馬鼻肺炎診斷技術(shù)

ICS11.220

CCSB41

中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

GB/TXXXXX—XXXX

馬鼻肺炎診斷技術(shù)

Diagnostictechniquesforequinerhinopneumonitis

點(diǎn)擊此處添加與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)一致性程度的標(biāo)識(shí)

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在提交反饋意見時(shí)，請(qǐng)將您知道的相關(guān)專利連同支持性文件一并附上。

（注：征求意見時(shí)必須保留這句話）

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實(shí)施

GB/TXXXXX—202X

馬鼻肺炎診斷技術(shù)

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了馬皰疹病毒-1型和-4型病毒分離鑒定、微量血清中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、熒光

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于馬屬動(dòng)物馬皰疹病毒-1型和4型的診斷、檢疫和監(jiān)測(cè)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

OIE陸生動(dòng)物診斷與疫苗手冊(cè)

GB/T18088出入境動(dòng)物檢疫采樣

3縮略語(yǔ)

下列縮略語(yǔ)適用于本文件

EHV-1：馬皰疹病毒-1型（Equineherpesvirus-1）

EHV-4：馬皰疹病毒-4型（Equineherpesvirus-4）

RK-13：兔腎細(xì)胞（Rabbitkidneycell）

Ederm：馬真皮成纖維細(xì)胞系（Equinedermiscell）

PBS：磷酸鹽緩沖生理鹽水（PhosphateBufferSaline）

CPE：細(xì)胞病變反應(yīng)（cytopathiceffect）

TCID50：半數(shù)組織感染量（mediantissuecultureinfectivedose）

ELISA：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-linkedImmunosorbentAssay）

OD值：光密度值（OpticalDensity）

RealtimePCR：熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time-PCR）

PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction）

CTAB:十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammoniumbromide）

4臨床癥狀

參見附錄B。

5病毒分離鑒定

5.1儀器設(shè)備

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GB/TXXXXX—202X

生物安全柜、二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、液氮儲(chǔ)存罐、高壓滅菌鍋、離心機(jī)、10mL注射器、

細(xì)胞培養(yǎng)瓶、微孔濾膜（0.45μm）、棉拭子采集棒、微量可調(diào)移液器（100μL、1000μL）。

5.2試劑與材料

MEM培養(yǎng)基、胰酶、青霉素、鏈霉素、PBS、RK-13細(xì)胞、馬成纖維細(xì)胞或原代馬胎兒腎細(xì)胞、馬皰

疹病毒-1型和-4型標(biāo)準(zhǔn)毒株等。

5.3樣品采集與處理

5.3.1樣品采集與運(yùn)送

按GB/T18088的規(guī)定執(zhí)行，無菌采集動(dòng)物鼻拭子或者鼻咽拭子（最好在發(fā)熱期）；或者抗凝血15～

20mL（出現(xiàn)神經(jīng)癥狀）；或者流產(chǎn)胎兒無菌采集肝、肺、胸腺、脾等樣品，采樣后，放入3mL預(yù)冷MEM；

立即送往檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室。所有樣品從運(yùn)輸至接種培養(yǎng)均應(yīng)在4℃下保存，不能在幾小時(shí)內(nèi)處理的樣品應(yīng)置

-70℃保存。

5.3.2樣品處理

5.3.2.1鼻咽拭子的處理：鼻咽拭子和3mL運(yùn)輸培養(yǎng)基放入滅菌的10mL注射器，轉(zhuǎn)動(dòng)注射器活塞，將

拭子中的液體擠到一滅菌試管中。擠出的液體一部分通過滅菌的0.45μm薄膜濾菌器濾入第2支無菌試

管，保存?zhèn)溆谩?/p>

5.3.2.2動(dòng)物組織樣品的處理：將肝、肺等組織混合，在無菌玻璃平皿中用解剖剪將組織塊剪碎成約1mm3

的小塊，加入含抗生素（附錄A.1）的無血清培養(yǎng)基，于組織研磨器中研磨，1000r/min離心10min，

吸出上清，備用。

5.3.2.3抗凝全血的處理：試管上下顛倒充分混合后，室溫靜置1小時(shí)以上，用PBS按照1:1的比例稀釋，

上下點(diǎn)掉混勻或用移液槍吹打混勻；在15mL離心管中，先加入3mL充分混勻的Ficoll液（1.077密度），

再沿著管壁小心加入2mL上述稀釋后的血液，血液和Ficoll液分層明顯為成功；1500r/min離心25min

后，棄上清，吸取中間層的白色薄膜層，用10mLPBS洗滌獲得的單個(gè)核細(xì)胞，1500r/min離心10min，

棄上清，重復(fù)洗滌一次并重懸細(xì)胞備用。

5.4病毒分離

5.4.1將5.3.2中樣品處理液取0.5mL接種到25cm2單層細(xì)胞上，5%二氧化碳培養(yǎng)箱37℃孵育1h，移

去上清液，細(xì)胞單層用PBS沖洗2次，加入10mL維持液（附錄A.2），繼續(xù)孵育7d或直到出現(xiàn)CPE為止。

5.4.2如果不出現(xiàn)CPE，應(yīng)盲傳1代～2代，即將細(xì)胞培養(yǎng)物凍融2次，再接種到單層細(xì)胞培養(yǎng)5-7d。

5.5結(jié)果判定

檢查各種對(duì)照試驗(yàn)，細(xì)胞對(duì)照正常，無CPE；陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)明顯的CPE，說明試驗(yàn)成立。如果試驗(yàn)組

出現(xiàn)明顯的CPE，表現(xiàn)為細(xì)胞圓縮、脫落、裂解，則判為病毒分離陽(yáng)性；如果沒有明顯的CPE，則判為陰

性。

5.6病毒鑒定

用PCR或熒光PCR方法對(duì)分離的病毒進(jìn)行鑒定。

6微量血清中和試驗(yàn)

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GB/TXXXXX—202X

6.1儀器設(shè)備

生物安全柜、二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、液氮儲(chǔ)存罐、高壓滅菌鍋、微量細(xì)胞培養(yǎng)板（96孔）、

微量可調(diào)移液器（100μL）、細(xì)胞瓶和吸管（1mL、10mL）等。

6.2試劑與材料

MEM培養(yǎng)基、胰酶、青霉素、鏈霉素、PBS、RK-13、Ederm或肺組織成纖維細(xì)胞系、馬皰疹病毒-1

型和-4型標(biāo)準(zhǔn)毒株、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、陰性血清和被檢血清經(jīng)滅活備用（馬血清56℃滅活30min，驢、

騾血清60℃滅活30min）等。

6.3操作方法

6.3.1中和病毒滴度

6.3.1.1中和病毒制備：將保持于液氮中的標(biāo)準(zhǔn)種毒株取出置于4℃緩慢融化，將融化的種毒用維持液

（見附錄A.2）做60倍稀釋后，取1mL接種于長(zhǎng)成單層RK-13(EHV-1)或E-Derm（EHV-4）細(xì)胞的細(xì)胞瓶中，

37℃吸附1h，然后，先用維持液洗滌一次，再加入維持液，37℃培養(yǎng)36～48h，當(dāng)50%-75%細(xì)胞出

現(xiàn)CPE，即可收獲病毒培養(yǎng)液，分裝成1mL后凍存（-70℃）備用。

6.3.1.2病毒滴度測(cè)定：在微量細(xì)胞培養(yǎng)板（96孔）每孔加25μL細(xì)胞培養(yǎng)液（見附錄A.3），用病毒

稀釋液將凍存病毒做10-1,10-2…10-8系列稀釋。每孔100μL細(xì)胞（5105個(gè)/mL），置37℃培養(yǎng)，48h

后初判，72h終判。如細(xì)胞對(duì)照正常，接種病毒的細(xì)胞出現(xiàn)CPE，記錄試驗(yàn)數(shù)據(jù)。根據(jù)Karber法計(jì)算該

批病毒的毒價(jià)。

6.3.2微量中和試驗(yàn)

6.3.2.1在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上每孔加25μL無血清的MEM。取每一被檢血清25μL,加于A排和B排兩重復(fù)

孔內(nèi)。第1排作為血清毒性對(duì)照，第2排是被檢血清的第1次稀釋。從B排開始向下做倍比稀釋，即混合后

取25μL,加入下一孔，充分混合，同法依次稀釋，直至最后一孔。每板可測(cè)定6個(gè)血清樣。

6.3.2.2每孔加25μL適當(dāng)稀釋的EHV-1或EHV-4病毒（100TCID50/孔），A排除外。血清的最終稀釋度

在加入病毒后為1/4到1/256。

6.3.2.3另取一對(duì)照板，應(yīng)包括滴定已知滴度的陰性和陽(yáng)性馬血清對(duì)照、細(xì)胞對(duì)照、病毒對(duì)照和用于計(jì)

算實(shí)驗(yàn)中病毒精確用量的病毒滴定驗(yàn)證。

6.3.2.4細(xì)胞培養(yǎng)板放置于5%CO237℃培養(yǎng)箱中孵育1h。

6.3.2.5每孔加50uL備好的E-Derm或RK-13細(xì)胞懸液，5%CO237℃培養(yǎng)箱中孵育4～5d。

6.3.2.6顯微鏡下觀察CPE，記錄試驗(yàn)結(jié)果。

6.4結(jié)果判定

6.4.1檢查各種對(duì)照試驗(yàn)，細(xì)胞對(duì)照正常，無CPE；陰性性血清出現(xiàn)CPE，陽(yáng)性血清無CPE。病毒滴度驗(yàn)

證時(shí)滴度與原測(cè)定滴度相差應(yīng)在0.3log10范圍內(nèi)，說明病毒稀釋濃度符合微量血清中和試驗(yàn)的工作濃

度。計(jì)算每份被檢血清的中和滴度，對(duì)比兩份血清滴度是否增加4倍以上。

7酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

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GB/TXXXXX—202X

7.1儀器設(shè)備

酶標(biāo)儀、96孔酶標(biāo)板、單孔道和多孔道可調(diào)微量移液器（1μL、100μL）、洗板機(jī)等。

7.2試劑與材料

抗原、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、陰性血清、被檢血清、PBS、包被緩沖液、封閉液、洗滌液、底物溶液、終

止液、脫脂奶粉、H2O2和酶標(biāo)羊抗馬二抗等，試劑配制見附錄A.4-A.9。

7.3操作方法

7.3.1按照包被抗原所附說明書要求，用包被緩沖液稀釋抗原，包被96孔酶標(biāo)板，每孔100μL，置4℃

過夜。

7.3.2用洗液洗板3次，洗好的板在濾紙上拍干。（洗液濃縮液用前稀釋50倍）

7.3.3加入封閉液，每孔200μL，置37℃孵育90min，洗板3次。置4℃冰箱備用。

7.3.4陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和待檢血清樣品各100μL依次加入每孔（設(shè)置復(fù)孔），室溫（21℃-25℃）

孵育1h。

7.3.5用洗液洗板3次，洗好的板在濾紙上拍干。（洗液濃縮液用前稀釋50倍）

7.3.6每孔加入酶標(biāo)結(jié)合物100μL，室溫（21℃-25℃）孵育30min。

7.3.7用洗液洗板3次，洗好的板在濾紙上拍干。（洗液濃縮液用前稀釋50倍）

7.3.8每孔加100μL底物溶液,避光室溫放置10分鐘。

7.3.9每孔加入100μL終止液。

7.3.10酶標(biāo)儀先用空氣調(diào)空白后，405nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。

7.4結(jié)果判定

試驗(yàn)有效性：陽(yáng)性對(duì)照孔OD值平均值≥1.00；

陰性對(duì)照孔OD值平均值≤0.3。

待測(cè)樣品的S/P值按下式計(jì)算：

樣品平均OD值-陰性對(duì)照平均OD值

S/P值=

陽(yáng)性對(duì)照平均OD值-陰性對(duì)照平均OD值

待檢樣品S/P值≥0.3時(shí)判為抗體陽(yáng)性；待檢樣品S/P值＜0.3時(shí)判為抗體陰性。

也可選用其他商品化試劑盒，按照使用說明書進(jìn)行操作和結(jié)果判定。

8熒光PCR檢測(cè)方法

8.1儀器設(shè)備

熒光PCR擴(kuò)增儀、臺(tái)式離心機(jī)、混勻器、微量移液器和吸頭（1000μL/200μL/20μL/10μL）、冰

箱（4℃、-20℃，-70℃）、玻璃勻漿器（20ml）、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、剪刀、鑷子。

8.2試劑與材料

1%CTAB、抽提液Ⅰ：1mol/LTris飽和酚：三氯甲烷：異戊醇=25:24:1混合（密閉避光保存）、抽

提液Ⅱ：三氯甲烷：異戊醇=24:1比例混合（密閉避光保存）、無水乙醇、DNA抽提試劑盒、熒光PCR反

應(yīng)試劑盒、DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

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8.3引物

引物名稱序列

EHV1FGGGGTTCTTAATTGCATTCAGACC

EHV1RGTAGGTGCGGTTAGATCTCACAAG

EHV1PFAM-TCTCCAACGAACTCGCCAGGCTGTACC-BHQ1

EHV4FTAGCAAACACCCACTAATAATAGCAAG

EHV4RGCTCAAATCTCTTTATTTTATGTCATATGC

EHV4PJOE-CGGAACAGGAACTCACTTCAGAGCCAGC-BHQ1

8.4操作方法

8.4.1采樣及樣品處理

同5.3.1和5.3.2。

8.4.2DNA抽提

使用酚氯仿法或者與之同等效果的QIAGENDNA抽提試劑盒。

8.4.2.1酚氯仿法：

將200μL組織懸液，放入1.5mL離心管，再加入CTAB溶液；首先加入600μL抽提液Ⅰ，充分混合

至少30s；12000r/min離心5min，取上層水相；再加700μL抽提液Ⅱ，充分混合30s；12000r/min

離心5min，取上層水相（約600μL）；然后加入1.5倍體積的無水乙醇（約900μL），混勻后，-20℃

放置6h以上；12000r/min離心10min，棄上清，室溫干燥20min，最后加20μLDEPC水（附錄A.10）溶

解，作為PCR模板。

8.4.2.2QIAGENDNA抽提試劑盒：

取50-100μL組織懸液，加入20μL蛋白酶K，然后加入PBS至220μL；加入200μL溶液AL，振蕩均

勻，56℃溫育10min；加入200μL無水乙醇，振蕩均勻；把試劑盒中配置的Spin-Column裝在2mL收集

管中，把上述混合液加入到Spin-Column里，8000rpm（6000g），離心1min；棄濾液，加500μL溶液

AW1，8000rpm（6000g），離心1min；棄濾液，加500μL溶液AW2，14000rpm（20000g），離心3min；

小心地把Spin-Column轉(zhuǎn)移到新的1.5mL離心管中，加200μL溶液AE，室溫放置1min，8000rpm（6000g），

離心1min；

8.4.4熒光PCR檢測(cè)

8.4.4.1熒光PCR擴(kuò)增

從試劑盒中取出相應(yīng)的各種試劑，在室溫下融合后，按照熒光PCR反應(yīng)試劑配制反應(yīng)體系。反應(yīng)條

件：95℃5m→95℃15s,60℃30s，40個(gè)循環(huán)收集熒光。

8.4.4.2結(jié)果判定

陰性對(duì)照無Ct值并且無擴(kuò)增曲線；

陽(yáng)性對(duì)照的Ct值應(yīng)≤30，并且出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線；

若樣品孔無Ct值并且無擴(kuò)增曲線，表明樣品中無馬皰疹病毒。

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GB/TXXXXX—202X

若樣品孔Ct值≤30，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，表明樣品中存在馬皰疹病毒。

9PCR檢測(cè)方法

EHV-1型和EHV-4型PCR檢測(cè)方法按照GB/T27621-2011執(zhí)行。

10綜合判定

根據(jù)臨床癥狀和病理變化只可作出初步診斷，確認(rèn)應(yīng)依靠實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。對(duì)于未接種過疫苗的動(dòng)物，

經(jīng)任何一種方法檢測(cè)呈陽(yáng)性結(jié)果時(shí)都可最終判定為陽(yáng)性；對(duì)于接種疫苗并在疫苗免疫期內(nèi)的動(dòng)物，當(dāng)病

毒分離或PCR檢測(cè)為陽(yáng)性結(jié)果時(shí)，可終判為陽(yáng)性，當(dāng)血清學(xué)試驗(yàn)為陽(yáng)性結(jié)果時(shí)，應(yīng)間隔14天重新采樣，

抗體滴度升高4倍及4倍以上的，可判定為新近感染，抗體穩(wěn)定或下降的為疫苗接種產(chǎn)生的抗體。

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附錄A

（規(guī)范性）

試劑配制

A.1抗生素貯存液

用滅菌三蒸水配成每毫升10000IU青霉素和10mg鏈霉素的抗生素貯存液，用微孔濾膜（0.22μm）過

濾除菌，分裝成2mL/瓶，-20℃凍存?zhèn)溆?。保存期不超過60d。

A.2細(xì)胞維持液

含2%滅活的無菌胎牛血清（FBS）的MEM培養(yǎng)基。

A.3細(xì)胞培養(yǎng)液

含10%滅活的無菌胎牛血清（FBS）的MEM培養(yǎng)基。

A.4包被液（0.05mol/L碳酸鹽緩沖液，pH9.6）

碳酸鈉（Na2CO3,分析純）1.59g

碳酸氫鈉（NaHCO3,分析純）2.93g

蒸餾水加至1000mL

溶解后，調(diào)節(jié)pH值至9.6，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

A.5PBS液（0.01mol/LPBS，pH7.4）

磷酸二氫鉀（KH2PO4,分析純）0.2g

磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O,分析純）2.9g

氯化鈉（NaCl,分析純）8.0g

氯化鉀（KCl,分析純）0.2g

蒸餾水加至1000mL

溶解后，調(diào)節(jié)pH值至7.4，保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

A.6PBST洗滌液（含0.01mol/LPBS-0.05%吐溫-20，PH7.4）

磷酸二氫鉀（KH2PO4,分析純）0.2g

磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O,分析純）2.9g

氯化鈉（NaCl,分析純）8.0g

氯化鉀（KCl,分析純）0.2g

吐溫-20（分析純）0.5mL

蒸餾水加至1000mL

溶解后，調(diào)節(jié)pH值至7.4，現(xiàn)用現(xiàn)配。

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A.7封閉液

脫脂乳5g，加PBST定容至100mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。

A.8底物顯色液（TMB-過氧化氫尿素溶液）

A.8.1底物液A

TMB（分析純）200mg

無水乙醇（或DMSO）100mL

蒸餾水加至1000mL

A.8.2底物緩沖液B

磷酸氫二鈉（分析純）71.7g

檸檬酸（分析純）9.33g

0.75%過氧化氫尿素6.4mL

蒸餾水加至1000mL

調(diào)pH值至5.0～5.4。

A.8.3制法

將底物A液和底物緩沖液B按1:1混合，即成底物顯色液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

A.9終止液（2mol/L硫酸溶液）

取分析純濃硫酸（含量95%～98%）22.2mL緩緩加入到177.8mL蒸餾水中，混勻即成2mol/LH2SO4

終止液。

A.10焦炭酸二乙酯處理水（DEPC水）

超純水100mL

DEPC100μL

混合后室溫放置過夜，121℃高壓滅菌15min，或直接購(gòu)買商品化的產(chǎn)品。

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附錄B

（資料性）

臨床癥狀

EHV-1和EHV-4感染馬匹后可引起不同類型的疾病，主要有如下4種類型。

1)呼吸道疾病

潛伏期為2～4d，個(gè)別的可達(dá)1周。EHV-1和EHV-4都可引起此類疾病。常見的臨床癥狀是鼻肺炎，

病駒體溫升高達(dá)39.5～41℃之間,流多量漿液乃至粘膿性鼻汁,鼻部粘膜和眼結(jié)膜充血。在體溫升高的

同時(shí)，白細(xì)胞數(shù)量減少。病程可持續(xù)1～3周。幼駒有時(shí)發(fā)生病毒性支氣管肺炎。繼發(fā)細(xì)菌感染后可導(dǎo)

致經(jīng)濟(jì)損失。但多數(shù)病例呈隱性型感染，往往不被察覺。

剖檢時(shí)主要見全身各粘膜潮紅、腫脹和出血，肝臟、腎臟及心臟呈實(shí)質(zhì)變性，脾臟及淋巴結(jié)呈中等

度腫脹等敗血性變化。在氣管、胃和小腸中有膠胨樣粘膜皺壁，小腸的孤立淋巴濾泡和集合淋巴結(jié)腫

大，有些地方出現(xiàn)淺表性爛斑或較深的潰瘍。少數(shù)病例可見支氣管肺炎，呈現(xiàn)支氣管及肺泡上皮增生、

壞死及脫落。幼齡馬在整個(gè)上呼吸道粘膜上出現(xiàn)明顯的皰疹性病變。組織學(xué)檢查可見呼吸道上皮細(xì)胞和

淋巴結(jié)生發(fā)中心顯著壞死，并可看到典型的A型嗜伊紅核內(nèi)包涵體。

2)流產(chǎn)和新生幼駒疾病

現(xiàn)已在世界范圍內(nèi)確認(rèn)了EHV-1是一種重要的流產(chǎn)病原，其引發(fā)的流產(chǎn)中有95%是發(fā)生在妊娠期的

后4個(gè)月.潛伏期長(zhǎng)短不一，為9d至4個(gè)月之間。此外，因潛伏病毒的激活，母馬在初次感染的數(shù)

月或數(shù)年后發(fā)生流產(chǎn)。懷孕母馬的感染常不被察覺，有時(shí)出現(xiàn)腿部腫脹，食欲減退。懷孕母馬突然發(fā)生

不明原因的流產(chǎn)，無胎衣滯留現(xiàn)象。流產(chǎn)后的病馬能夠很快恢復(fù)正常，也不影響以后的配種。在妊娠

期的前6個(gè)月流產(chǎn)的胎兒常發(fā)生自溶現(xiàn)象，暴發(fā)流行時(shí)，會(huì)引起50%的損失。有些接近臨產(chǎn)期的母馬被

感染后，胎兒產(chǎn)出時(shí)即呈昏睡狀，虛弱不能站立吮乳，有黃疸和呼吸道癥狀，常在數(shù)天內(nèi)死亡。EHV-4

僅偶爾引發(fā)流產(chǎn)。成年馬或妊娠馬患病后，臨床表現(xiàn)遠(yuǎn)較幼駒輕微，僅個(gè)別病馬有一過性體溫升高。但

妊娠母馬感染后可導(dǎo)致流產(chǎn)，通常在流產(chǎn)前妊娠馬無前驅(qū)癥狀。

早期流產(chǎn)的胎兒發(fā)生嚴(yán)重的自溶，后期的流產(chǎn)胎兒具有特征性病理變化。體表外觀新鮮，皮下常有

不同程度的水腫和出血，可視粘膜黃染。心肌出血，肺水腫和胸、腹水增量，脾臟腫大。肝包膜下散

在針尖大到粟粒大灰黃色壞死灶，是本病的主要眼觀特征。流產(chǎn)胎兒的胎衣不見明顯變化，多呈黃疸

色。組織學(xué)檢查時(shí)，在肝臟和肺臟壞死區(qū)周圍以及有病變的腎臟血管球、腸上皮和心肌中，可檢出A型

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GB/TXXXXX—202X

嗜伊紅核內(nèi)包涵體。新生幼駒的主要病理變化為間質(zhì)肺炎、肺膨脹不全和肺水腫。組織學(xué)檢查可見廣

泛的胸腺實(shí)質(zhì)壞死，胸腺和脾臟的淋巴細(xì)胞減少。

3)神經(jīng)系統(tǒng)疾病

EHV-1偶爾引起馬的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，并有逐漸增多的趨勢(shì)。所有年齡的馬均可感染，以妊娠母馬和

哺乳母馬易感。潛伏期為6～10d。自然感染EHV-1引發(fā)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病與流產(chǎn)和呼吸道疾病有關(guān)，常

無前驅(qū)癥狀。感染馬的癥狀表現(xiàn)不一，有的出現(xiàn)輕度的運(yùn)動(dòng)失調(diào)，有的則呈現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)癥狀，表現(xiàn)為

前肢、后肢和腰部僵硬麻痹以至癱瘓不能起立，尾巴和膀胱失禁，會(huì)陰部痛覺減退或消失。輕度感染馬

很快趨于穩(wěn)定，在數(shù)天或數(shù)周內(nèi)完全恢復(fù)。感染嚴(yán)重的馬匹不能站立，常因繼發(fā)感染而死亡或被撲殺，

完全恢復(fù)的可能性極小。

組織學(xué)檢查可在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中見到脈管炎、充血、血栓和繼發(fā)性肌肉變性。

4)嗜肺臟血管型

年輕成年馬出現(xiàn)了一種新的散發(fā)性EHV-1感染類型，病毒的主要靶細(xì)胞是肺臟的內(nèi)皮細(xì)胞。嚴(yán)重感

染的馬匹因呼吸道疾病死亡。

病變表現(xiàn)為肺臟的動(dòng)脈炎、出血和水腫。在上皮細(xì)胞、咽部淋巴小葉的樹突樣細(xì)胞、咽部腺體上皮

細(xì)胞、隱窩腸上皮細(xì)胞和單核細(xì)胞的胞核和胞漿中可檢測(cè)到EHV-1抗原。

_________________________________

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GB/TXXXXX—202X

前言

本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2020給出的規(guī)則起草。

請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專利的責(zé)任。

本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提出。

本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（SAC/TC181）歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：上海海關(guān)動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，青島海關(guān)檢驗(yàn)檢

疫技術(shù)中心、江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：王艷、劉建華、朱來華、胡月、鄭曉龍、武彩紅、馮之航、蔡一村、薛俊欣、

林穎崢、張強(qiáng)、王群。

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GB/TXXXXX—202X

馬鼻肺炎診斷技術(shù)

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了馬皰疹病毒-1型和-4型病毒分離鑒定、微量血清中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、熒光

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于馬屬動(dòng)物馬皰疹病毒-1型和4型的診斷、檢疫和監(jiān)測(cè)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

OIE陸生動(dòng)物診斷與疫苗手冊(cè)

GB/T18088出入境動(dòng)物檢疫采樣

3縮略語(yǔ)

下列縮略語(yǔ)適用于本文件

EHV-1：馬皰疹病毒-1型（Equineherpesvirus-1）

EHV-4：馬皰疹病毒-4型（Equineherpesvirus-4）

RK-13：兔腎細(xì)胞（Rabbitkidneycell）

Ederm：馬真皮成纖維細(xì)胞系（Equinedermiscell）

PBS：磷酸鹽緩沖生理鹽水（PhosphateBufferSaline）

CPE：細(xì)胞病變反應(yīng)（cytopathiceffect）

TCID50：半數(shù)組織感染量（mediantissuecultureinfectivedose）

ELISA：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-linkedImmunosorbentAssay）

OD值：光密度值（OpticalDensity）

RealtimePCR：熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time-PCR）

PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction）

CTAB:十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammoniumbromide）

4臨床癥狀

參見附錄B。

5病毒分離鑒定

5.1儀器設(shè)備

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生物安全柜、二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、液氮儲(chǔ)存罐、高壓滅菌鍋、離心機(jī)、10mL注射器、

細(xì)胞培養(yǎng)瓶、微孔濾膜（0.45μm）、棉拭子采集棒、微量可調(diào)移液器（100μL、1000μL）。

5.2試劑與材料

MEM培養(yǎng)基、胰酶、青霉素、鏈霉素、PBS、RK-13細(xì)胞、馬成纖維細(xì)胞或原代馬胎兒腎細(xì)胞、馬皰

疹病毒-1型和-4型標(biāo)準(zhǔn)毒株等。

5.3樣品采集與處理

5.3.1樣品采集與運(yùn)送

按GB/T18088的規(guī)定執(zhí)行，無菌采集動(dòng)物鼻拭子或者鼻咽拭子（最好在發(fā)熱期）；或者抗凝血15～

20mL（出現(xiàn)神經(jīng)癥狀）；或者流產(chǎn)胎兒無菌采集肝、肺、胸腺、脾等樣品，采樣后，放入3mL預(yù)冷MEM；

立即送往檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室。所有樣品從運(yùn)輸至接種培養(yǎng)均應(yīng)在4℃下保存，不能在幾小時(shí)內(nèi)處理的樣品應(yīng)置

-70℃保存。

5.3.2樣品處理

5.3.2.1鼻咽拭子的處理：鼻咽拭子和3mL運(yùn)輸培養(yǎng)基放入滅菌的10mL注射器，轉(zhuǎn)動(dòng)注射器活塞，將

拭子中的液體擠到一滅菌試管中。擠出的液體一部分通過滅菌的0.45μm薄膜濾菌器濾入第2支無菌試

管，保存?zhèn)溆谩?/p>

5.3.2.2動(dòng)物組織樣品的處理：將肝、肺等組織混合，在無菌玻璃平皿中用解剖剪將組織塊剪碎成約1mm3

的小塊，加入含抗生素（附錄A.1）的無血清培養(yǎng)基，于組織研磨器中研磨，1000r/min離心10min，

吸出上清，備用。

5.3.2.3抗凝全血的處理：試管上下顛倒充分混合后，室溫靜置1小時(shí)以上，用PBS按照1:1的比例稀釋，

上下點(diǎn)掉混勻或用移液槍吹打混勻；在15mL離心管中，先加入3mL充分混勻的Ficoll液（1.077密度），

再沿著管壁小心加入2mL上述稀釋后的血液，血液和Ficoll液分層明顯為成功；1500r/min離心25min

后，棄上清，吸取中間層的白色薄膜層，用10mLPBS洗滌獲得的單個(gè)核細(xì)胞，1500r/min離心10min，

棄上清，重復(fù)洗滌一次并重懸細(xì)胞備用。

5.4病毒分離

5.4.1將5.3.2中樣品處理液取0.5mL接種到25cm2單層細(xì)胞上，5%二氧化碳培養(yǎng)箱37℃孵育1h，移

去上清液，細(xì)胞單層用PBS沖洗2次，加入10mL維持液（附錄A.2），繼續(xù)孵育7d或直到出現(xiàn)CPE為止。

5.4.2如果不出現(xiàn)CPE，應(yīng)盲傳1代～2代，即將細(xì)胞培養(yǎng)物凍融2次，再接種到單層細(xì)胞培養(yǎng)5-7d。

5.5結(jié)果判定

檢查各種對(duì)照試驗(yàn)，細(xì)胞對(duì)照正常，無CPE；陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)明顯的CPE，說明試驗(yàn)成立。如果試驗(yàn)組

出現(xiàn)明顯的CPE，表現(xiàn)為細(xì)胞圓縮、脫落、裂解，則判為病毒分離陽(yáng)性；如果沒有明顯的CPE，則判為陰

性。

5.6病毒鑒定

用PCR或熒光PCR方法對(duì)分離的病毒進(jìn)行鑒定。

6微量血清中和試驗(yàn)

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GB/TXXXXX—202X

6.1儀器設(shè)備

生物安全柜、二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、液氮儲(chǔ)存罐、高壓滅菌鍋、微量細(xì)胞培養(yǎng)板（96孔）、

微量可調(diào)移液器（100μL）、細(xì)胞瓶和吸管（1mL、10mL）等。

6.2試劑與材料

MEM培養(yǎng)基、胰酶、青霉素、鏈霉素、PBS、RK-13、Ederm或肺組織成纖維細(xì)胞系、馬皰疹病毒-1

型和-4型標(biāo)準(zhǔn)毒株、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、陰性血清和被檢血清經(jīng)滅活備用（馬血清56℃滅活30min，驢、

騾血清60℃滅活30min）等。

6.3操作方法

6.3.1中和病毒滴度

6.3.1.1中和病毒制備：將保持于液氮中的標(biāo)準(zhǔn)種毒株取出置于4℃緩慢融化，將融化的種毒用維持液

（見附錄A.2）做60倍稀釋后，取1mL接種于長(zhǎng)成單層RK-13(EHV-1)或E-Derm（EHV-4）細(xì)胞的細(xì)胞瓶中，

37℃吸附1h，然后，先用維持液洗滌一次，再加入維持液，37℃培養(yǎng)36～48h，當(dāng)50%-75%細(xì)胞出

現(xiàn)CPE，即可收獲病毒培養(yǎng)液，分裝成1mL后凍存（-70℃）備用。

6.3.1.2病毒滴度測(cè)定：在微量細(xì)胞培養(yǎng)板（96孔）每孔加25μL細(xì)胞培養(yǎng)液（見附錄A.3），用病毒

稀釋液將凍存病毒做10-1,10-2…10-8系列稀釋。每孔100μL細(xì)胞（5105個(gè)/mL），置37℃培養(yǎng)，48h

后初判，72h終判。如細(xì)胞對(duì)照正常，接種病毒的細(xì)胞出現(xiàn)CPE，記錄試驗(yàn)數(shù)據(jù)。根據(jù)Karber法計(jì)算該

批病毒的毒價(jià)。

6.3.2微量中和試驗(yàn)

6.3.2.1在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上每孔加25μL無血清的MEM。取每一被檢血清25μL,加于A排和B排兩重復(fù)

孔內(nèi)。第1排作為血清毒性對(duì)照，第2排是被檢血清的第1次稀釋。從B排開始向下做倍比稀釋，即混合后

取25μL,加入下一孔，充分混合，同法依次稀釋，直至最后一孔。每板可測(cè)定6個(gè)