手足口病實驗室檢測方案

手足口病實驗室檢測方案為規(guī)范手足口病的標本采集、運送及實驗室檢測操作程序，提高檢測準確性，從而為手足口病的明確診斷和相關(guān)實驗研究提供可靠的依據(jù)，特制定本方案。手足口病的實驗室檢測原則和程序手足口病的診斷一般是通過采集適當?shù)呐R床標本后進行病毒分離和病毒鑒定，如果沒有采到合適的臨床標本，或無法進行病毒分離，也可以通過血清學檢測（如中和實驗）來檢測血清中的中和抗體，或直接從臨床標本中檢測病毒的核酸來診斷（見下圖：手足口病的實驗室診斷流程圖）。一般是由省級病毒實驗室進行病毒的分離，爆發(fā)疫情范圍較大時，國家參比實驗室也可以提供技術(shù)支持。病毒分離成功后，送至國家參比實驗室進行鑒定或復核，同時對全國手足口病的病原進行病毒學監(jiān)測。國家參比實驗室接到標本后，在30日內(nèi)將結(jié)果反饋給省級實驗室。很多血清型的腸道病毒能引起手足口病，不同細胞系對不同病毒的敏感性是有所不同的，而不同時期腸道病毒的流行株也不同。通常用于腸道病毒分離的細胞系為RD細胞（對CA16和EV71敏感）、HEp-2細胞（對某些柯薩奇B組病毒敏感）等，聯(lián)合使用上述兩種或更多細胞（如Vero細胞）有助于分離到更多的腸道病毒。使用血清型特異性的中和抗血清進行的中和實驗是腸道病毒鑒定的基本方法，如果使用了適當?shù)目寡?，實驗結(jié)果是比較可靠的。因為腸道病毒包括若干個血清型，通常使用組合抗血清進行鑒定，有些組合抗血清已經(jīng)商品化。當無法進行病毒分離或得不到適用于病毒分離用的標本時，血清學檢測可以為腸道病毒的感染提供一個間接的證據(jù)。一般用急性期血清及恢復期血清的檢測結(jié)果進行比較，抗體滴度呈四倍或以上增高證明有急性感染。但是，無癥狀的腸道病毒感染也是常見的，所以對檢測結(jié)果的解釋要慎重一些。為了提高檢測速度，也為了輔助中和實驗法進行毒株鑒定，最近很多實驗室都使用分子生物學方法。目前，用分子生物學方法對腸道病毒進行定型還沒有統(tǒng)一的標準，而且要根據(jù)檢測目的選擇使用適用的方法。檢測結(jié)果的評價如果從臨床標本中分離到腸道病毒，尤其是分離自腦脊液、皰疹液，那么很可能該病毒就是病因病原。當無法進行病毒分離或未分離到病毒時，血清學診斷方法可以作為病毒感染的間接證據(jù)。對于難以分離到的腸道病毒，分子生物學方法如RT-PCR是很有用的。腸道病毒有時引起無癥狀感染，所以實驗結(jié)果的實際意義應結(jié)合臨床過程和流行病學資料進行解釋。實驗室診斷標準根據(jù)手、足、口等部位典型皮疹即可作出HFMD臨床診斷，流行病學接觸史有助于診斷，臨床診斷病例中符合下列之一，即為實驗室診斷病例：1，患者的糞便標本、咽拭子標本中病毒分離陽性率遠高于對照人群；2，腸道病毒型特異性中和抗體滴度≥1∶256；或恢復期血清中腸道病毒型特異性中和抗體較急性期有4倍或4倍以上增高；3，在病變組織中如皰疹液或腦脊液中分離到病毒；4，自患者血清、皰疹液或腦脊液等標本中檢測到病原體核酸。

一、標本采集對象標本采集對象是暴發(fā)疫情出現(xiàn)時手足口病的臨床診斷病例和病例發(fā)病所在社區(qū)（村）的臨近無病例的社區(qū)（村）或托幼機構(gòu)的5歲以下的兒童（作為健康對照人群）。用于病毒分離的標本包括糞便、咽拭子和皰疹液，如果患者出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，可以采集腦脊液標本。對于血清學診斷，需要在急性期和恢復期采集雙份血清標本。臨床標本在運輸和貯存過程中要避免反復凍融，如果不能確保-20℃的條件，應該在0~8℃運輸和保存。標本應冷凍運輸，運輸時要附有必要的信息，如標本編號、發(fā)病日期和標本采集日期。二、標本種類及采集、運送（一）糞便標本采集病人發(fā)病7日內(nèi)的糞便標本，用于病原檢測。糞便標本采集量5~8g/份，采集后立即放入無菌采便管內(nèi)，4℃暫存立即(12h內(nèi))送達實驗室，－20℃以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標本存于－70℃冰箱。（二）咽拭子標本采集病人發(fā)病3日內(nèi)的咽拭子標本，用于病原檢測。用專用采樣棉簽，適度用力拭抹咽后壁和兩側(cè)扁桃體部位，應避免觸及舌部；迅速將棉簽放入裝有3~5ml保存液（維持液或生理鹽水，推薦使用維持液）的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，以防干燥。4℃暫存立即（12h內(nèi)）送達實驗室，－20℃以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標本存于－70℃冰箱。（三）血清標本采集急性期（發(fā)病0~3d）和恢復期（發(fā)病14~30d）雙份配對血清用于抗體檢測。靜脈采集3~5ml全血，置于真空無菌采血管中，自凝后，分離血清，將血清置于－20℃以下冰箱中冷凍保存。（四）皰疹液在手足口病的實驗室診斷中，從皰疹液中分離到病毒具有很高的診斷價值，可同時采集多個皰疹作為一份標本。先用75%的酒精對皰疹周圍的皮膚進行消毒，然后用消毒針將皰疹挑破用棉簽蘸取皰疹液，迅速將棉簽放入內(nèi)裝有3~5ml保存液（維持液或生理鹽水，推薦使用維持液）的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封。所采集標本4℃暫存立即（12h內(nèi)）送達實驗室，－20℃以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標本存于－70℃冰箱。（五）腦脊液標本出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的病例，要采集腦脊液標本，進行病原和抗體檢測，從腦脊液中分離病毒也具有很高的診斷價值。采集時間為出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀后3天內(nèi)，采集量為1.0~2.0ml。采集后立即裝入無菌帶墊圈的凍存管中，4℃暫存立即(12h內(nèi))送達實驗室，－20℃以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標本存于－70℃冰箱。（六）病例密切接觸者的標本采集選擇典型病例所在的托幼機構(gòu)、或所在村，以新發(fā)病例密切接觸者為采樣對象，采集單份糞便和血清標本。（七）健康對照的標本采集選擇患兒發(fā)病所在社區(qū)（村）的臨近無病例的社區(qū)（村）或托幼機構(gòu)。采集5歲以下的兒童單份糞便和血清標本。三、標本采集注意事項在手足口病的實驗室診斷中，從皰疹液或腦脊液中分離病毒具有很高的診斷價值，但對于不同血清型的腸道病毒，腦脊液中的病毒分離率是大不相同的。用于采集咽拭子的無菌拭子要放在適當?shù)谋４嬉褐校缇S持液或生理鹽水，以防干燥。用于分子生物學診斷的標本采集及病毒分離標本的采集方法一樣。為了保證檢測結(jié)果的準確性和有效性，標本應在病例發(fā)病后盡早采集，盡快檢測。不能立即檢測的標本應冷凍保存。對于血清學診斷，急性期血清應該在發(fā)病后盡早采集，恢復期血清在發(fā)病兩周后采集。四、實驗室檢測操作流程（一）病毒分離1.試劑配置（1）細胞的生長液、維持液的配制見下表生長液（GM）維持液（MM）Eagle`s液(MEM)86.5ml92.5mlL-谷氨酰胺200mM1.0ml1.0ml胎牛血清10.0ml2.0ml7.5%NaHCO3溶液2.5ml3.5mlP.S溶液*(青霉素及鏈霉素)1.0ml1.0ml（2）糞便標本的處理液完全PBS液中加入P．S溶液，終濃度為青霉素500單位/ml，鏈霉素為500μg/ml。2．病毒分離細胞系許多細胞系可支持人腸道病毒（如EV71、CA16）生長。對于檢測手足口病的病原來說，建議所有懷疑含EV71、CA16的標本均需接種到以下兩種細胞系：RD細胞，來源于人橫紋肌肉瘤細胞。HEp-2細胞，來源于人喉癌上皮細胞。3．標本的處理（1）糞便標本的處理操作步驟：1.1在離心管上標記標本號；1.2每管中加入10mlPBS、1g玻璃珠、1ml氯仿；1.3在生物安全柜中將每一份糞便標本取大約2g加入標記好的離心管中（確保離心管上的標號及原始標本的標號一致）；1.4剩余的原始標本最好留在原容器中，凍存于－20℃；1.5確保擰緊離心管，用機械震蕩器劇烈震蕩20min；1.6在確保離心機的蓋子蓋好和離心桶密封的情況下，用冷凍離心機在1500g條件下離心20min；1.7在生物安全柜中將每一份標本的上清液分別吸入2個有外螺旋蓋的凍存管中（如果上清液不清澈，應再用氯仿處理一次）；1.8一管糞便懸液凍存于－20℃作為備份，另一管存于4~8℃以備接種。（2）皰疹液標本的處理皰疹液標本通常直接用于病毒分離。（3）腦脊液標本的處理腦脊液標本通常直接用于病毒分離。（4）咽拭子標本的處理咽拭子要在標本運輸（保存）液中充分攪動（至少40下），以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的細胞等，然后在4℃條件下，10000rpm離心20min，用上清接種到細胞上，如果發(fā)現(xiàn)有細菌污染，須用濾器過濾除菌。4．接種和觀察（病毒分離）（1）顯微鏡下觀察單層細胞，以確保細胞是健康的。一個健康的單層細胞會在傳代后3d左右形成；（2）倒掉生長液（GM），換上1~1.2ml的維持液（MM）；（3）每一份標本需要同時接種2支RD細胞和2支HEp-2細胞，正確標記每支細胞培養(yǎng)管（包括標本的編號、日期、傳代數(shù)）；（4）每一種細胞至少標記一管作為陰性對照；（5）每支試管接種0.2ml的標本懸液，培養(yǎng)溫度要求36℃（對于AHC標本的病毒分離，尤其是EV70的分離培養(yǎng)，強烈建議降低培養(yǎng)溫度，一般可為34~35℃）；（6）使用倒置顯微鏡每天觀察細胞培養(yǎng)管，以觀察有特征性的腸道病毒致細胞病變效應（CPE）的出現(xiàn)（如細胞變圓，折光增強并脫離管壁等）；（7）記錄接種管和對照管細胞所發(fā)生的變化至少一周，記錄CPE（1+~4+）、提示細胞受毒性反應、老化或污染的影響而發(fā)生的變化（1+，<25%;2+,25%~50%;3+,50%~75%;4+,75%~100%）；（8）如果有特征性的腸道病毒CPE出現(xiàn)，要如實記錄，并觀察直到75%的細胞發(fā)生變化（3+CPE），然后儲藏在－20℃以備二次傳代。同一病例的二次傳代的病毒分離物可以放到一起用于進一步的鑒定；（9）第1代培養(yǎng)見可疑細胞病變時繼續(xù)傳代，待細胞病變穩(wěn)定出現(xiàn)后－20℃或－70℃凍存；（10）一代陽性分離物再傳二代，如果又有明顯的CPE出現(xiàn)，將病毒保存在－20℃冰箱（二代病毒）。因二代病毒滴度高于用一代病毒，所以選用二代病毒進行鑒定。（11）如果7d之后沒有CPE出現(xiàn)，那么盲傳1代繼續(xù)觀察7d。（注意：同一病例標本的細胞培養(yǎng)物不能混在一起再傳代，例如：不同細胞的培養(yǎng)物應單獨傳代）；（12）盲傳2代后，仍然沒有出現(xiàn)CPE的，則判定為陰性；（13）注意：如果接種后24h內(nèi)出現(xiàn)CPE，很可能是標本中的非特異性成分導致的毒性反應。取100μl陽性分離物傳二代，繼續(xù)觀察；或者在接種標本吸咐1h后用維持液清洗細胞層，可能會降低毒性反應。（14）幾個概念：A：毒性反應：如果在接種后1~2d內(nèi)細胞快速地調(diào)亡，這可能是由于標本中含有毒性物質(zhì)而導致的非特異性毒性反應。這些已接種標本的試管應在－20℃凍存，融化后取0.2ml接種到同一類型細胞中（此時是第二代）。如果又出現(xiàn)了毒性反應，那么應該取原始標本用PBS稀釋10倍，再次接種到同種細胞中。這時應被認為是第一代。B：微生物污染：由于細菌污染而造成培養(yǎng)液混濁或細胞死亡經(jīng)常使病毒造成的CPE無法確定或根本無法出現(xiàn)。重新取原始標本，用氯仿處理，按上述步驟重新接種到新鮮細胞上。C：盲傳：有時一周之后傳代細胞會老化，甚至細胞對照也出現(xiàn)了病變。這時已接種標本的試管應在－20℃凍存，融化后取0.2ml接種到同一類型的新鮮單層細胞中，再觀察7~10d。如果盲傳兩代后仍然沒有產(chǎn)生CPE，那么認為這個標本是陰性的。5．病毒分離結(jié)果解釋：RD細胞支持HFMD的主要病原體——CA16和EV71的復制，CA16和EV71均能在RD細胞培養(yǎng)中引起特殊的腸道病毒致細胞病變效應（CPE），表現(xiàn)為細胞圓縮、分散、胞漿內(nèi)顆粒增加，最后細胞自管壁脫落。但相同滴度的CA16和EV71在RD細胞中生長的速度不同，EV71的生長速度要快于CA16，表現(xiàn)為EV71感染RD細胞后出現(xiàn)CPE的時間比CA16早，EV71接種細胞后出現(xiàn)CPE很快，但CA16一般要經(jīng)過2次以上傳代才出現(xiàn)明顯的CPE。若在使用RD細胞分離的同時再增加HEp-2細胞，可提高腸道病毒的分離率（分離出其它可能致HFMD的病原體，如一些柯薩奇B組病毒）。但CA16和EV71在HEp-2細胞中均不繁殖。從HFMD患兒的腦脊液、血液、皰疹液等臨床標本中分離出病毒有診斷價值，但單從咽拭子或糞便中分離到病毒不能確診。從有上述臨床癥狀群患者的咽拭子或糞便中重復分離到同一型病毒，且從周圍患同樣疾病者中也檢出相同的病毒，且病毒分離率遠高于正常人群，則有診斷的參考價值。（二）測定人雙份血清標本的中和抗體滴度比較患者急性期血清及恢復期血清中和抗體滴度，可作為腸道病毒感染的血清學診斷方法，最常用的是中和實驗，即用微量板法測定抗體滴度，是目前人腸道病毒抗體檢測的最常用方法，該方法精確且具有型特異性。作為腸道病毒感染的診斷方法之一，可以測定血清（或腦脊液）中腸道病毒中和抗體的滴度，通常用急性期血清及恢復期血清滴度進行比較，抗體滴度4倍或4倍以上增高證明病毒感染。但是，不明顯的腸道病毒感染（隱性感染）也很常見，所以在評估檢測結(jié)果時就要小心一些。在中和實驗中，一般要用人腸道病毒參考毒株（即原型株，EV71原型株為BrCr株，CA16原型株為G-10株），有時同時（或單獨）使用臨床分離株會有助于得到更準確的檢測結(jié)果。使用對腸道病毒敏感的細胞，如RD細胞。用病毒（血清）稀釋液（下面液體配制中的C液，可用維持液代替）稀釋血清和制備病毒懸液，因為是用病毒來確定血清（CSF）中抗體的滴度，所以要使用參考病毒（原型株），但有時使用所分離到的毒株（臨床分離株）有助于得到更準確的檢測結(jié)果，當然，分離株的滴度（100CCID50/0.05ml）要事先測定。中和實驗的檢測原理：病毒感染敏感靶細胞后，引起細胞形態(tài)學變化，出現(xiàn)致細胞病變效應（CPE），特異性中和抗體及病毒結(jié)合后，可使病毒顆粒失去感染性，抑制CPE的出現(xiàn)。1．液體配制A液：血清處理液：（100ml中含下列液體）MEM 85ml3%L-谷氨酰胺 1ml7.5%碳酸氫鈉 2ml胎牛血清 2ml青、鏈霉素（各10000U/ml） 10mlB液：細胞營養(yǎng)液：（按生長液配方配制，100ml中含下列液體）MEM 85ml3%L-谷氨酰胺 1ml7.5%碳酸氫鈉 2mlHEPES 1ml胎牛血清 10ml青、鏈霉素（各10000U/ml） 1mlC液：病毒（血清）稀釋液：（按維持液配方配制，100ml中含下列液體）MEM 93ml3%L-谷氨酰胺 1ml7.5%碳酸氫鈉 2mlHEPES 1ml胎牛血清 2ml青、鏈霉素（各10000U/ml） 1ml2．攻擊病毒CCID50滴定和滴度梯度制備（1）將增殖后的病毒懸液凍融3次，然后在4℃、12000rpm條件下離心10min，取上清液分裝于2支凍存管中，每管1.5ml，一般每管應在一次試驗中用完，有剩余者應廢棄；（2）加Eagle液10倍系列稀釋為10-1至10-8病毒液，各加入細胞板內(nèi)，每孔50μl，每稀釋度4孔細胞；（3）每孔加細胞懸液50μl，同時設(shè)細胞對照（50μl稀釋液+50μl細胞懸液），36℃培養(yǎng)7d，觀察細胞病變；（4）按Behrens-K?rber公式計算出分離病毒株的CCID50；logCCID50=L-d(S-0.5)，其中：L=實驗中使用的最低稀釋度的log值；d=稀釋梯度的log值；S=終判時陽性部分的總和（即出現(xiàn)CPE的細胞孔所占的比例之和）。（5）正式試驗前應先滴定攻擊病毒2~3次，取其平均值，求出每0.05ml中含100CCID50的病毒載量；（6）按照計算好的稀釋比例配制攻擊病毒，求出試驗所需的病毒總量（即100CCID50/0.05ml）；（7）取3支小試管，每只加病毒稀釋液（液體配制中的C液）0.9ml；（8）用帶濾芯的吸尖（ART吸尖）吸0.1ml已經(jīng)稀釋好的攻擊病毒液（即10CCID50/0.05ml）到第一支小試管中，換另一支ART吸尖，輕輕并徹底地混勻，避免產(chǎn)生大量氣溶膠，按照此方法依次稀釋至1CCID50/0.05ml和0.1CCID50/0.05ml。3．稀釋血清（1）發(fā)病1~3d內(nèi)采取患者急性期血清，發(fā)病后2~4周采取恢復期血清，分別－20℃凍存?zhèn)錂z。（2）取無菌小試管若干支（每份血清使用一支）置試管架上，每管加血清處理液（上面液體配制中的A液）0.3ml，加待測血清0.1ml，蓋緊塞子，震搖混勻，放4℃冰箱過夜，即為1：4稀釋血清。次日56℃、30min滅活。（3）打開獨立無菌包裝48孔組織培養(yǎng)板，縱向使用，每孔加血清稀釋液（上面液體配制中的C液）0.3ml，每份血清使用一排，每排4孔。使用移液器取處理過的血清0.1ml加入第一孔（即為1：16），吹吸8~10次，吸0.1ml加入第二孔（即為1：64），依次至1：1024，血清稀釋的過程中不必換吸尖。即每份血清標本進行4倍倍比稀釋，即1：4、1：16、1：64、1：256、1：1024。（4）每份血清標本的每個稀釋度都要平行做兩孔。4．病毒中和抗體測定的操作步驟：（1）取一塊96孔板橫向使用，每塊板可以做8份（4對）待測血清，版面設(shè)計如下圖所示。A1-A2孔（B1-B2、C1-C2、D1-D2、E1-E2、F1-F2、G1-G2、H1-H2）中每孔加入1:1024稀釋度的待測血清0.05ml，不必換吸尖，在A3-A4孔（B3-B4、C3-C4、D3-D4、E3-E4、F3-F4、G3-G4、H3-H4）中每孔加入1:256稀釋度的待測血清0.05ml，A5-A6孔（B5-B6、C5-C6、D5-D6、E5-E6、F5-F6、G5-G6、H5-H6）中每孔加入1:64稀釋度的待測血清0.05ml，A7-A8孔（B7-B8、C7-C8、D7-D8、E7-E8、F7-F8、G17-G8、H7-H8）中每孔加入1:16稀釋度的待測血清0.05ml，A9-A10孔（B9-B10、C9-C10、D9-D10、E9-E10、F9-F10、G9-G10、H9-H10）中每孔加入1:4稀釋度的待測血清0.05ml，A11-A12孔（B11-B12、C11-C12、D11-D12、E11-E12、F11-F12、G11-G12、H11-H12）為每份待測血清對照孔，每孔中補加稀釋液0.05ml；（2）上述孔中分別加入病毒0.05ml（病毒滴度事先已經(jīng)稀釋為100CCID50/0.05ml）；（3）蓋好蓋子后用微量板混勻器混勻，放入36℃CO2孵箱中孵育2h；（4）另取一塊96孔板縱向使用，做100CCID50/0.05ml病毒滴度的核實（每次實驗都必須做）。每孔先加病毒稀釋液（試劑配制中的C液）0.05ml，然后從0.1CCID50/0.05ml加起，每孔0.05ml，每個稀釋度8孔，不必更換吸尖，一直加至100CCID50/0.05ml；同時留出4孔做為細胞對照孔，每孔加入0.1ml病毒稀釋液，然后放入4℃冰箱中暫存；（5）在孵育期間，用消化液消化細胞，準備細胞懸液，細胞懸液的濃度為2×105個/ml，每塊96孔板至少需要準備10ml；（6）孵育結(jié)束后每個待測血清孔、血清對照孔（待檢標本板）和病毒回滴孔和細胞對照孔（病毒回滴板）分別加入0.1ml細胞懸液，然后用微量板混勻器混勻，放入36℃CO2孵箱中孵育培養(yǎng)；（7）使用倒置顯微鏡每天觀察CPE，并記錄病毒滴定結(jié)果，以不產(chǎn)生細胞病變的血清最高稀釋度的倒數(shù)為終點效價。當100CCID50/0.05ml的病毒對照孔出現(xiàn)完全病變時，判定最終結(jié)果（約5~7d）；（8）注意：如果病毒對照結(jié)果（病毒回滴）不在32~320CCID50/0.05ml的范圍內(nèi)，實驗無效，就要重復實驗。5．結(jié)果判定：當最高稀釋度血清的2孔中有1孔出現(xiàn)細胞病變，另一孔不出現(xiàn)細胞病變，該稀釋度的倒數(shù)計即為該血清標本的中和抗體效價；當高稀釋度2孔完全病變，相鄰低稀釋度2孔完全不病變，則兩者平均稀釋度的倒數(shù)即為該血清標本的中和抗體效價；當兩個相鄰稀釋度血清均出現(xiàn)1孔細胞病變，另1孔不出現(xiàn)細胞病變，則兩者平均稀釋度的倒數(shù)即為該血清標本的中和抗體效價。對于HFMD的雙份血清中和實驗結(jié)果來說，如果恢復期血清較急性期血清EV71或CA16中和抗體滴度出現(xiàn)4倍或4倍以上增高即可確診；如果恢復期血清較急性期血清其它腸道病毒中和抗體滴度出現(xiàn)4倍或4倍以上增高可證實該腸道病毒感染，是否為病因需要其它相關(guān)實驗證實；如果單份血清中和抗體滴度大于1:256也有診斷意義，血清中和抗體滴度為1:128判定為可疑陽性。（三）逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）1．RNA提取可使用商業(yè)化試劑盒來提取RNA，如使用QIAGENViralRNAMiniExtractionKit（CAT：52904）從臨床標本或病毒分離培養(yǎng)物中提取病毒RNA；（1），向一支1.5ml離心管中加入560μl的AVL緩沖液（含CarrierRNA）；（2），再向這支離心管中加入140μl臨床標本或病毒分離培養(yǎng)物，充分混勻至少15s；（3），室溫下（15℃~25℃）放置10min，然后瞬時離心；（4），加入560μl純酒精，充分混勻至少15s，瞬時離心；（5），小心加入約630μl的混合溶液至QIAamp柱中（試劑盒附帶），將QIAamp柱套在收集管上，然后8000rpm離心5s，使液體通過濾膜；（6），棄去收集管中的液體，重復第6步驟；（7），棄去收集管中的液體，小心加入750μl的AW1緩沖液，8000rpm離心5s，使液體通過濾膜；（8），棄去收集管中的液體，小心加入750μl的AW2緩沖液，8000rpm離心5s，使液體通過濾膜；（9），棄去收集管中的液體，13000rpm再次離心1min；（10），將QIAamp柱放入一支干凈的1.5ml的離心管中；（11），向膜上加入40μl的EB緩沖液，然后室溫下靜置2~5min；（12），在離心機中以8000rpm的速度離心1min，離心下來的液體即為所需的核酸溶液。2．RT-PCR擴增（1）引物序列合成1）人腸道病毒（包括EV71、CA16）核酸檢測通用引物序列：PE2（上游）：5`-TCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCC-3`PE1（下游）：5`-ACACGGACACCCAAAGTAGTCGGTCC-3`2）EV71核酸檢測引物序列：EV71-S（上游）：5`-GCAGCCCAAAAGAACTTCAC-3`EV71-A（下游）：5`-ATTTCAGCAGCTTGGAGTGC-3`3）CA16核酸檢測引物序列：CoxA16-S（上游）：5`-ATTGGTGCTCCCACTACAGC-3`CoxA16-A（下游）；5`-TCAGTGTTGGCAGCTGTAGG-3`（2）實驗設(shè)計1）在PCR記錄紙（實驗記錄紙）上記錄本次實驗操作者姓名，實驗日期，所鑒定標本的名稱以及標本的順序，及PCR儀排列的順序一致。2）標記好加標本和對照的PCR管（陽性對照，陰性對照和試劑對照）。A：陽性對照：無感染性的對照RNA。B：細胞對照：使用未接種病毒的細胞懸液，最好使用及擴增病毒所用的細胞類型及代數(shù)相同的細胞。每一次實驗設(shè)2個細胞對照。C：試劑對照：用去離子水代替標本。（3）RT-PCR擴增1）在冰面上融化病毒標本和各種PCR試劑；2）配下列試劑主溶液：10×PCRBuffer···································································5.0μldNTPs（2.5mMeach）·······················································2.0μl上游引物（0.1μg/μl）·························································1.0μl下游引物（0.1μg/μl）·························································1.0μlRNA酶抑制劑（RNasin,40U/μl）······································0.5μlTaqDNA聚合酶（5U/μl）·················································0.5μlAMV逆轉(zhuǎn)錄酶（10U/μl）··················································1.0μl模板RNA·······································································