(高清版)GBT 41522-2022 三種犬病病毒基因芯片檢測方法

三種犬病病毒基因芯片檢測方法國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)I本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由全國生物芯片標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC421)歸口。本文件起草單位：中國海關(guān)科學(xué)技術(shù)研究中心、博奧生物集團(tuán)有限公司、北京農(nóng)學(xué)院、上海海關(guān)動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心。1三種犬病病毒基因芯片檢測方法本文件描述了同時(shí)檢測三種犬病病毒(CDV、CPV和CAV-1)的微陣列基因芯片檢測方法和微流控芯片檢測方法。本文件適用于待測對象鼻拭子、糞拭子、血漿、血清及臟器肌肉組織等樣品中三種病毒核酸的同時(shí)2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T27401實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范動(dòng)物檢疫GB/T40458—2021用于病原微生物高通量檢測的核酸提取技術(shù)規(guī)范3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。下列縮略語適用于本文件。BSA:牛血清白蛋白(BovineSerumAlbumin)CAV-1:犬1型腺病毒(Canineadenovirus-1)cDNA:互補(bǔ)DNA(ComplementaryDeoxyribonucleicAcid)CDV:犬瘟熱病毒(CanineDistempervirus)CPV:犬細(xì)小病毒(CanineParvovirus)DEPC:焦碳酸二乙酯(DiethylPyrocarbonate)DNA:脫氧核糖核酸(DeoxyribonucleicAcid)dNTPs:核苷三磷酸(NucleosideTriphosphate)DMSO:二甲基亞砜(DimethylSulfoxide)DTT:二硫蘇糖醇(Dithiothreitol)EDTA:乙二胺四乙酸(EthyleneDiamineTetraaceticAcid)PBS:磷酸緩沖鹽溶液(PhosphateBufferedSaline)PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction)RNA:核糖核酸(RibonucleicAcid)2RNase:核糖核酸酶(Ribonuclease)Rnasin:核糖核酸酶抑制劑(RibonucleaseInhibitor)RT-PCR:反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(ReverseTranscriptionPolymeraseChainReaction)SDS:十二烷基磺酸鈉(SodiumDodecylSulfate)SSC:檸檬酸鈉緩沖液(CitricacdSodiumCitrateBuffer)Tris-HCL:三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液(TRISHydrochloride)5原理在序列比對基礎(chǔ)上，分別針對CDV、CPV和CAV-1保守區(qū)設(shè)計(jì)合成引物和探針。對于三種犬病病毒的微陣列基因芯片檢測方法，用點(diǎn)樣儀將長度為20nt左右的寡核苷酸探針，點(diǎn)制在醛基化玻璃基片上。對待檢樣品進(jìn)行檢測時(shí)，先用引物將樣品中存在的病毒核酸保守區(qū)擴(kuò)增出來，再通過標(biāo)記PCR將熒光染料Cy-3或Cy-5標(biāo)記在擴(kuò)增產(chǎn)物上，當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物與芯片雜交后，雜交位點(diǎn)就會(huì)發(fā)出熒光信號，通過芯片掃描儀捕獲熒光信號，從而確定樣品中是否含有這三種犬病病毒核酸。對于三種犬病病毒的微流控芯片檢測方法，將引物分別固定在微流控芯片相應(yīng)位置后，對微流控芯片進(jìn)行封裝，將提取的核酸模板與反應(yīng)液(包含熒光物質(zhì))混合反應(yīng)后，加入封裝好的微流控芯片中，之后放入帶有離心功能、恒溫功能及實(shí)時(shí)熒光檢測一體化的微流控芯片檢測儀中，利用離心力驅(qū)動(dòng)樣品進(jìn)入微流控芯片反應(yīng)孔，進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增。若樣本中含有目的片段，則能夠得到恒溫?cái)U(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與熒光物質(zhì)進(jìn)行有效的結(jié)合，通過熒光檢測儀實(shí)時(shí)捕獲熒光信號，直觀反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光信號的出現(xiàn)時(shí)間、強(qiáng)度和位置，判斷樣本中是否含有相應(yīng)的病毒核酸。6儀器與材料6.1儀器6.1.1芯片點(diǎn)樣儀。6.1.2芯片掃描儀。6.1.3微流控芯片檢測儀。6.1.5純水儀。6.1.6芯片雜交盒。6.1.7高速微型離心機(jī)(離心速度12000r/min以上)。6.1.8臺式高速離心機(jī)(離心速度3000r/min以上)。6.1.9旋渦振蕩儀。6.1.10恒溫干燥箱。6.1.11旋渦振蕩儀。6.1.12微量點(diǎn)樣儀。6.2試劑和耗材6.2.1總則：除特別說明以外，本文件所用試劑均為分析純，水為按照GB/T6682規(guī)定的三級水，所有試劑均用無RNase污染的容器分裝。36.2.2陰性對照、陽性對照和微流控芯片內(nèi)參對照的成分如下?！栃詫φ眨簭年栃詷颖局刑崛〉暮怂?，或人工合成的含有目標(biāo)核酸序列的DNA片段。——內(nèi)參對照：包括擴(kuò)增內(nèi)參基因片段的引物和人工合成的內(nèi)參質(zhì)粒，其中引物固定于微流控芯片反應(yīng)孔中，內(nèi)參質(zhì)粒存在于反應(yīng)液中。6.2.3PBS(應(yīng)符合附錄A的規(guī)定):121℃,15min高壓滅菌冷卻后，無菌條件下加入青霉素、鏈霉素尿素，1%吐溫-20。液三和洗脫液等。也可以使用其他等效核酸提取試劑或者將DNA或RNA分別提取的試劑。6.2.675%乙醇：用新開啟的無水乙醇和DEPC水(符合GB/T6682要求)配制，—20℃預(yù)冷。6.2.7微陣列芯片檢測緩沖液配制、引物、探針序列、反應(yīng)液體系、雜交液體系組成、芯片制作及使用注意事項(xiàng)應(yīng)符合附錄A和附錄B中表B.1～表B.3的規(guī)定。6.2.8微流控芯片反應(yīng)液：20mmol/LTris-HCl(pH8.8),10mmol/LKCl,10mmol/L(NH?)?SO?,6.2.9微流控芯片：5μL/反應(yīng)池，8樣本的離心微流控芯片。CPV、CDV和CAV-1引物應(yīng)符合附錄C中表C.2～表C.4的規(guī)定。微流控芯片試劑組分和存放條件應(yīng)符合表C.1的規(guī)定。微流控芯片制作與質(zhì)量控制相關(guān)示例見附錄D。RNase離心管(1.5mL、2mL)等。7試驗(yàn)方法7.1樣品所有測試樣品的采集、保存和運(yùn)輸應(yīng)按照GB/T27401的規(guī)定執(zhí)行。7.1.2采樣工具缽等。取鼻拭子和糞拭子，采集方法如下：——取鼻拭子時(shí)將拭子深入鼻腔來回刮2次～3次并旋轉(zhuǎn)，粘取鼻腔分泌液；——取糞拭子時(shí)將拭子深入肛門旋轉(zhuǎn)一圈并沾取少量糞便。將采樣后的拭子分別放入盛有1.0mLPBS的1.5mL離心管中，加蓋、編號。用無菌剪刀、鑷子采集病死動(dòng)物實(shí)質(zhì)臟器和肌肉組織，裝入一次性無菌樣品袋或其他滅菌容器，4編號。用無菌注射器直接吸取至無菌離心管中，編號備用。樣品采集后，放入密閉的塑料袋內(nèi)(一個(gè)采樣點(diǎn)的樣品放一個(gè)塑料袋),采集的樣品置保溫箱中，加采集或處理好的樣品在2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過24h;若需長期保存，應(yīng)放置于一70℃冰箱，避免反復(fù)凍融(凍融不超過3次)。樣品在混合器上充分混合后，用滅菌鑷子將拭子中的液體擠出，3000r/min離心5min,吸取上清液1mL轉(zhuǎn)入無菌的1.5mL離心管中備用。取待檢樣品2.0g于潔凈、滅菌并烘干的研缽中充分研磨，加10mLPBS混勻，取上清液1mL轉(zhuǎn)入無菌的1.5mL離心管中，編號備用。制備的樣品在2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過24h,若需長期保存應(yīng)置一70℃以下，避免反復(fù)凍融(凍融不超過3次)。7.2核酸提取CDV屬于RNA病毒，CPV和CAV-1屬于DNA病毒，本文件以常規(guī)核酸提取試劑(可同時(shí)提取DNA和RNA)為例說明核酸提取步驟，也可按照GB/T40458—2021的方法提取，還可采用其他等效商品化試劑盒提取。實(shí)驗(yàn)前，將各試劑于室溫下溶解，充分混勻并短暫離心后使用。7.2.2核酸提取純化準(zhǔn)備7.2.2.1裂解液如有沉淀，請于56℃溫浴至沉淀完全溶解后使用。7.2.2.2使用前，加24mL無水乙醇至洗液三中，混勻，并做好標(biāo)記(擰緊瓶蓋，防止乙醇揮發(fā))。7.2.2.3將蛋白酶混合物充分混勻后，按照每管20μL分裝至各離心管中。7.2.3核酸提取純化振蕩10s,56℃孵育10min;2℃~8℃8000r/min離心1min,取上清待用。7.2.3.3靜置離心管10min,期間每隔2min上下顛倒離心管5次，使管內(nèi)磁珠分布均勻。57.2.3.4將離心管置于離心機(jī)上，2℃~8℃8000r/min離心1min,用移液器吸去管內(nèi)液體。7.2.3.5加入500μL洗液一，用移液器吸頭輕柔打散管壁磁珠，旋渦振蕩10s,直至其分布均勻。7.2.3.6將離心管置于離心機(jī)上，2℃~8℃8000r/min離心1min,用移液器吸去管內(nèi)液體。7.2.3.7加入500μL洗液二，用移液器槍頭輕柔打散管壁磁珠，旋渦振蕩10s,直至其分布均勻。7.2.3.8將離心管置于離心機(jī)上，2℃~8℃8000r/min離心1min,用移液器吸去管內(nèi)液體。7.2.3.9加入500μL洗液三，用移液器槍頭輕柔打散管壁磁珠，旋渦振蕩10s,直至其分布均勻。系組成應(yīng)符合B.3的規(guī)定，充分混勻后，蓋緊管蓋，500r/min離心30s,將離心后的PCR管放入PCR儀反應(yīng)。循環(huán)條件設(shè)置：——第一階段，預(yù)變性94℃5min;7.2.3.10以得到的PCR產(chǎn)物與基因芯片進(jìn)行雜交，雜交反應(yīng)體系組成應(yīng)符合B.3的規(guī)定。芯片雜交盒中加入200μL去離子水，將芯片正面朝上放進(jìn)雜交盒中，對準(zhǔn)方向放入蓋片，通過加樣孔將變性后的雜交液取15μL一次性注入，使其充滿蓋片和芯片之間空隙，封閉雜交盒，42℃恒溫水浴雜交2h。雜交完畢后，棄去蓋片，芯片探針面向下在少量預(yù)熱的2×SSC(含0.2%SDS)中漂去殘余雜交液(注意避免四個(gè)矩陣的雜交液交叉污染),撕去芯片上的橡膠圍欄，在預(yù)熱至42℃的雜交洗液I攪拌清洗4min,繼續(xù)在預(yù)熱至42℃的0.2×SSC中攪拌清洗4min,2000r/min離心1min,置于暗盒室溫保存。將芯片置于芯片掃描儀中進(jìn)行掃描分析，Cy-3標(biāo)記用532nm激光管掃描，Cy-5標(biāo)記用635nm激光管掃描，光電耦合裝置信號設(shè)為900。獲得各點(diǎn)熒光強(qiáng)度、背景強(qiáng)度等數(shù)據(jù)。7.2.6微陣列芯片結(jié)果判定7.2.6.1檢測結(jié)果判讀原則依據(jù)以下原則判讀檢測結(jié)果：——每個(gè)檢測點(diǎn)信號值=該點(diǎn)熒光強(qiáng)度值一該點(diǎn)背景強(qiáng)度值；——陰性對照平均信號值=3個(gè)陰性對照點(diǎn)信號值的平均值一該點(diǎn)背景強(qiáng)度值；——檢測點(diǎn)陽性判讀標(biāo)準(zhǔn)：檢測點(diǎn)信號值一該點(diǎn)背景強(qiáng)度值>2倍陰性對照平均信號值。7.2.6.2.1陰性對照信號值接近背景強(qiáng)度值。7.2.6.2.2探針結(jié)合對照、雜交對照、標(biāo)記對照、陽性對照信號值均為陽性。7.2.6.2.3若探針結(jié)合對照點(diǎn)中任何一個(gè)為陰性，則表明探針與片基結(jié)合存在問題；若雜交對照為陰性，則表明雜交環(huán)節(jié)存在問題；若標(biāo)記對照為陰性，則表明標(biāo)記擴(kuò)增環(huán)節(jié)存在問題；若陽性對照為陰性，則表明總RNA提取環(huán)節(jié)存在問題。出現(xiàn)上述情況任何一種，此次實(shí)驗(yàn)視為無效。7.2.6.3結(jié)果描述及判定病毒的每條探針檢測點(diǎn)都是陰性即待測樣品不攜有該種病毒，判為陰性。6每種病毒的一條以上探針檢測點(diǎn)為陽性即待測樣品攜有相對應(yīng)病毒，判為陽性。7.3微流控芯片7.3.1微流控芯片的制作微流控芯片的制作方法見附錄D。7.3.2檢測加樣體系樣本芯片加樣試劑準(zhǔn)備：從一20℃取出試劑盒，將各試劑于室溫下解凍，充分混勻并短暫離心后使用。取N個(gè)(N=待檢測樣本數(shù))1.5mL離心管，每管加入反應(yīng)液10μL。加樣：在準(zhǔn)備好試劑的各個(gè)離心管中分別加入15μL不同的待測核酸樣本，旋渦振蕩混勻，瞬時(shí)離心，把各管中混好的樣本(25μL)分別加入到微流控芯片中的加樣孔中，最后用樣本封口膜封住加樣孔(見附錄D)及透氣孔，使用刮片趕走氣泡，確保封口膜完全貼合。上機(jī)：將上述封裝好的芯片的凹處對準(zhǔn)微流控芯片檢測儀卡扣的凸處，水平徹底按下去即可。程序設(shè)置：1600r/min低速離心10s,4600r/min高速離心30s。溫度為63.5℃,反應(yīng)時(shí)間為運(yùn)行：儀器運(yùn)行后，待溫度上升到設(shè)定溫度，微流控芯片儀開始離心，離心結(jié)束后，儀器便開始連續(xù)采集熒光信號。陰性對照：不含外源目標(biāo)核酸序列的DNA片段，單獨(dú)作為一個(gè)樣本，加入到加樣孔中。陽性對照：從可溯源的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)提取核酸，或從含有已知序列陽性樣本中提取的核酸，或人工合成的含有目標(biāo)核酸序列的DNA片段。內(nèi)參引物：存在于微流控芯片反應(yīng)孔中，含擴(kuò)增內(nèi)參基因片段的引物(非CPV、CPV和CAV-1的引物),用來質(zhì)控是否可以正常進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)。內(nèi)參質(zhì)粒：人工合成的內(nèi)參基因序列(非CPV、CPV和CAV-1的基因片段)。7.3.7微流控芯片結(jié)果判斷7.3.7.1微流控芯片檢測儀閾值線設(shè)置閾值線一般情況設(shè)置為800(可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整，設(shè)定原則以閾值線剛好超過非典型S型擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)，且Ct值顯示為0),判定為陽性的Ct值設(shè)置為30,儀器配套軟件自動(dòng)分析結(jié)果。陽性對照出現(xiàn)明顯的S型擴(kuò)增曲線，陰性對照無明顯的S型擴(kuò)增曲線，內(nèi)參引物檢測孔在Ct值≤730時(shí)，出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效；否則實(shí)驗(yàn)無效。陽性：檢測孔在Ct值≤30時(shí)，有明顯擴(kuò)增曲線，判定對應(yīng)檢測指標(biāo)為陽性。注：如果樣品做重復(fù)實(shí)驗(yàn)，擴(kuò)增多次，只要有一次實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定是陽性，那么該樣本判定為陽性樣本。8生物安全措施8.1實(shí)驗(yàn)室設(shè)備、設(shè)施要求及廢棄物處理應(yīng)符合GB19489的規(guī)定。8.2微流控芯片的檢測工作應(yīng)由具備生物實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)驗(yàn)人員承擔(dān)。8.3檢驗(yàn)過程中防止交叉污染的措施應(yīng)按照GB/T27401的規(guī)定執(zhí)行。8(規(guī)范性)緩沖液配方以下所用試劑均為分析純。A.1磷酸鹽緩沖液A.1.1A液0.2mol/LNaH?PO?水溶液：NaH?PO?·H?O27.6g,溶于蒸餾水中，最后稀釋至1000mL。0.2mol/LNa?HPO?水溶液：Na?HPO?·7H?O53.6g,(或Na?HPO?·12H?O71.6g或Na?HPO?·2H?O35.6g)加蒸餾水溶解，最后稀釋至1000mL。A液14mL、B液36mL、NaCl8.5g,加蒸餾水至1000mL。A.220×SCCNaCl175.3g、Na?C?H?O?·2H?O88.2g,加超純水至1000mL。充分溶解，室溫保存。A.32×SCC20×SCC50mL,加超純水至1000mL。充分溶解，室溫保存。A.40.2×SCC2×SCC50mL,加超純水至1000mL。充分溶解，室溫保存。A.5DTTMgCl?(0.1mol/L)DTT15.4g、MgCl?9.5g,加超純水至1000mL。充分溶解，室溫保存。A.610%SDSSDS100g、超純水900mL,加熱至68℃以溶解SDS結(jié)晶，再加超純水定容至1000mL,室溫保存。A.750×Denhardt's聚蔗糖5g、聚乙烯吡咯烷酮5g、BSA5g,加超純水至500mL。充分溶解，-20℃保存。A.8裂解液尿素30.03g、吐溫-201mL,加超純水至100mL。充分溶解，室溫保存。鹽酸胍40.12g、異丙醇40mL,加超純水至100mL。充分溶解，室溫保存。9A.10洗液二NaCl0.58g、異丙醇25mL、A.11洗液三無水乙醇80mL,加超純水至100mL。充分混勻，室溫保存。A.12洗脫液1mol/LTris-HCl(pH8.0)1mL、0.5mol/LEDTA(pH8.0)0.2mL,加超純水至100mL。充分混勻，1.034×10?Pa高壓蒸汽滅菌10min,室溫保存。超純水100mL加DEPC50μL,室溫過夜，121℃,15min滅菌，或直接購買無RNase超純水。(規(guī)范性)基因芯片引物、探針序列、探針排布及RT-PCR反應(yīng)體系組成B.1基因芯片引物、探針、質(zhì)控序列及排布微陣列芯片檢測引物序列見表B.1所示，每對引物的上游引物的5'端標(biāo)記熒光，用于雜交檢測。表B.1引物序列引物名稱序列(5'-3')引物名稱序列(5'-3')CDV1-FGGCAGATGAGTTCTTCAAAACDV1-RCAATTCTAGGCTTGTTCCCCDV2-FGGTGTCAAGGAACAACTGGCDV2-RCTATCCCTCCTAGAGCAAACCAV-1-1-FCGTCCTCACCTAAGCCTAACAV-1-1-RAAGGTAGTAATGTTCAGCGGCAV-1-2-FATGCCGCTGAACATTACTACCAV-1-2-RGAAAGGTTAGCAGGCTTACACPV1-FACTCCAGCAGCTATGAGATCCPV1-RAGCAAATTCATCACCTGTTCCPV2-FCAGGTGATGAATTTGCTACACPV2-RCCATTTGAGTTACACCACG微陣列芯片檢測探針序列、質(zhì)控對照探針序列和探針排布見表B.2所示。探針名稱縮寫檢測病毒序列(5'-3')CTTTCGACCCTTCGTCTACACCTATCCCTCCTAGAGCAAAGTGCCATTGGAGAGACAGAGGAATCATACGGCATCTGGTGAACCCAATGTCTCAGATCTCATGGTAAGCCCAATGCTCTAT表面化學(xué)對照-Cy-3質(zhì)控對照CACATCACTCAGTTATAGTC陰性對照質(zhì)控對照GACCGCGCTTATACTATAGTC雜交對照質(zhì)控對照CCCGCTCCGATGGGATAGTC標(biāo)記對照質(zhì)控對照CTCAAAAGCCCTTCCTGCCCA陽性對照質(zhì)控對照GATGGTAGGATAGTGGCCTA微陣列芯片質(zhì)控對照模板序列見表B.3所示。表B.3質(zhì)控對照模板序列對照名稱對照序列5'-3'雜交對照-GACTATCCCATCGGAGCGGG模板CACGAGGAGTCTGCTACCCGAGAAACCATATTCAGAGCGAATCATCTGTGAGCCGTTTCAGTTGGTTGGTCTCAAAAGCCCTTCCTGCCCAGAGTGATCTCACTCGTCGAGGCCATCGGCTCTGACGCGATATACGGTTGTGCCGAGTGTCAATAGTTTCAAATGAGGTAGCAGACTCCTCGTG將合成的探針用點(diǎn)樣緩沖液(50%DMSO)溶解，濃度為50μmol/L,芯片每條探針橫向重復(fù)3點(diǎn)，每點(diǎn)約0.25nL,點(diǎn)直徑約130μm,點(diǎn)間距300μm,點(diǎn)樣均勻度的標(biāo)準(zhǔn)方差約為15%。單位為毫米標(biāo)引序號說明：1——圍欄；2——芯片。圖B.1檢測矩陣在芯片上的排布芯片每個(gè)矩陣6行7列，探針排列如圖B.2所示。PCPCNCCAV1CAV1AV2AV2NCNC圖B.2各檢測探針在矩陣中的排布點(diǎn)樣后用0.2%SDS洗液清洗2min,用0.2%的封閉液攪拌封閉5min,再用去離子水?dāng)嚢枨逑?次，最后2000r/min離心1min。將四區(qū)域芯片圍欄貼于芯片表面，置于暗盒室溫保存。B.2反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液體系組成反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液體系包含以下組成：a)總RNA(含3種病毒RNA)1pg～5xg;c)dNTPs(10mmol/L)1μL;f)RnasinlμL;應(yīng)管中加入d)、e)、f),混勻后，37℃反應(yīng)2min;再加入g)。PCR反應(yīng)液體系組成如表B.4所示。組分22211Taq酶(5U/μL)B.4雜交反應(yīng)液體系基因PCR產(chǎn)物0.5μL、PCR產(chǎn)物5.26μL,將反應(yīng)液體系混合均勻。B.5說明50×Denhardt’s溶液配方：聚蔗糖5g,聚乙烯吡咯烷酮5g,BSA5g加水至500mL。(規(guī)范性)微流控芯片檢測試劑盒的試劑組分、存放條件及引物序列微流控芯片試劑組分和存放條件見表C.1所示。表C.1微流控芯片試劑組分和存放條件序號名稱存放條件1微流控芯片室溫2反應(yīng)液3核酸裂解液室溫CPV檢測引物序列見表C.2所示。引物序列F3GTAAACCATGTAGACTAACACAB3GCACTATAACCAACCTCAGCFIPCCTTCAGCTTGAGGCAAAGAATTTA-TACATGGCAAACAAATAGAGCBIPAGGAGTTCAACAAGATAAAAGACGT-GGTCTCATAATAGTAGCTTCAGTCDV檢測引物序列見表C.3所示。引物序列F3CGGTGGCTGAATGACATGB3CAAATATTCCTAGCGTCACTACFIPGCTATAGTACATACCTTGGCTTTGG-CATTACTCCAGACAACCAACTBIPGTTGACACTGGCTTCCTTGTG-GAATACCATCTTGTGAACCATTCAV-1檢測引物序列見表C.4所示。引物序列AATAGCAGTGGGTTGTCCCTAAGTTGTTAGACAGGTTCCCCAAGCAAAGGTGCACATGA-ATAAATCTATTCAGTTGAGAAGGGTBIPAGTTGGCAATGTTTCCCCCC-AGTGTACGGGATATTCTGTTCPV、CDV和CAV-1三種病毒陽