實(shí)驗(yàn)14-細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)和檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)14細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)和檢測(cè)20世紀(jì)60年代人們注意到細(xì)胞存在著兩種不同形式的死亡方式：凋亡（apoptosis）和壞死（necrosis）。細(xì)胞壞死指病理情況下細(xì)胞的意外死亡，壞死過(guò)程細(xì)胞膜通透性增高，細(xì)胞腫脹，核碎裂，繼而溶酶體、細(xì)胞膜破壞，細(xì)胞內(nèi)容物溢出，細(xì)胞壞死常引起炎癥反應(yīng)。細(xì)胞凋亡apoptosis一詞來(lái)源于古希臘語(yǔ)，意思是花瓣或樹(shù)葉凋落，意味著生命走到了盡頭，細(xì)胞到了一定時(shí)期會(huì)像樹(shù)葉那樣自然死亡。凋亡是細(xì)胞在一定生理或病理?xiàng)l件下遵守自身程序的主動(dòng)死亡過(guò)程。凋亡時(shí)細(xì)胞皺縮，表面微絨毛消失，染色質(zhì)凝集并呈新月形或塊狀靠近核膜邊緣，繼而核裂解，由細(xì)胞膜包裹著核碎片或其他細(xì)胞器形成小球狀凋亡小體凸出于細(xì)胞表面，最后凋亡小體脫落被吞噬細(xì)胞或鄰周細(xì)胞吞噬。凋亡過(guò)程中溶酶體及細(xì)胞膜保持完整，不引起炎癥反應(yīng)。細(xì)胞凋亡時(shí)的生化變化特征是核酸內(nèi)切酶被激活，染色體DNA被降解，斷裂為50～300kb長(zhǎng)的DNA片段，再進(jìn)一步斷裂成180～200bp整倍數(shù)的寡核苷酸片斷，在瓊脂糖凝膠電泳上呈現(xiàn)“梯狀”電泳圖譜(DNALadder)。細(xì)胞凋亡在個(gè)體正常發(fā)育、紫穩(wěn)態(tài)維持、免疫耐受形成、腫瘤監(jiān)控和抵御各種外界因素干擾等方面都起著關(guān)鍵性的作用。1．細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法凋亡細(xì)胞具有一些列不同于壞死細(xì)胞的形態(tài)特征和生化特征，據(jù)此可以鑒別細(xì)胞的死亡形式。細(xì)胞凋亡的機(jī)制十分復(fù)雜，一般采用多種方法綜合加以判斷，同時(shí)不同類(lèi)型細(xì)胞的凋亡分析方法有所不同，方法選擇依賴(lài)于具體的研究體系和研究目的（表？）。表凋亡的檢測(cè)方法（引自DL斯佩克特等，2001）方法細(xì)胞類(lèi)型特點(diǎn)說(shuō)明形態(tài)學(xué)/細(xì)胞旋轉(zhuǎn)不限簡(jiǎn)單、快速、低廉、貯存無(wú)限制略帶主觀性，但可靠Hoechst染色不限極快，不能貯存略帶主觀性，但可靠吖啶橙/溴化乙錠不限極快，不能貯存凋亡初期可用，略帶主觀性，但可靠FACS/FSCXSSC非貼壁細(xì)胞簡(jiǎn)單，須及時(shí)進(jìn)行客觀，僅能提示凋亡FACS/PI吸收非貼壁細(xì)胞簡(jiǎn)單，需及時(shí)進(jìn)行客觀，不能辨別凋亡于壞死；早期凋亡的細(xì)胞呈陰性膜聯(lián)蛋白V(錨定蛋白)最好非貼壁細(xì)胞快速簡(jiǎn)單；細(xì)胞可以被固定并非所有細(xì)胞在膜整合損失前受PS影響；測(cè)定已知的顯著性的反應(yīng)DNA片段（瓊脂糖電泳）不限很快、低廉定性，不能確定凋亡；某些細(xì)胞不適用DNA片段(PI染色)不限很快，低廉定量；用于估計(jì)凋亡程度DNA片段(JAM分析)循環(huán)細(xì)胞低廉，可分析多種類(lèi)混合定量，不能確定凋亡含量；不能用于所有細(xì)胞TUNEL不限昂貴，耗時(shí)定量，常被認(rèn)為可靠（盡管應(yīng)該結(jié)合形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)）線粒體膜電位損失不限低廉，快速不能確定凋亡，并非次生壞死前的所有細(xì)胞都適用caspase活化(蛋白酶活性)不限中等花費(fèi)，很快目前不能確定凋亡，但適用于監(jiān)測(cè)器；不能鑒別特定激活的caspasescaspase活化(caspase免疫印跡)不限中等花費(fèi)可以鑒別特定激活的caspases；依賴(lài)于抗體的有效性caspase活化(基質(zhì)免疫印跡)不限中等花費(fèi)通過(guò)特異切割反應(yīng)測(cè)定caspase活化；如這些反應(yīng)功能可確定形態(tài)學(xué)觀察方法：利用各種染色法可觀察到凋亡細(xì)胞的各種形態(tài)學(xué)特征：（1）DAPI時(shí)常用的一種與DNA結(jié)合的熒光染料。借助于DAPI染色，可以觀察細(xì)胞核的形態(tài)變化。（2）Giemsa染色法可以觀察到染色質(zhì)固縮、趨邊、凋亡小體形成等形態(tài)。（3）吖啶橙(AO)染色，熒光顯微鏡觀察，活細(xì)胞核呈黃綠色熒光，胞質(zhì)呈紅色熒光。凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)呈黃綠色濃聚在核膜內(nèi)側(cè)，可見(jiàn)細(xì)胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體。（4）吖啶橙(A())／溴化乙啶(EB)復(fù)染可以更可靠地確定凋亡細(xì)胞的變化，AO只進(jìn)入活細(xì)胞，正常細(xì)胞及處于凋亡早期的細(xì)胞核呈現(xiàn)綠色；EB只進(jìn)入死細(xì)胞，將死細(xì)胞及凋亡晚期的細(xì)胞的核染成橙紅色。（5）臺(tái)盼藍(lán)染色對(duì)反映細(xì)胞膜的完整性，區(qū)別壞死細(xì)胞有一定的幫助，如果細(xì)胞膜不完整、破裂，臺(tái)盼藍(lán)染料進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞變藍(lán)，即為壞死。如果細(xì)胞膜完整，細(xì)胞不為臺(tái)盼藍(lán)染色，則為正常細(xì)胞或凋亡細(xì)胞。使用透射電鏡觀察，可見(jiàn)凋亡細(xì)胞表面微絨毛消失，核染色質(zhì)固縮、邊集，常呈新月形，核膜皺褶，胞質(zhì)緊實(shí)，細(xì)胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細(xì)胞吞噬現(xiàn)象。（6）蘇木精-伊紅（HE）染色是經(jīng)典的顯示細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)的染色方法，染色結(jié)果清晰。發(fā)生凋亡的細(xì)胞經(jīng)HE染色后，其細(xì)胞大小的變化及特征性細(xì)胞核的變化：染色質(zhì)凝集、呈新月形或塊狀靠近核膜邊緣，晚期核裂解、細(xì)胞膜包裹著核碎片“出芽”凸出于細(xì)胞表面形成凋亡小體等均可明顯顯示出來(lái)。DNA凝膠電泳：細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死，其細(xì)胞DNA均發(fā)生斷裂，細(xì)胞內(nèi)小分子質(zhì)量DNA片段增加，高分子DNA減少，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)DNA片段。但凋亡細(xì)胞DNA斷裂點(diǎn)均有規(guī)律的發(fā)生在核小體之間，出現(xiàn)180～200bpDNA片段，而壞死細(xì)胞的DNA斷裂點(diǎn)為無(wú)特征的雜亂片段，利用此特征可以確定群體細(xì)胞的死亡，并可與壞死細(xì)胞區(qū)別。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)核小體測(cè)定：細(xì)胞凋亡時(shí)，Ca2+、Mg2+依賴(lài)的內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶將雙鏈DNA從各核小體間連接區(qū)裂斷，產(chǎn)生單或寡核小體，各核小體的DNA與核心組蛋白H2A，H2B，H3，H4形成緊密的復(fù)合物而對(duì)內(nèi)源性核酸酶有抵抗使之不被內(nèi)源性核酸酶裂解。