實時熒光定量PCR檢測多重耐藥菌桿菌基因型技術(shù)規(guī)范

實時熒光定量PCR檢測多重耐藥腸桿菌基因型技術(shù)規(guī)范本文規(guī)定了腸桿菌耐藥菌的耐藥基因檢測的設(shè)備材料、試劑、藥敏試驗、耐藥基因監(jiān)測和生物安全的相關(guān)要求。適用于畜禽源大腸埃希菌、沙門氏菌和其他腸桿菌細菌的耐藥基因檢測技術(shù)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4789.1食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗總則GB19489實驗室生物安全通用要求3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1最低抑菌濃度Minimalinhibitoryconcentration，MIC在瓊脂或肉湯稀釋法藥物敏感性檢測試驗中能抑制肉眼可見的微生物生長的最低抗菌藥物濃度。3.2紙片擴散法Diskdiffusionmethod將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種待測菌的瓊脂平板上，在紙片周圍抑菌范圍內(nèi)待測菌的生長被抑制，從而產(chǎn)生透明的抑菌圈，抑菌圈的大小反映了待測菌對抗菌藥物的敏感程度，即抑菌圈越大，MIC值越小。3.3敏感Susceptible使用推薦劑量的抗菌藥物時，菌株可被達到抗菌活性濃度水平所抑制。3.4中介Intermediate分離菌株的MIC接近抗菌藥物在血液和組織中的水平，對藥物治療的反應(yīng)低于敏感菌株。3.5耐藥Resistant指按常規(guī)劑量表，在抗微生物藥通?？蛇_到的濃度時，菌株不能被抑制；或/和表明抑菌圈直徑縮小到菌株可能產(chǎn)生了微生物耐藥機制的范圍內(nèi)。3.6微量肉湯稀釋法Brothmicrodilutionmethod定量檢測某一抗菌藥物對動物源性細菌的體外抑菌活性的一種標準方法。在藥敏測試板上設(shè)有一系列倍比稀釋濃度的抗菌藥物，通過加入待檢細菌的菌懸液，經(jīng)一定時間的孵育后對藥敏板條進行讀數(shù)，經(jīng)數(shù)據(jù)分析得到MIC值。24設(shè)備和材料4.1.1超凈工作臺4.1.2恒溫培養(yǎng)箱4.1.3立式壓力蒸汽滅菌器4.1.4電熱恒溫調(diào)速振蕩器4.1.5實時熒光定量PCR4.1.6超微量紫外分光光度計4.1.7酶標儀4.1.8pH計4.1.9漩渦混合器4.1.10超低溫冷凍存儲箱4.1.12電熱恒溫鼓風干燥箱4.1.13臺式高速冷凍離心機4.1.14實驗室超純水機4.2培養(yǎng)基4.2.1Mueller-Hinton瓊脂4.2.2Mueller-Hinton肉湯4.2.3結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂（VRBGA）4.3試劑4.3.1Tris-EDTAbuffersolution4.3.250×TAEBuffer4.3.3熒光定量RT-PCR試劑盒4.3.4TaqDNA聚合酶及引物4.4標準質(zhì)控菌株4.4.1大腸埃希菌ATCCTM259224.5對照基因4.5.116SrRNA5耐藥菌污染評價5.1菌株分離將已知的樣品稀釋液與VRBGA培養(yǎng)基混合，于35℃~37℃培養(yǎng)18h~24h，腸桿菌細菌形成粉紅色至紅色，帶有或不帶有沉淀環(huán)的菌落，使用生化實驗對選擇有代表性的菌株進行確認和計數(shù)。5.2菌株鑒定臨床送檢的各種標本中分離獲得的菌株，經(jīng)生化試驗初篩，采用微生物分析儀器或其他等效儀器進行菌種鑒定。6耐藥性檢測6.1紙片擴散法藥敏試驗分離純化后的菌株用0.85%滅菌生理鹽水稀釋，劃線培養(yǎng)于營養(yǎng)瓊脂中，35℃~37℃培養(yǎng)16h~18h，挑取單個菌落，用0.85%滅菌生理鹽水稀釋至0.5麥氏比濁度（此時菌懸液濃度約為1.5×108CFU/mL）。用無菌棉簽蘸取菌懸液，均勻涂布于Mueller-Hinton瓊脂表3面，15min后貼藥敏紙片，每個平板貼4~5張負載不同抗生素的藥敏紙片，藥敏紙片的要求應(yīng)符合附錄B操作。紙片邊緣至培養(yǎng)皿邊緣大于15mm，紙片間距離不小于24mm。將平板倒置于培養(yǎng)箱中，在35℃~37℃恒溫培養(yǎng)16h~18h后，測定抑菌圈直徑。耐藥判定以大腸埃希菌ATCCTM25922為對照。通常細菌對三類或三類以上的抗生素具有耐藥性被稱為多重耐藥細菌（Multidrug-ResistantOrganism，MDRO），記錄耐藥折點和多重耐藥率。6.2微量肉湯稀釋法測定耐藥性于無菌96微孔板的每個孔中加入100μLMH培養(yǎng)基后，在第一列中每孔加入100μL配制的一定濃度的抗生素溶液，使用微量移液器將抗生素溶液與MH培養(yǎng)基混勻，取100μL混合溶液加入微孔板的第二列中，再次混勻后取出100μL混合溶液加入第三列微孔中。依上述方法將抗生素溶液稀釋至第十一列，吸取100μL混合溶液棄去，此時微孔板上每孔留有100μL溶液。微孔板上除第一列和第十二列，每列微孔中抗生素濃度為左側(cè)列的50%。根據(jù)不同抗生素對大腸菌群的作用效果和機制不同，設(shè)置不同的抗生素濃度梯度。為防止邊緣效應(yīng)，微孔板的第一行和最后一行只加入液體培養(yǎng)基，不加抗生素溶液和菌懸液?？梢允褂蒙唐坊乃幟舭?。挑取從同一樣品中分離純化的不同腸桿菌菌株接種于MH肉湯，在震蕩培養(yǎng)箱中于35℃~37℃培養(yǎng)10h~16h。取適量培養(yǎng)后的懸濁液，用滅菌生理鹽水將濁度調(diào)節(jié)到0.5麥氏濁度左右。用MH培養(yǎng)基稀釋樣品1000倍，加入到抗生素梯度稀釋板，每孔添加量為100μL，使微孔板上每孔最終體積為200μL。輕微震蕩微孔板，使孔內(nèi)液體均勻混合。將微孔板置于35℃~37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h~20h后，使用酶標儀在630nm波長測量光密度（OD）值。第十二列上方三個孔注入100μL的MH培養(yǎng)基為陰性對照，下方三個孔注入100μLMH培養(yǎng)基和100μL菌液的懸濁液為陽性對照。每種抗生素設(shè)三個平行。以大腸埃希菌ATCCTM25922為實驗對照組，測定了暴露于梯度濃度抗生素的樣品中腸桿菌細菌的OD值，計算藥物對其抑制率。6.3數(shù)據(jù)分析采用數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件對實驗結(jié)果進行處理、分析與作圖。7耐藥基因與耐藥性的關(guān)系7.1樣品中總細菌DNA提取為了得到濃度和純度較高的DNA樣品，使用基因組DNA快速提取試劑盒對樣品中的DNA進行提取。將富集后的濾膜用無菌剪剪碎，細菌DNA提取過程與檢測步驟按照試劑盒說明書操作。收集DNA樣品到滅菌離心管中，置于-80℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂贸⒘孔贤夥止夤舛扔媽μ崛〉腄NA濃度和純度進行檢驗。記錄濃度值和OD260/OD280值。7.2常見ARGs相對豐度檢測針對養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中常用的幾類抗生素，選取13種環(huán)境中常見抗生素耐藥基因（Antibioticresistancegenes，ARGs），其中包括內(nèi)參基因16SrRNA，使用儀器擴增并純化目的基因片段，引物序列見表。按說明書在PCR板中加入反應(yīng)體系，貼上封板膜，將PCR板置于實時熒光定量PCR中進行反應(yīng)和測定。PCR反應(yīng)條件如下表所示。根據(jù)標準曲線計算各基因相對拷貝數(shù)，用與16SrRNA相對拷貝數(shù)比值來表示各ARGs在樣品中的相對豐度。引物序列表4基因名稱引物5’-3’序列引用文獻PMID16SrRNAtetAtetGtetMaac(6’)-lb-crblaNDMblaTEMblaSHVmcr-1FATGGYTGTCGTCAGCTCGTGRGGGTTGCGCTCGTTGCFGCTACATCCTGCTTGCCTTCRCATAGATCGCCGTGAAGAGGFCATCAGCGCCGGTCTTATGRCCCCATGTAGCCGAACCAFCATCATAGACACGCCAGGACATATRCGCCATCTTTTGCAGAAATCAFTTGGAAGCGGGGACGGAMRACACGGCTGGACCATAFGGTTTGGCGATCTGGTTTTCRCGGAATGGCTCATCACGATCFATGAGTATTCAACATTTTCGRTTACCAATGCTTAATCAGTGFATGCGTTATATTCGCCTGTGRTTAGCGTTGCCAGTGCTCGAFAGTCCGTTTGTTCTTGTGGCRAGATCCTTGGTCTCGGCTTG通用引物2590185225901852259018522400022330023315306340563063405629439754PCR反應(yīng)條件反應(yīng)溫度(℃)退火時間（s）循環(huán)次數(shù)（cycle）95301955406030407.3數(shù)據(jù)處理依據(jù)qPCR得到的數(shù)據(jù)繪制標準曲線，計算相關(guān)系數(shù)，以16SrRNA與ARGs絕對豐度的比值代表ARGs在樣品細菌種群總基因中的相對含量。8生物安全5開展細菌分離鑒定與藥敏試驗等實驗室管理應(yīng)符合GB4789.1、GB19489生物安全要求，廢棄物處理應(yīng)嚴格按照GB19489規(guī)定執(zhí)行。菌株管理按照《動物病原微生物菌(毒)種保藏辦理辦法》執(zhí)行。附錄A（規(guī)范性）培養(yǎng)基A.1Mueller-Hinton肉湯培養(yǎng)基（Mueller-HintonBroth，MHB）A1.1將牛肉粉2.0g、可溶性淀粉1.5g、酸水解酪蛋白17.5g放入1000mL一級水中，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH值7.4±0.2，121℃高壓滅菌15min，備用。A1.2可采用市售的商業(yè)培養(yǎng)基，使用時嚴格遵照制造商的使用說明。A.2Mueller-Hinton瓊脂培養(yǎng)基（Mueller-HintonAgar，MHA）A2.1將牛肉粉2.0g、可溶性淀粉1.5g、酸水解酪蛋白17.5g、瓊脂17.0放入1000mL一級水中，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH值7.4±0.2，121℃高壓滅菌15min，備用。A2.2可采用市售的商業(yè)培養(yǎng)基，使用時嚴格遵照制造商的使用說明。附錄B（規(guī)范性）腸桿菌耐藥性檢測的質(zhì)量控制B.1藥物紙片的質(zhì)控B1.1均勻性實驗以標準菌株接種于MHA平板，直徑150mm平板最多貼12張紙片，直徑100mm平板最多貼6張，紙片中心間距不少于24mm。35℃~37℃培養(yǎng)16~18h，測量記錄每個抑菌環(huán)直徑。每個抑菌圈直徑都應(yīng)該清晰可測量，保持平板在反射光照明的黑色背景上方，肉眼觀察無明顯生長的區(qū)域作為抑菌圈邊緣。甲氧芐啶和磺胺類藥物抑菌圈內(nèi)可允許出現(xiàn)菌株輕微生長，在測定直徑時可忽略輕微生長（20%或更少），測定較明顯抑制的邊緣。B1.2準確度判斷計算出均勻性實驗中得出的直徑的平均值，與標準菌株的直徑限度范圍（見表C.1）對照，確定紙片的實際含藥量與標準是否一致，以此來判定折