化妝品中α-熊果苷等4種原料的檢驗(yàn)方法

附件20化妝品中α-熊果苷等4種原料的檢驗(yàn)方法α-Arbutinandother3kindsofcomponentsincosmetic1范圍本方法規(guī)定了高效液相色譜法測(cè)定化妝品中α-熊果苷、熊果苷、氫醌和苯酚的含量。本方法適用于液態(tài)水基類、膏霜乳液類、凝膠類、面膜類、粉類化妝品中α-熊果苷、熊果苷、氫醌和苯酚含量的測(cè)定。2方法提要樣品經(jīng)甲醇超聲提取后，采用高效液相色譜系統(tǒng)分離，熒光檢測(cè)器檢測(cè)，根據(jù)保留時(shí)間定性，峰面積定量，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量。如有陽性結(jié)果，應(yīng)用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行定性確證。本方法中α-熊果苷、熊果苷、氫醌和苯酚的檢出限、定量下限及取樣量為1.0g時(shí)檢出濃度和最低定量濃度見表1。表1α-熊果苷、熊果苷、氫醌和苯酚的檢出限、定量下限、檢出濃度和最低定量濃度序號(hào)原料名稱檢出限（ng）定量下限（ng）檢出濃度（μg/g）最低定量濃度（μg/g）1α-熊果苷1.02.52.05.02熊果苷1.02.52.05.03氫醌0.100.300.200.604苯酚0.100.300.200.60注：本方法中的熊果苷即指β-熊果苷。3試劑和材料除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。3.1甲醇，色譜純。3.2微孔濾膜（0.45μm）。3.3標(biāo)準(zhǔn)品：α-熊果苷等4種原料的標(biāo)準(zhǔn)品信息詳見附錄A。3.4標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別稱取α-熊果苷等4種原料標(biāo)準(zhǔn)品（3.3）各10mg（精確至0.00001g），置于不同10mL容量瓶中，用甲醇（3.1）溶解并定容至刻度，配制成濃度均為1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。4儀器和設(shè)備4.1高效液相色譜儀，熒光檢測(cè)器。4.2天平。4.3離心機(jī)，轉(zhuǎn)速不低于14000r/min。4.4超聲波清洗器。4.5渦旋振蕩器。5分析步驟5.1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備分別準(zhǔn)確量取α-熊果苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（3.4）1mL、熊果苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（3.4）1mL、氫醌標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（3.4）0.1mL和苯酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（3.4）0.2mL，置同一個(gè)10mL容量瓶中，用甲醇（3.1）定容至刻度，配制成α-熊果苷、熊果苷、氫醌和苯酚濃度分別為100、100、10、20μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。5.2混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的制備準(zhǔn)確量取不同體積的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（5.1），用甲醇（3.1）配制成濃度如表2所示的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。表2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液濃度及混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度序號(hào)原料名稱標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液濃度（μg/mL）混合標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（μg/mL）混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度（μg/mL）1α-熊果苷10001000.250.5128202熊果苷10001000.250.5128203氫醌1000100.0250.050.10.20.824苯酚1000200.050.10.20.41.645.3樣品處理稱取樣品1.0g（精確至0.001g），置10mL具塞比色管中，加入甲醇（3.1）至刻度，渦旋振蕩30s，使樣品與提取溶劑充分混勻。密塞，超聲提取20min，放置至室溫，取適量樣品溶液離心（轉(zhuǎn)速14000r/min）5min，取上清液經(jīng)微孔濾膜（0.45μm）（3.2）過濾，取續(xù)濾液作為待測(cè)溶液。必要時(shí)用適量甲醇（3.1）稀釋。5.4參考色譜條件色譜柱：C18柱（4.6mm×250mm，5μm），或等效色譜柱；流動(dòng)相：A：水，B：甲醇（3.1）；梯度洗脫程序詳見表3；柱溫：20℃；流速：0.5mL/min；進(jìn)樣量：5μL；檢測(cè)波長(zhǎng)詳見表4。表3流動(dòng)相梯度洗脫程序時(shí)間/minV（A）/%V（B）/%0.095521.095522.0554543.0505048.0505048.1010050.0010050.195560.0955表4α-熊果苷、熊果苷、氫醌和苯酚的檢測(cè)波長(zhǎng)序號(hào)原料名稱激發(fā)波長(zhǎng)（nm）發(fā)射波長(zhǎng)（nm）1α-熊果苷2923372熊果苷2923373氫醌2983454苯酚2803185.5測(cè)定在“5.4”色譜條件下，取混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（5.2）分別進(jìn)樣，進(jìn)行色譜分析，以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取“5.3”項(xiàng)下的待測(cè)溶液進(jìn)樣，根據(jù)保留時(shí)間定性，測(cè)得峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)溶液中α-熊果苷、熊果苷、氫醌和苯酚的濃度。按“6”計(jì)算樣品中α-熊果苷、熊果苷、氫醌和苯酚的含量。必要時(shí)按附錄B方法進(jìn)行定性確證。6分析結(jié)果的表述6.1計(jì)算式中：ω——樣品中待測(cè)原料的含量，μg/g；ρ——從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)原料的濃度，μg/mL；V——樣品定容體積，mL；m——樣品取樣量，g；D——稀釋倍數(shù)（如未稀釋則為1）。在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算術(shù)平均值的10%。6.2回收率和精密度多家實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證的回收率為84.7%～114.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%（n=6）。7圖譜圖1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜圖1：熊果苷；2：α-熊果苷；3：氫醌；4：苯酚附錄A（資料性附錄）表A.1α-熊果苷等4種原料標(biāo)準(zhǔn)品信息表序號(hào)原料名稱CAS號(hào)分子式相對(duì)分子質(zhì)量1α-熊果苷84380-01-8C12H16O7272.252熊果苷497-76-7C12H16O7272.253氫醌123-31-9C6H6O2110.114苯酚108-95-2C6H6O94.11

附錄B（資料性附錄）α-熊果苷、熊果苷、氫醌和苯酚結(jié)果的定性確證B.1α-熊果苷和熊果苷的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法確證B.1.1試劑和材料B.1.1.1微孔濾膜（0.22μm）。B.1.2儀器和設(shè)備B.1.2.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，帶電噴霧離子源（ESI源）。B.1.2.2高速離心機(jī)，轉(zhuǎn)速不低于14000r/min。B.1.3樣品處理取正文“5.3樣品處理”項(xiàng)下待測(cè)溶液，加適量水稀釋至α-熊果苷、熊果苷的濃度在20～200ng/mL之間，離心（轉(zhuǎn)速14000r/min）5min，取上清液，用微孔濾膜（B.1.1.1）過濾，取續(xù)濾液作為待測(cè)溶液。B.1.4參考色譜條件色譜柱：C18柱（4.6mm×100mm，2.7μm），或等效色譜柱；柱溫：20℃；進(jìn)樣量：2μL；流動(dòng)相：A：水，B：甲醇；梯度洗脫程序詳見表B.1；流速：0.3mL/min。表B.1流動(dòng)相梯度洗脫程序時(shí)間/minV（A）/%V（B）/%0.095510.095512.059515.059515.195520.0955B.1.5參考質(zhì)譜條件（可根據(jù)儀器情況進(jìn)行調(diào)整）離子源：ESI源；監(jiān)測(cè)模式：負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，監(jiān)測(cè)離子對(duì)及相關(guān)電壓參數(shù)設(shè)定見表B.2。表B.2質(zhì)譜監(jiān)測(cè)離子對(duì)及相關(guān)電壓參數(shù)設(shè)定表序號(hào)原料名稱母離子（m/z）子離子（m/z）碰撞能量（eV）1α-熊果苷271.0151.0?18108.0?302熊果苷271.0161.0?12108.0?24B.1.6定性判定用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)樣品進(jìn)行定性判定，在相同試驗(yàn)條件下，樣品中應(yīng)呈現(xiàn)兩個(gè)監(jiān)測(cè)離子的色譜峰，樣品中各離子的保留時(shí)間應(yīng)與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液中各離子的保留時(shí)間一致；樣品色譜圖中所選擇的監(jiān)測(cè)離子的相對(duì)豐度比與相當(dāng)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子相對(duì)豐度比的偏差不超過表B.3規(guī)定范圍，則可以判斷樣品中存在相應(yīng)待測(cè)物。表B.3定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差相對(duì)離子豐度（k）k>50%50%≥k>20%20%≥k>10%k≤10%允許的最大偏差±20%±25%±30%±50%B.1.7圖譜圖B.1α-熊果苷、熊果苷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液HPLC-MS/MS色譜圖1：熊果苷；2：α-熊果苷B.2氫醌的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法確證B.2.1試劑和材料B.2.1.1甲醇（色譜純）。B.2.1.2維生素C。B.2.1.3氯化鈉。B.2.1.4固相萃取小柱（60mg/3mL），吸附劑為含吡咯烷酮基的聚苯乙烯/二乙烯基苯共聚物。B.2.1.5微孔濾膜（0.22μm）。B.2.1.6進(jìn)樣小瓶?jī)?nèi)襯管。B.2.1.715%甲醇溶液：量取甲醇（B.2.1.1）15mL，用水稀釋至100mL。B.2.1.8維生素C溶液：取維生素C（B.2.1.2）適量，用水溶解并配成濃度為100mg/mL的溶液。B.2.2儀器和設(shè)備B.2.2.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，帶電噴霧離子源（ESI源）。B.2.2.2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。B.2.2.3高速離心機(jī)，轉(zhuǎn)速不低于14000r/min。B.2.3樣品處理稱取樣品1.0g，準(zhǔn)確加入15%甲醇溶液（B.2.1.7）10mL、維生素C溶液（B.2.1.8）0.2mL，渦旋振蕩1min，再加入氯化鈉（B.2.1.3）2g，渦旋振蕩1min，離心（轉(zhuǎn)速14000r/min）15min，取5mL上清液，待凈化。取固相萃取小柱（B.2.1.4），依次預(yù)先用甲醇（B.2.1.1）3mL、水10mL進(jìn)行活化。將待凈化液倒入小柱中，自然流盡后，用10mL水清洗小柱，待清洗液自然流盡后，加甲醇（B.2.1.1）6mL洗脫，收集洗脫液于尖底燒瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（水浴溫度35℃）減壓濃縮至近干，加甲醇（B.2.1.1）0.2mL，渦旋振蕩30s，用微孔濾膜（B.2.1.5）過濾至內(nèi)襯管中（B.2.1.6），作為待測(cè)溶液。B.2.4參考色譜條件色譜柱：C18柱（4.6mm×100mm，2.7μm），或等效色譜柱；柱溫：20℃；進(jìn)樣量：5μL；流動(dòng)相：A：水，B：甲醇；梯度洗脫程序詳見表B.4；流速：0.2mL/min。表B.4流動(dòng)相梯度洗脫程序時(shí)間/minV（A）/%V（B）/%0.090105.0901010.0752515.0722816.0208020.0208020.1901026.09010B.2.5參考質(zhì)譜條件（可根據(jù)儀器情況進(jìn)行調(diào)整）離子源：ESI源；監(jiān)測(cè)模式：負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，監(jiān)測(cè)離子對(duì)及相關(guān)電壓參數(shù)設(shè)定見表B.5。表B.5質(zhì)譜監(jiān)測(cè)離子對(duì)及相關(guān)電壓參數(shù)設(shè)定表原料名稱母離子（m/z）子離子（m/z）碰撞能量（eV）氫醌109.081.0?1753.0?18B.2.6定性判定用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)樣品進(jìn)行定性判定，在相同試驗(yàn)條件下，樣品中應(yīng)呈現(xiàn)兩個(gè)監(jiān)測(cè)離子的色譜峰，樣品中各離子的保留時(shí)間應(yīng)與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液中各離子的保留時(shí)間一致；樣品色譜圖中所選擇的監(jiān)測(cè)離子的相對(duì)豐度比與相當(dāng)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子相對(duì)豐度比的偏差不超過表B.6規(guī)定范圍，則可以判斷樣品中存在相應(yīng)待測(cè)物。表B.6定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差相對(duì)離子豐度（k）k>50%50%≥k>20%20%≥k>10%k≤10%允許的最大偏差±20%±25%±30%±50%B.2.7圖譜圖B.2氫醌標(biāo)準(zhǔn)溶液HPLC-MS/MS色譜圖1：氫醌B.3苯酚的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法確證B.3.1試劑和材料B.3.1.1無水硫酸鈉。B.3.1.2微孔濾膜（0.22μm）。B.3.2儀器氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，帶電子轟擊離子源（EI源）。B.3.3樣品處理取正文“5.3樣品處理”項(xiàng)下待測(cè)溶液5mL，加入無水硫酸鈉（B.3.1）2g，振搖，靜置1h，取上清液，用微孔濾膜（B.3.1.2）過濾，取濾液作為待測(cè)溶液。B.3.4參考?xì)庀嗌V-質(zhì)譜條件（可根據(jù)儀器情況進(jìn)行調(diào)整）色譜柱：聚乙二醇鍵合交聯(lián)固定相毛細(xì)管柱（30m×0.25mm，0.25μm），或等效色譜柱；柱溫：120℃/min保持1min，以20℃/min程序升溫至220℃，保持4min；進(jìn)樣口溫度：230℃；載氣流速：1.5mL/min；分流比：1:1；溶劑延遲：2.5min;進(jìn)樣量：1μL；離子源：EI源；離子源溫度：200℃；傳輸線溫度：230℃；電離能量：70eV；掃描方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)，監(jiān)測(cè)離子對(duì)及相關(guān)電壓參數(shù)設(shè)定見表B.7。表B.7質(zhì)譜監(jiān)測(cè)離子對(duì)及相關(guān)電壓參數(shù)設(shè)定表原料名稱母離子（m/z）子離子（m/z）碰撞能量（eV）苯酚94.066.0955.015B.3.5