動物A型流感病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型和歐洲型三重實時熒光RT-PCR檢測方法

1動物A型流感病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型和歐洲型三重熒光RT-PCR檢測方法本文件規(guī)定了動物A型流感病毒與北美種和歐洲種豬繁殖與呼吸綜合征病毒三重熒光RT-PCR檢測方本文件適用于動物A型流感病毒與北美種和歐洲種豬繁殖與呼吸綜合征病毒的4縮略語AIV-A：動物A型流感病毒（AnimalInfluenzaAVirus）PRRSV-NA：北美種豬繁殖與呼吸綜合征病毒（NorthAmericanPorcineRespiratoryandReproductiveSyndromeVirus）PRRSV-EU：歐洲種豬繁殖與呼吸綜合征病毒（EuropeanPorcineRespiratoryandReproductiveSyndromeVirus）2FAM:6-羧基熒光素(6-CarboxyfluorescHex：六氯-6-甲基熒光素（6-HexachlBHQ：熒光淬滅基團多通道熒光PCR儀、生物安全柜、冰箱（2℃~6℃和-20℃)、臺式冷凍離心機、組織勻漿機、漩渦6試劑和材料6.1病毒總核酸提取試劑TIANampVirusDNA/R照GB/T6682《分析實驗室用水規(guī)格和試驗引物和探針序列見附錄B。7病料采集和處理8病毒總核酸的提取表1一步法多重熒光RT-PCR反應體系（總體積20uL）31×Multiplex酶混合液11×5注：1.引物混合物指的是3種病原的所有引物；2.此反應體積以Path-IDTMMultiplexone-stepRT-PCRkit9.2熒光RT-PCR反應程序表2熒光RT-PCR反應程序48℃9.3結果描述及判定9.3.1質控標準所有陽性對照（FAM、Cy5和Hex）均有S形擴增曲線，陰性對照（FAM、Cy5和Hex）均無9.3.2結果判斷和鑒別Ct值仍然<40，則判定為核酸檢測陽性，如果Ct45atgagtcttctaaccgaggtcgaaacgtatgttctctctatcgttccgtcaggccccctcaaagccgagatagcgcagagactcgaagatgtgtttgcagggaaaaacaccgatcttgaagcactcatggaatggttaaagacaagaccaatcctgtcacctctgactaaggggattttaggatttgtgttcacgctcaccgtgcccagtgagcgaggactgcagcgtagacgctttgtccagaatgccctaaatgggaatggtgatccgaacaacatggacaaagcggtcaaactgtacagaaaacttaaaagggaaataacattccacggggccaaagaagtagcgctcagttactctgctggtgcacttgccagttgcatgggcctcatatacaacagaatggggactgtcaccgctgaggtggcctttggtctagtatgcgcaacctgtgaacaaattgctgattcccagcatcgatctcatagacaaatggtgacaacaaccaatccactaatcaggcatgagaacagaatggtactagccagcacaacagctaaagccatggaacaaatggctggatcaagtgaacaagcagcagaggctatggaggttgctagccaggctagacaaatggtacaggcaatgagaacaattgggactcaccctagttccagtgctggtctaaaagatgatcttcttgaaaatctacaggcctatcagaaacgaatgggagtgcaaatgcaacgattcaagtgatcctctcattgctgccgcaagcatcattgggattttgcacctgatattgtggattcttgatcgtctttttttcaaatgcatttaccatcactttaaatatggtcgaaaaagagggccttctacggaaggagtgccggagtccatgagggaagaatatcggcagaaacagcagagtgctgtggatgttgacgatggtcattttgtcaacatagtgctagagtaaatgccaaataacaacggcaagcagcaaaagaaaaagaaggggaatggccagccagtcaatcagctgtgccaaatgctgggtaagatcatcgcccaacaaaaccagtccagaggcaagggaccggggaagaaaaataggaagaaaaacccggagaagccccatttccctctagcgactgaagatgacgtcaggcatcactttacccctagtgagcggcaattgtgtctgtcgtcgatccagactgccttcaatcagggcgctggaacttgtgccctgtcagattcagggaggataagttacactgtggagtttagtttgccgacgcaacatactgtgcgtctgatccgcgccacagcatcaccctcagcgtgaatggccggtaaaaaccagagccagaagaaaaagaaaagtacagctccgatggggaatggccagccagtcaatcaactgtgccagttgctgggtgcaatgataaagtcccagcgccagcaacctaggggaggacaggccaa6aaagaaaaagcctgagaagccacattttcccctggctgctgaagatgacatccggcaccacctcacccagactgaacgctccctctgcttgcaatcgatccagacggctttcaatcaaggcgcaggaactgcgtcgctttcatccagtgggaaggtcagttttcaggttgagttcatgctgccggttgctcatacagtgcgcctgattcgcgtgacttctacatccgccagtcagggtgcaagttaa7sN基因N基因M基因Cy5-ACGCTCACCGTGCCS8向裝有310μgCarrierRNA凍干粉的管子中加入310μLRNase-FreeddH2O，將CarrierRNA徹底溶解，得到終濃度為1μg/μL的溶液，并分裝、置于-20℃儲存。根據(jù)樣品數(shù)量計算所需緩沖液GB和CarrierRNA溶液的體積（計算公式如下1和2），將緩沖液GB與CarrierRNA溶液顛倒混勻，即得到CarrierRNA工作液；為避免溶液出現(xiàn)起泡現(xiàn)象，請勿使用渦旋公式（1）y=nxm公式（1）中：y為需要加入緩沖液GB的體積（mLn為同時提取的樣品個數(shù)；公式（2）Z=YXX公式（2）中：z為需要加入CarrierRNA溶液的體積(μLy為需要加入緩沖液GB的體積（mL），2.5加入250μL無水乙醇，渦旋振蕩15sec，徹底混勻，在室溫