受體的放射配體結(jié)合分析法

第八章受體的放射配體結(jié)合分析法第一節(jié)概述受體（Receptor）

細(xì)胞膜上或細(xì)胞內(nèi)的一些與生物活性物質(zhì)相互作用并引起特異性生物效應(yīng)的大分子。一、受體的分類及亞型在細(xì)胞內(nèi)的定位可將受體分為膜受體、核受體（一）

膜受體（membranereceptors）由胞膜外、胞膜內(nèi)及跨膜區(qū)三部分組成，配體在細(xì)胞外側(cè)同受體的胞外部分或跨膜部分上的特定結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合后，受體的分子構(gòu)型發(fā)生變化，通過膜內(nèi)部分啟動(dòng)相應(yīng)的信息傳遞機(jī)制，引起細(xì)胞功能變化。根據(jù)受體的分子結(jié)構(gòu)和受體后信息傳遞方式，膜受體又分為四種：圖8.1受體示意圖（二）核受體（nucleusreceptors）本類受體在細(xì)胞核上，與細(xì)胞核內(nèi)特定的DNA結(jié)合，通過這種結(jié)合影響遺傳信息的轉(zhuǎn)錄。核受體都是分子量在80～100KD的可溶性蛋白，不含糖基，無酶活性，由一條氨基酸組成。分為四個(gè)功能區(qū)，A/B區(qū)、C區(qū)、D區(qū)和E區(qū)。A/B區(qū)在不同受體中差異最大，主要功能是選擇和激活基因轉(zhuǎn)錄。D區(qū)主要作用是受體在核內(nèi)的定位，是與染色體DNA結(jié)合區(qū)，上面有一定的氨基酸序列，可以和靶基因上一定的核苷酸序列（反應(yīng)原件，responseelement）相結(jié)合。E區(qū)為配體的結(jié)合區(qū)，并有轉(zhuǎn)錄激活作用通常按C區(qū)和染色體DNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)特征，將核受體分為三類：1、

糖皮質(zhì)激素受體類包括糖皮質(zhì)激素受體（GCR）、鹽皮質(zhì)激素受體（MR）、孕激素受體（PR）及雄激素受體（AR）等。2、

甲狀腺激素受體類包括甲狀腺激素受體（TR）、維生素D3受體（VDR）、維甲酸受體（RAR）及維甲酸X受體（RXR）等。3、

雌激素受體類主要為雌激素（ER）。（三）

受體亞型受體亞型是指受體分子結(jié)構(gòu)上既有部分相同，也存在一定差別，它們對(duì)同一配體具有不同的親和力，生物學(xué)上具有不同的效應(yīng)。1、用藥理學(xué)方法可見到，同一種受體的幾種激動(dòng)劑（拮抗劑）對(duì)各亞型都有作用，但作用有相對(duì)的選擇性。如，對(duì)于α腎上腺受體，哌唑嗪對(duì)血管平滑肌收縮的拮抗作用強(qiáng)（α1），對(duì)胃腸道平滑肌舒張的拮抗作用較弱（α2），而育亨賓則相反。2、用放射配體結(jié)合分析法可觀察到，同一種受體的某些激動(dòng)劑（拮抗劑）對(duì)各亞型都有特異性結(jié)合能力，但是親和力不同。3、用分子生物學(xué)技術(shù)可觀察到，同一種受體的不同亞型的分子結(jié)構(gòu)類似，但基因的編碼和氨基酸序列有一定的差異。受體與配體相互作用的基本特點(diǎn)1、

可飽和性（Saturabilty）--有限結(jié)合能力。2、

特異性（Specificity）受體對(duì)配體應(yīng)具有特異性和立體特異性。配體可分為激動(dòng)劑與拮抗劑3、

適度的親和力（Affinity）受體對(duì)它的配體的親和力，或配體占據(jù)受體的濃度范圍，應(yīng)該相當(dāng)于體內(nèi)配體的生理濃度，通常是10-9mol/L。4、

可逆性（Reversibility）受體與配體的結(jié)合反應(yīng)是可逆的?？赡嫘赃€表現(xiàn)在已經(jīng)結(jié)合的配體可被另一種與受體親和力更高的配體取代。

5、

識(shí)別能力（Recognition）和生物效應(yīng)一致性受體與配體的特異性結(jié)合保證了受體對(duì)機(jī)體內(nèi)成千上萬(wàn)生物活性物質(zhì)的高度識(shí)別能力。這種能力與配體引起的生理（藥理）效應(yīng)相一致。表現(xiàn)在：（1）、在組織分布上的一致。（2）、在濃度上的一致。受體主要存在于相應(yīng)配體發(fā)揮生理或藥理效應(yīng)的器管，稱之為靶器管。有的配體生理或藥理效應(yīng)廣泛，而另一些配體的作用則有明顯的器管專一性。配體和受體結(jié)合的有效濃度通常也應(yīng)該和該配體發(fā)揮生理或藥理作用的濃度一致。6、

需具有內(nèi)源性配體一般受體都有內(nèi)源性配體，如果通過外源性配體發(fā)現(xiàn)某種蛋白分子具有類似受體的結(jié)合特性，但未能找到內(nèi)源性配體，則稱之為孤兒受體（Orphanreceptor），還不能看做肯定是真正的受體。RBA（Radioligandbindingassayofreceptors）

用放射性核素標(biāo)記的配體與相應(yīng)受體進(jìn)行特異性結(jié)合反應(yīng)，從而對(duì)受體進(jìn)行定性和定量，即稱為受體的放射配體結(jié)合分析法。RBA定量RBA在已知配體—受體反應(yīng)的基礎(chǔ)之上，通過結(jié)合反應(yīng)得知一定量的組織或細(xì)胞能與該放射性配體結(jié)合的受體數(shù)（又叫結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，Numberofbindingsite）和親和力（以解離常數(shù)KD表示）。定性RBA通過反應(yīng)量效關(guān)系，某些參數(shù)的變化等判斷受體的類型，單位點(diǎn)和多位點(diǎn)系統(tǒng)，受體與配體相互作用的特點(diǎn)等。第二節(jié)、單位點(diǎn)系統(tǒng)RBA的基本原理一、受體與配體相互作用的基本特點(diǎn)二、簡(jiǎn)單單位點(diǎn)系統(tǒng)受體配體相互作用的基本規(guī)律二、簡(jiǎn)單單位點(diǎn)系統(tǒng)受體配體相互作用的基本規(guī)律

簡(jiǎn)單單位點(diǎn)系統(tǒng):受體與配體結(jié)合的系統(tǒng)只存在一種結(jié)合位點(diǎn).1.質(zhì)量作用定律:受體與配體的結(jié)合反應(yīng)最基本的性質(zhì)是服從可逆反應(yīng)的質(zhì)量作用定律.

[R]+[L][RL]v1

---復(fù)合物形成速率k1_---復(fù)合物形成速率常數(shù)v2

---復(fù)合物解離速率k2_---復(fù)合物解離速率常數(shù)v1=K1[R][L]v2=K2[RL]反應(yīng)平衡時(shí)v1=v2k1v1k2v2反應(yīng)平衡時(shí)v1=v2平衡解離常數(shù)KD==

KD=1/KA，單位為：mol/LKD越大，親和力越低設(shè)受體和配體的初始濃度分別為[RT]、[LT]

則[R]=[RT]-[RL]

[L]=[LT]-[RL]

代入：

KD=

整理后得：[RL]2-[RL][RT+LT+KD]+[RT][LT]=0因?yàn)閇RT]、KD為定值所以[RL]僅隨[LT]而變化，兩者呈雙曲線函數(shù)關(guān)系2.飽和曲線:簡(jiǎn)單單位點(diǎn)系統(tǒng)RBA具有典型的飽和曲線--------------以[RL]為縱坐標(biāo)[LT]為橫坐標(biāo),得到的得到一條曲線(Saturationcurve).圖8-2KD對(duì)飽和曲線的影響圖8-3[RT]對(duì)飽和曲線影響

3.Scatchard作圖

簡(jiǎn)單單位點(diǎn)系統(tǒng)在Scatchard

作圖中呈一直線整理后得:以[RL]/[L]對(duì)[RL]作圖--------------Scatchard

作圖斜率=-1/KD[RT]=直線與橫坐標(biāo)的交點(diǎn)

圖8.4簡(jiǎn)單單位點(diǎn)系統(tǒng)受體結(jié)合分析的Scatchard作圖KD相同[RT]不同時(shí)[RT]相同KD不同時(shí)圖8.54.Hill作圖

得到一條斜率為1的直線重排并取對(duì)數(shù)以lg([RL]/[RT-RL])-----------------------縱坐標(biāo)lg[L]--------------------------------------橫坐標(biāo)如果一個(gè)受體能和兩個(gè)或更多(n個(gè))分子的配體結(jié)合(KD相同)

KD=[RT-RL][L]n/[RL]

lg([RL]/[RT-RL])=-lgKD+nlg[L]斜率為n,Hill系數(shù).-lgKDlgKDLg[L]三、非特異結(jié)合放射性配體除與受體特異結(jié)合外，與其他的結(jié)合統(tǒng)稱為NSB特點(diǎn)：1）結(jié)合容量大，親和力小2）無飽和現(xiàn)象3）結(jié)合量與所用配體量呈線性關(guān)系RBA時(shí)，當(dāng)分離特異結(jié)合的復(fù)合物測(cè)量放射性時(shí)，這部分NSB的放射性混在一起，測(cè)得的是總放射性（totalbinding，TB），必需先去減去NSB，才能得到特異結(jié)合（specificbinding，SB）。最基本的方法是做一系列平行管，所有的條件都與TB管相同，僅是多加了200～1000倍量非標(biāo)記配體，將SB完全取代，這時(shí)測(cè)得的放射性計(jì)數(shù)為NSB。因NSB與放射性配體呈線性，多點(diǎn)飽和法實(shí)驗(yàn)中常常只做3、4點(diǎn)，再用直線回歸法求出其余各點(diǎn)。

圖8-73H-組胺與組胺受體特異結(jié)合的飽和曲線（○表示NSB,●表示TB，x表示SB=TB-NSB）

四、正協(xié)同及副協(xié)同現(xiàn)象某些情況下，一部分受體與配體結(jié)合后可使相臨的受體分子親和力降低------------副協(xié)同（Negativecooperativity）反之，親和力逐步增高，斜率加大，曲線向上凸--------------------------------------------正協(xié)同（positivecooperativity）圖8.8Scatchard作圖中的正負(fù)協(xié)同作用（1）無協(xié)同作用；（2）負(fù)協(xié)同作用；（3）正協(xié)同作用第三節(jié)離體RBA的條件和基本方法條件：1.適用的標(biāo)記配體2.待測(cè)受體標(biāo)本3.適合的緩沖液4.較好的F與B的分離方法RBA的基本方法

制備待測(cè)受體的離體標(biāo)本加放射性配體溫育一定時(shí)間終止反應(yīng)、分離結(jié)合與游離部分測(cè)定結(jié)合部分的放射性數(shù)據(jù)處理、求有關(guān)參數(shù)一、標(biāo)記配體要求：高度親和力，特異標(biāo)記配體的濃度〈受體-配體KD常用的放射性配體：

3H-標(biāo)記物：穩(wěn)定、生物活性不變、T1/2長(zhǎng)、高放射性比活度、專門合成

125I-標(biāo)記物：易標(biāo)記、高放射性比活度、T1/2短、結(jié)構(gòu)可能變化、比活度不易確定

標(biāo)記配體的基本要求：1.高比活度RBA中受體數(shù)目一般很低（0.01～1pmol/mg蛋白），必須用高比活度的標(biāo)記配體才能得到理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。而且比活度高，可減少標(biāo)記配體的用量。一般要求在3.7×1011Bq（10Ci）/mmol以上。2.親和力高高親和力的配體可減少用量，從而降低NSB；且可使標(biāo)記配體與受體的復(fù)合物解離變慢，便于結(jié)合與游離配體的分離，易獲得準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。3.特異性強(qiáng)標(biāo)記配體應(yīng)與其他受體的交叉反應(yīng)少，與研究的受體有選擇性結(jié)合。理想的標(biāo)記配體應(yīng)只與一種受體或受體的一種亞型結(jié)合。因此應(yīng)選擇對(duì)某一受體或其中一種亞型高親和力的標(biāo)記配體。4.放射化學(xué)純度高RBA的計(jì)算是以標(biāo)記配體的用量及比活度為依據(jù)，放射性雜質(zhì)多進(jìn)可導(dǎo)致計(jì)算不準(zhǔn)確，一般要求放射化學(xué)純度在95%以上

（一）

標(biāo)記配體的用量標(biāo)記配體的用量要根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案通過預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確定。（1）單點(diǎn)法。通常選一個(gè)使受體基本飽和的標(biāo)記配體量。該方法操作簡(jiǎn)便，標(biāo)本量少，標(biāo)記配體用量少，但只能給出受體的最大結(jié)合容量Bmax，且略小于飽和曲線法。（2）多點(diǎn)飽和曲線。每一受體標(biāo)本做6～8個(gè)點(diǎn)（雙位點(diǎn)需要更多），標(biāo)記配體的用量應(yīng)覆蓋受體的不飽和區(qū)和飽和區(qū)，以得到典型的飽和曲線。此方法能得到RT、KD、反映實(shí)驗(yàn)誤差大小的平均誤差等，可信度高，但工作量也大。二、非標(biāo)記配體的選擇非標(biāo)記配體----與放射性配體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合同一受體----特異性、親和力要高----用量=100-10000倍標(biāo)記配體使絕大部分受體都被非標(biāo)記配體所占據(jù)而不再與標(biāo)記配體結(jié)合

三、待測(cè)受體標(biāo)本的制備用于離體RBA的標(biāo)本大體可分為：組織切片、完整細(xì)胞懸液，經(jīng)初步分離的細(xì)胞組分以及經(jīng)增溶或進(jìn)一步純化的受體蛋白等。

1.完整細(xì)胞懸液的制備2.細(xì)胞組成的分離細(xì)胞核、漿、膜3.受體的增溶和進(jìn)一步純化圖8.10分離細(xì)胞組分的一般方法沉淀：完整細(xì)胞、核受體四、溫育條件緩沖液通過多次預(yù)實(shí)驗(yàn)確定某個(gè)受體的最適離子強(qiáng)度和pH時(shí)間與溫度最適的時(shí)間為完全平衡時(shí)間溫度根據(jù)目的不同而不同（0—37OC）

第四節(jié)定量RBA的數(shù)據(jù)處理目的：求受體的RT和KD及其他參數(shù)通過測(cè)得的樣品數(shù)據(jù)+放射性配體的量、放射性比活度+數(shù)學(xué)模型的運(yùn)算一、單位點(diǎn)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)處理TB-NSB=RL（特異結(jié)合的CPM）CPM/儀器效率=DPM（RL）DPM/S（比活度）=濃度（mol/L）R：L=1：1------RL的mol數(shù)=結(jié)合位點(diǎn)數(shù)定量蛋白、細(xì)胞-------RTmol數(shù)1mol=6.02×1023分子數(shù)的受體通常是計(jì)算飽和區(qū)[RT]，即最大結(jié)合容量Rmax（maximumbindingcapacity）。單位換算公式為：

二、單位點(diǎn)系統(tǒng)多點(diǎn)法的數(shù)據(jù)處理一系列的不同濃度的LT與R結(jié)合后得到TBn-NSB=RLn（CPM）以RLn對(duì)LT作圖=飽和曲線-----不同的模型得到RT和KD1.目測(cè)漸進(jìn)線法2.直線化方法3.直接曲線擬合直線化方法

ScatchardModel[R]/[L]的濃度比值=B/F放射性比值B/F

=[RT]/KD-[RL]/KD以B/F-----------縱坐標(biāo)[RL]----------橫坐標(biāo)斜率=-1/KD與橫坐標(biāo)的交點(diǎn)=[RT]與縱坐標(biāo)的交點(diǎn)=[RT]/KDWoolfModel

F/B=KD/[RT]+[L]/[RT]F/B-----------縱坐標(biāo)[L]-------------橫坐標(biāo)斜率=-1/[RT]與橫坐標(biāo)的交點(diǎn)=-KD與縱坐標(biāo)的交點(diǎn)=KD/[RT]LinewearBurkModel1/[RL]=1/[RT]+KD/[RT][L]1/[RL]-----------縱坐標(biāo)1/[L]-------------橫坐標(biāo)斜率=KD/[RT]與橫坐標(biāo)的交點(diǎn)=-1/KD與縱坐標(biāo)的交點(diǎn)=1/[RT]問題1.橫坐標(biāo)為實(shí)驗(yàn)測(cè)得的值存在誤差2.直線轉(zhuǎn)換所致不均勻性3.均用F，由T-B所得有一定誤差

3.直接曲線擬合（COMPUTER）

測(cè)得TB、NSBTBn-NSB=Tn（CPM）--------[RL]（濃度）[RL]對(duì)[LT]曲線擬合[RL]2-[RL][RT+LT+KD]+[RT][LT]=0橫坐標(biāo)為[LT]，近于實(shí)際公式[RL]2-[RL][RT+LT+KD]+[RT][LT]=0為飽和曲線的直接表達(dá)式，可用最小二乘法或穩(wěn)健回歸法。橫坐標(biāo)是[LT]（自變量），縱坐標(biāo)是[RL]（因變量），[RT]和KD是固定值。比直線化有一定的優(yōu)勢(shì)，其精密度和準(zhǔn)確度均優(yōu)于直線化法。四、雙位點(diǎn)或多位點(diǎn)系統(tǒng)RBA飽和曲線的數(shù)據(jù)處理原因：有些配體的特異性相對(duì)低，能和兩種或兩種以上的受體（或不同亞型）發(fā)生特異結(jié)合結(jié)果：[RL]是兩種或兩種以上特異結(jié)合的和飽和曲線是兩種或更多曲線的和第七節(jié)受體與疾病一、疾病的發(fā)病機(jī)制的研究二、受體異常疾病的診斷三、指導(dǎo)治療四、預(yù)后指標(biāo)五、藥物藥效研究一、受體調(diào)節(jié)過度引起的疾病受體的調(diào)節(jié)是指某種細(xì)胞上的某種受體由于一些因素改變而發(fā)生變化。受體的調(diào)節(jié)可以是受體數(shù)量（密度）的增加或減少，也可以是受體與配體親和力的升高或降低。如果調(diào)節(jié)作用是受體本身和特異性配體發(fā)生結(jié)合反應(yīng)的結(jié)果，則稱為同系調(diào)節(jié)（homologousregulation）。若調(diào)節(jié)作用是其他受體甚至與受體無關(guān)的因素引起的，則稱之為異系調(diào)節(jié)（heterologousregulation）。

生理?xiàng)l件下，受體的調(diào)節(jié)是使機(jī)體更好地適應(yīng)內(nèi)外環(huán)境的變化，可是一旦調(diào)節(jié)過度，則會(huì)引起病理性的后果。如，甲狀腺激素能使多種組織的β腎上腺素受體密度上升，使組織的糖元分解加速，適應(yīng)甲狀腺激素促進(jìn)細(xì)胞能量代謝的需要。但當(dāng)甲狀腺功能亢進(jìn)時(shí)β腎上腺素受體密度的過度增多則可導(dǎo)致心動(dòng)過速或心律失常。

二、受體基因突變所引起的疾病由于遺傳基因的突變而使受體異常，導(dǎo)致疾病產(chǎn)生。主要表現(xiàn)為細(xì)胞產(chǎn)生的受體與內(nèi)源性配體的親和力發(fā)生變化，大多數(shù)是親和力下降。

已知的由于受體基因突變引起的疾病如：ACTH受體發(fā)生突變，腎上腺對(duì)ACTH的反應(yīng)性下降，臨床表現(xiàn)為家族性糖皮質(zhì)激素缺乏癥；胰島素受體β亞單位發(fā)生突變，使機(jī)體對(duì)胰島素的反應(yīng)性下降，臨床表現(xiàn)為A型抗胰島素糖尿病（成年女性）；LH受體Ⅵ跨膜區(qū)突變，導(dǎo)致LHR與LH反應(yīng)下降，臨床表現(xiàn)為家族男性早熟。此外還有一些疾病如抗甲狀腺激素型甲減、家族性糖皮質(zhì)激素缺乏癥、原發(fā)性抗皮質(zhì)醇癥、I型假型醛固酮缺乏癥等都與受體基因突變有關(guān)

三、受體抗體引起的疾病受體是機(jī)體本身的蛋白質(zhì)，正常情況下機(jī)體不會(huì)產(chǎn)生針對(duì)受體的抗體，因而也不會(huì)形成受體與其自身特異性抗體的免疫復(fù)合物。但是在某些病理情況下，機(jī)體產(chǎn)生了針對(duì)某一受體蛋白的特異性抗體，并發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，導(dǎo)致受體功能異常，引起疾病。常見的有：Graves病患者機(jī)體產(chǎn)生抗促甲狀腺激素受體（TSHR）抗體

四、受體與腫瘤有些病人的癌細(xì)胞存在相應(yīng)的受體，有些沒有。激素療法對(duì)有受體的腫瘤有效，對(duì)沒有受體的腫瘤則無效。如乳腺癌ER和PR陽(yáng)性患者激素治療有效，而陰性則治療效果差。此外，檢測(cè)腫瘤組織中的有關(guān)受體對(duì)決定治療方案和預(yù)后判斷都后重要，已成為常規(guī)。如174例急性淋巴細(xì)胞白血病患者骨髓中糖皮質(zhì)激素受體（GCR）的檢查結(jié)果表明：凡是GCR水平低下者，即使經(jīng)治療有所緩解，也往往容易復(fù)發(fā)。雌激素受體陰性的乳腺癌患者，預(yù)后多不良。五、受體的變化是一些疾病的中間環(huán)節(jié)受體的變化是某些疾病的重要中間環(huán)節(jié)，有時(shí)表現(xiàn)為一對(duì)作用相反的受體向相反方向變化，使受體間失平衡，治療上常開發(fā)針對(duì)受體特異性的藥物。如過敏性哮喘時(shí)β腎上腺素受體密度降低，M膽堿受體密度增加，可用β腎上腺素受體激動(dòng)劑減輕癥狀。

六、受體研究是篩選藥物和觀察藥物毒副作用的重要工具

（一）、在藥物作用機(jī)制中的作用

應(yīng)用放射配體結(jié)合分析法研究受體，可了解：（1）藥物作用的特異性是由于特異性受體的存在；（2）受體與藥物的反應(yīng)決定了藥理作用的量效關(guān)系；（3）不僅激動(dòng)劑（Agonist）的藥理作用是通過和受體反應(yīng)而產(chǎn)生的，而拮抗劑（Antagonist）也是如此。用以上概念可解釋各種藥理作用，這就是很多藥物藥理作用的起初反應(yīng)。因此，可把通