微生物誘變育種致遺傳物質(zhì)損傷強度測定 umu法征求意見稿

GB/TXXXXX–2012GB/TXXXXX–2012微生物誘變育種致遺傳物質(zhì)損傷強度測定umu法1范圍本標準規(guī)定了微生物誘變育種致遺傳物質(zhì)損傷強度測定umu法的原理、試劑或材料、儀器設備、測定步驟和結果分析。本標準適用于物理誘變源和化學誘變源造成的微生物遺傳物質(zhì)損傷測定。2規(guī)范性引用文件GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法YY/T0588流式細胞儀3術語與定義下列術語和定義適用于本文件。3.1誘變mutagenesis通過人為的措施誘導遺傳基因產(chǎn)生變異的過程。注：常用的誘變方法包括物理誘變和化學誘變等。3.2遺傳物質(zhì)損傷DNAdamage化學或物理誘變源對遺傳物質(zhì)分子結構的改變。3.2遺傳物質(zhì)損傷強度DNAdamagestrength當細胞受到DNA損傷時會發(fā)生應急修復（SOS修復），使其以突變?yōu)榇鷥r繼續(xù)存活下去。4原理在DNA發(fā)生損傷時，細菌通過lexA和recA的共同作用，引起體內(nèi)的SOS響應。DNA損傷程度越高，SOS響應越強。通過將SOS系統(tǒng)調(diào)控基因與指示基因相融合，檢測指示基因編碼蛋白活性或信號強度，即可得到SOS基因的表達強度，表征DNA損傷強度和環(huán)境致癌物質(zhì)濃度。在umu測試中，將編碼DNA聚合酶V中重要組分的umuC基因與編碼β-半乳糖苷酶的lacZ基因融合，導入到Salmonellatyphimurium中，通過顯色法檢測β-半乳糖苷酶活性來測定SOS誘導強度。然而，由于誘變過程會造成細胞的死亡，死細胞會對測試誘變損傷能力的評估造成影響。為排除這一影響，F(xiàn)ACS-umu測試方法利用流式細胞分選技術測定活細胞遺傳物質(zhì)損傷強度，其測試原理為：熒光素-2-β-D-半乳糖苷（FDG）本身不具有熒光，其被β-半乳糖苷酶水解后的產(chǎn)物熒光素具有熒光。碘化丙啶（Propidiumiodide，PI）是一種DNA熒光染料，只能進入失去細胞膜選擇通透性的細胞，即死細胞中，因此可以用于區(qū)分活死細胞。采用FDG作為β-半乳糖苷酶的熒光底物，利用PI作為死細胞染料，通過采用流式細胞儀測定誘變后活細胞的β-半乳糖苷酶活性，從而得到活細胞的DNA損傷強度。5試劑或材料除非另有規(guī)定，僅使用分析純試劑。5.1水：GB/T6682二級。5.2菌種：鼠傷寒沙門氏菌（Salmonellatyphimurium），包含表達umuC’-’lacZ基因和氨芐青霉素抗性基因的pSK1002質(zhì)粒。5.3TGA培養(yǎng)基稱取胰蛋白胨10g，氯化鈉5g，HEPES11.9g，加入980ml水溶解，pH調(diào)整為7.0±0.2，定溶到1000ml。121℃，15min高壓滅菌。溶解2g葡萄糖在20ml去離子水中單獨滅菌。滅菌后按等比例混合兩個溶液，無菌條件下每升冷卻的TGA培養(yǎng)基中加入50mg氨芐青霉素。改溶液可以在-20℃保存4周。5.410×TGA培養(yǎng)基包含10倍濃度的TGA溶液，可以在4℃保存14天。5.5熒光素-2-β-D-吡喃半乳糖苷（Fluoresceindi-β-D-galactopyranoside，F(xiàn)DG）溶液在10ml含體積比為1%DMSO和1%乙醇的水中溶解13.13mgFDG，F(xiàn)DG終濃度為2mM，分裝后保存在-20℃冰箱中。使用前在37℃預熱15min以上。5.6碘化丙啶（Propidiumiodide，PI）溶液在10mlPBS溶液中溶解6.68mgPI，配成濃度為1mM的PI溶液。用移液槍吸取10ul濃度為1mM的PI儲備液，溶于10mlPBS溶液中，配成濃度1uM的PI溶液，作為PI工作液。于4℃保存，使用前在冰上放置預冷。6儀器設備6.1恒溫水浴鍋（37±1）℃；6.2pH計；0.1；6.3電子天平；0.01；6.4高速離心機；6.5流式細胞儀；6.6恒溫震蕩搖床，溫度可實現(xiàn)（28±1）℃和（37±1）℃，轉(zhuǎn)速在125r/min到150r/min；7測定步驟7.1測試菌過夜培養(yǎng)物制備在三角瓶中裝入20mlTGA培養(yǎng)基用透氣無菌瓶塞封口，滅菌儲存；融化凍存的測試菌，在凍存管中加入1mlTGA培養(yǎng)基，3000g離心凍存管中的測試菌10min，丟棄上清液，用1mLTGA培養(yǎng)基重懸測試菌，用0.5ml測試菌重懸液接種到含TGA培養(yǎng)基的三角瓶中，在（37±1）℃搖動培養(yǎng)過夜（不超過12h）。7.2誘變測試微生物樣品制備用新鮮的TGA培養(yǎng)基（37℃）將過夜培養(yǎng)的測試菌稀釋10倍。繼續(xù)在37±1）℃搖動培養(yǎng)1.5天。在（600±20）nm用1cm比色皿檢測光密度，以TGA培養(yǎng)基作為空白對照，誘變測試微生物樣品應處于對數(shù)生長期。7.3誘變7.3.1化學誘變根據(jù)測試需求，宜通過文獻等資料或設置預實驗，確定化學誘變劑的種類和濃度。將10ul不同濃度的化學誘變劑加入到1ml誘變樣品（9.2）中，置于1.5ml的EP管，在37±1℃，200r/min震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h。對照為在1mlTGA培養(yǎng)基中加入10ulDMSO。7.3.2物理誘變根據(jù)測試需求，宜通過文獻等資料或設置預實驗，確定物理誘變條件。取100ul接種物（9.2）進行物理誘變處理，對照為沒有進行物理誘變處理的樣品。處理后的樣品和對照轉(zhuǎn)移到1.5mlEP管中，在37±1℃，200r/min震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h。7.4FDG和PI染色取化學或物理誘變后的測試樣品50l置于1.5ml的EP管中，在37℃預熱5min，加入37℃預熱的FDG溶液50ul，迅速溫和混勻后，置于37℃水浴中2min，使FDG滲透進入細胞。之后迅速加入500l的PI溶液，將混合液放置于冰上反應1h，在進行流式細胞測定前一直置于冰上。7.5流式細胞儀測定使用流式細胞儀對染色后樣品進行流式分析。采用激發(fā)波長為488nm，對于FDG水解產(chǎn)物熒光素的熒光強度測定接收波長為525±30nm（FL-1通道），PI染色熒光測定接收波長為670nm（FL-2通道）。測定細胞總數(shù)為5000到10000個細胞。8結果分析8.1閾值設定通過前向角散射光FSC和側向角散射光SSC圈出目標菌體，以去除多細胞粘連對結果的影響。通過單獨的PI染色，測定FL-1通道和FL-2通道的熒光值，其FL-1通道熒光值作為背景值，即為FDG染色陰性細胞。通過單獨的FDG染色，測定FL-1通道和FL-2通道的熒光值，其FL-2通道熒光值作為背景值，即為PI染色陰性細胞。對于FDG和PI同時染色的樣品，選取FDG染色和PI染色陽性為目標細胞群，用于后續(xù)數(shù)據(jù)處理。8.2結果計算按照式（1）進行計算：Fi式中：Fi——SOS誘導系數(shù)；Am——誘變源處理樣品的平均FDG水解產(chǎn)物熒光素相對熒光值；Ac——對照樣品的平均FDG水解產(chǎn)物熒光素相對熒光值。_________________________________前言本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標準由中國標準化研究院提出并歸口。本標準起草單位：本標準主要起草人：前言本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標準由中國標準化研究院提出并歸口