細(xì)胞處于不同的細(xì)胞周期時(shí)相之中。為了研究某一時(shí)相細(xì)胞的代謝、增殖、基因表達(dá)或凋亡，常需采取一些方法使細(xì)胞處于細(xì)胞周期的同一時(shí)相，這就是細(xì)胞同步化技術(shù)。細(xì)胞同步化的方法有選擇同步化和誘導(dǎo)同步化，其中，選擇同步化常用的方法有有絲分裂選擇法和細(xì)胞沉降分離法。選用DNA合成抑制劑可逆地抑制S期細(xì)胞DNA合成而不影響其他細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)，最終可將細(xì)胞群體阻斷在G1/S期交界處；一些抑制微管聚合的藥物，因抑制有絲分裂裝置的形成和功能行使，可將細(xì)胞阻斷在有絲分裂中期，即使細(xì)胞同步于M期。一、M期同步化方法1．振蕩收集法該法利用M期細(xì)胞變圓易脫落的特點(diǎn)，將生長旺盛的貼壁細(xì)胞按一定的時(shí)間間隔振蕩，使M期細(xì)胞脫落，逐步收集培養(yǎng)基，并補(bǔ)充新的培養(yǎng)基。收集的細(xì)胞放4℃冰箱中保存，離心沉淀后即獲得M期細(xì)胞。2．秋水仙素阻抑法（1）將細(xì)胞傳代培養(yǎng)至指數(shù)生長期。（2）加入秋水仙胺，使最終濃度為0.05－0.1μg/mL培養(yǎng)基，作用6－7h。如使用秋水仙素，使用濃度應(yīng)加大5～10倍。（3）振蕩收集細(xì)胞，800r/min離心5－10min，棄上清，收集的沉淀細(xì)胞即為M期細(xì)胞。加入一定量培養(yǎng)基將細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶中或直接進(jìn)行離體實(shí)驗(yàn)。由于秋水仙素或秋水仙胺對(duì)細(xì)胞有一定毒性，用量較小或作用時(shí)間較短細(xì)胞活性尚可恢復(fù)，而用量過大或時(shí)間過長則細(xì)胞不能存活，因此使用時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制其劑量和作用時(shí)間。3．N2阻斷法此方法較秋水仙素阻抑法好（1）將細(xì)胞傳代培養(yǎng)至指數(shù)生長期。（2）將培養(yǎng)瓶置于N2罐中通入適量CO2（約相當(dāng)于罐中體積的5％）。（3）關(guān)閉好N2罐，接上N2管子及壓力表，緩緩向罐中充氣一直到壓力為80-90磅/英寸2為止。（4）將N2裝置放在37℃培養(yǎng)箱中10－16h（通常過夜）。次日從培養(yǎng)箱中取出，然后緩緩將N2放出（最好放出窗外）。（5）取出細(xì)胞在鏡下觀察同步化效果，用振蕩法收集細(xì)胞于離心管中。（6）800r/min離心10min收集細(xì)胞。二、S期同步化方法胸腺嘧啶核苷（TdR）雙阻斷法：該法利用過量TdR能阻礙DNA合成的原理而設(shè)計(jì)，為了加強(qiáng)細(xì)胞同步化效果，常采用兩次TdR阻斷法，即雙阻斷法。第1次阻斷時(shí)間相當(dāng)于G2、M和G1期時(shí)間的總和或稍長，釋放時(shí)間不短于S期時(shí)間，而小于G2+M+G1期時(shí)間，這樣才能使所有位于G1/S期的細(xì)胞通過S期，而又不使沿周期前進(jìn)最快的細(xì)胞進(jìn)入下一個(gè)S期。第2次阻斷時(shí)間同第1次，再釋放?，F(xiàn)以HeLa細(xì)胞為例加以說明（HeLa細(xì)胞周期時(shí)間為21h，其中G1期為10h，S期為7h，G2期為3h，M期為1h）。1．將細(xì)胞培養(yǎng)至指數(shù)生長期的早期。2．加入含2mmol/LTdR的培養(yǎng)基（2－2.5mmol/L用于腫瘤細(xì)胞的同步化培養(yǎng)），作用16h。3．棄掉TdR培養(yǎng)基，用Hanks液洗2－3次，再換上新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)溫浴9h。4．重新加入TdR培養(yǎng)基（濃度同上）進(jìn)行第2次阻斷，作用16h。5．再棄掉TdR培養(yǎng)基，Hanks液洗2－3次后換上普通培養(yǎng)基。第2次TdR釋放0h時(shí)取樣則細(xì)胞處于G1/S期交界處；如2－7h取樣則為不同階段的S期細(xì)胞。注意：具體TdR作用和釋放的時(shí)間應(yīng)參考每一種待同步化細(xì)胞的細(xì)胞周期各時(shí)相測(cè)定的參考值，也可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。三、G1期和G2期細(xì)胞的獲得1．G2期細(xì)胞的獲得根據(jù)細(xì)胞周期測(cè)定的數(shù)值，采用TdR雙阻斷法使細(xì)胞同步在G1/S期交界處后，洗去TdR使細(xì)胞釋放后繼續(xù)培養(yǎng)。其培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)大于S期時(shí)間而小于S+G2期時(shí)間。然后先用振蕩法使已進(jìn)入M期的細(xì)胞脫落，棄去上清培養(yǎng)基；再用胰酶消化，加入新鮮培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，離心收集細(xì)胞，即為G2期細(xì)胞。2．G1期細(xì)胞的獲得（1）將用M期阻斷法獲得的細(xì)胞加入一定量的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1－10h即可獲得各階段的G1期細(xì)胞。（2）用缺乏異亮氨酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)時(shí)間超過一個(gè)細(xì)胞周期，即可獲得中G1期細(xì)胞。四、G0期細(xì)胞的獲得可采用血清饑餓法得到G0期細(xì)胞。1．取處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞。2．用含0.5％－1％小牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞48－72h?；蛴脽o血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。3．用0.1％－0.25％胰蛋