公共場(chǎng)所衛(wèi)生檢驗(yàn)方法 第4部分：公共用品用具微生物指標(biāo) 征求意見稿

4公共場(chǎng)所衛(wèi)生檢驗(yàn)方法第4部分：公共用品用具微生物指標(biāo)本文件描述了公共場(chǎng)所公共用品用具表面細(xì)菌總數(shù)、真菌總數(shù)、大腸菌群、金黃色葡本文件適用于公共場(chǎng)所公共用品用具微生物指標(biāo)的檢驗(yàn)，其他場(chǎng)所參GB4789.28食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)3.13.2在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽孢桿菌。3.3金黃色葡萄球菌staphylococcus在Baird-Parker平板上生長(zhǎng)良好，在血平板上可形成完全透3.43.554.2儀器和耗材——高壓蒸汽滅菌器；——干熱滅菌箱；——冰箱：2℃~5℃;——渦旋混合器；——無菌試管：18mm×150mm；——無菌刻度吸管：1mL（0.01mL刻度4.3.1.1成分4.3.1.2制法4.3.2營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基4.3.2.1成分4.3.2.2制法4,4檢驗(yàn)步驟6b)稀釋：將放有采樣后棉拭子的生理鹽水試管在渦旋混合器上充分振搖，此液為1：10的樣品理鹽水稀釋液的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1d)培養(yǎng)：及時(shí)將15mL～20mL冷卻至45℃~50℃的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（可放置于46℃±1℃恒溫水浴箱中保溫）傾注平皿，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻，瓊脂凝固后，將平皿4.5.1可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量（CFU，4.5.3其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋4.5.4平板內(nèi)如有鏈狀菌落生長(zhǎng)時(shí)（菌落之間無明顯界限），應(yīng)將每條鏈（不同來源）作為一個(gè)菌落4,6不同稀釋度菌落計(jì)數(shù)計(jì)算規(guī)則4.6.1若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，再將平N——樣本中菌落總數(shù)，單位為菌落形成單位（CFUn1——適宜范圍菌落數(shù)的第一稀釋度（低）平板個(gè)數(shù)；d——稀釋因子（第一稀釋度）。74.6.3若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300CFU，對(duì)稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，其他平板可記錄為多不可計(jì)，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍4.6.4若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于30CFU，應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。4.7結(jié)果報(bào)告4.7.1公共用品用具細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定結(jié)果按公式（2）得出。A=···························A——一定面積的細(xì)菌總數(shù)測(cè)定結(jié)果（杯具以CFU/cm2為單位報(bào)告，其它公共用品用具以CFU/25cm2）；T——平板平均菌落數(shù)，單位為菌落形成單位（CFUb——稀釋倍數(shù)；k——根據(jù)采樣面積、標(biāo)準(zhǔn)限值單位得出的系數(shù)（杯具的系數(shù)k為50，其他公共用品用具的系數(shù)k4.7.4若所有平板上為蔓延菌落而無法計(jì)數(shù)，則報(bào)告菌落蔓延。4.7.5若空白對(duì)照上有菌落生長(zhǎng)，則此次檢測(cè)結(jié)果無效。4.7.6如果同一件用品采兩份樣品，當(dāng)兩份樣品檢測(cè)結(jié)果不一致，采5.2儀器和耗材——干熱滅菌箱；——冰箱：2℃~5℃;——天平：感量0.1g；——顯微鏡；8——無菌平皿：直徑90mm；——無菌刻度吸管：10mL（0.1mL刻度——滅菌棉拭子；5.3培養(yǎng)基和試劑5.3.1乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)液5.3.1.1成分5.3.1.2制法5.3.2.1成分5.3.2.2制法臨用時(shí)加入乳糖并加熱溶化瓊脂，冷卻至50℃~55℃,加入伊紅和美藍(lán)溶液，搖勻，傾注平皿。5.3.3乳糖發(fā)酵管5.3.3.1成分5.3.3.2制法5.3.4革蘭氏染色液5.3.4.1結(jié)晶紫染色液5.3.4.1.1成分95.3.4.1.2制法5.3.4.2革蘭氏碘液5.3.4.2.1成分5.3.4.2.2制法5.3.4.3脫色劑5.3.4.4沙黃復(fù)染液5.3.4.4.1成分5.3.4.4.2制法5.3.4.5染色法5.4檢驗(yàn)步驟c)分離培養(yǎng)：自產(chǎn)酸、產(chǎn)氣發(fā)酵管中取一接種環(huán)培養(yǎng)液，劃線轉(zhuǎn)種至伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，倒置于36℃±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18有金屬光澤；紫黑色、不帶或略帶金屬光澤；淡紫紅色、中心較深；d)挑取伊紅美藍(lán)瓊脂平板上的典型菌落涂片，進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢；一件用品用具采兩份樣品，當(dāng)兩份樣品檢測(cè)結(jié)果不一致時(shí)，采用陽性檢測(cè)6.2儀器和耗材——高壓蒸汽滅菌器；——冰箱：2℃~5℃;——酒精燈；——離心機(jī)；——無菌平皿：直徑90mm；——無菌刻度吸管：1mL（0.01mL刻度）、10mL（6.3培養(yǎng)基和試劑量濃度=1%）10mL混合，保存于2℃~5℃冰箱內(nèi)。后立即在每個(gè)平皿傾注約15mL～20mL。培養(yǎng)基應(yīng)是致密不透明的。如不及時(shí)使用，可在2℃~5℃），6.4檢驗(yàn)步驟特征。在Baird-Parker平板上金黃2mm～3mm，顏色呈灰黑色至黑色，邊緣整齊、常為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明帶。偶有不分解脂肪的菌株，除沒有混濁帶和透明帶之外，其他外觀基本相同。在血平板上菌落較大，直徑為3mm～5mm，呈圓形、光滑、凸起、濕潤(rùn)，顏色呈金），d)革蘭氏染色鏡檢：挑取典型菌落，涂片、革蘭氏染色，顯微鏡下進(jìn)行觀察。金黃色葡萄球菌制的兔血漿0.5mL，放入小試管中，再加入凝固（即將試管傾斜或倒置時(shí)，呈現(xiàn)凝塊）或凝固體積大于原體積的一半，則判定為陽性結(jié)果。同時(shí)用已知血漿凝固酶試驗(yàn)陽性和陰性的葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的肉湯培養(yǎng)物作為對(duì)照。也可用商品化的試劑，按說明書操作，進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn)。如結(jié)果可疑，挑取營(yíng)養(yǎng)瓊脂小斜7.2儀器和耗材——高壓蒸汽滅菌器；——冰箱：2℃~5℃;——渦旋混合器；——放大鏡或（和）菌落計(jì)數(shù)器——無菌刻度吸管：1mL（0.01mL刻度將蛋白胨、葡萄糖和瓊脂溶于蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH為5.6±0.27,4檢驗(yàn)步驟d)培養(yǎng)：將溶化并冷卻至45℃左右的沙氏瓊脂7.5菌落計(jì)數(shù)7.5.1可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器，記錄7.6不同稀釋度菌落計(jì)數(shù)計(jì)算規(guī)則7.6.1若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，再將平7.6.3若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于150CFU，對(duì)稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，錄為多不可計(jì)，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍7.6.4若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于10CFU，應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。7.7結(jié)果報(bào)告7.7.1公共用品用具真菌總數(shù)的測(cè)定結(jié)果按公A——一定面積的真菌總數(shù)測(cè)定結(jié)果（以CFU/50cm2為單位報(bào)告T——平板平均菌落數(shù)，單位為菌落形成單位（CFUb——稀釋倍數(shù)；k——根據(jù)采樣面積、標(biāo)準(zhǔn)限值單位得出的系數(shù)如采樣面積50cm2，則k=1；如采7.7.4若真菌蔓延生長(zhǎng)覆蓋整個(gè)平板的可記錄為7.7.6如果同一件用品采兩份樣品，當(dāng)兩份樣品檢測(cè)結(jié)果不一致時(shí)，采用檢測(cè)值高的結(jié)果報(bào)8.2儀器和耗材——高壓蒸汽滅菌器；——冰箱：2℃~5℃;——天平：感量0.01g；——渦旋混合器；——微生物生化鑒定系統(tǒng)；——無菌刻度吸管：1mL（0.01mL刻度）、108.3培養(yǎng)基和試劑無菌條件下，將8.3.1.3.1中各成分進(jìn)行混合，充分混勻?qū)?.3.2.1中各成分溶于蒸餾水中，加熱溶解，校正pH至7.3±0.2，121℃滅菌12min，待8.3.53％過氧化氫(H2O2)溶液8.3.5.2制法8.4檢驗(yàn)步驟b)增菌：將放有采樣后棉拭子的生理鹽水試管在渦旋混合器上充分振搖，用無菌吸管或微量移菌落形態(tài)為直徑約2mm～4mm，灰白色、半透明、光滑、表面突起、圓形f)觸酶試驗(yàn)：挑取血瓊脂平板上典型菌落于潔凈的載玻片上，滴加適量3%過氧化氫溶-溶血性鏈球菌。如果同一件用品用具采兩份樣品，當(dāng)兩份樣品檢測(cè)結(jié)果不一致時(shí)，采用陽性檢測(cè)結(jié)果A.1質(zhì)量控制A.1.1培養(yǎng)基和試劑需符合GB4789.28的要求，購(gòu)買國(guó)內(nèi)生產(chǎn)的成品培養(yǎng)基需有中國(guó)食品藥品監(jiān)督管