動物A型流感病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型和歐洲型三重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測方法_第1頁
動物A型流感病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型和歐洲型三重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測方法_第2頁
動物A型流感病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型和歐洲型三重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測方法_第3頁
動物A型流感病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型和歐洲型三重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測方法_第4頁
動物A型流感病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型和歐洲型三重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測方法_第5頁
已閱讀5頁,還剩10頁未讀 繼續(xù)免費(fèi)閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡介

1動物A型流感病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型和歐洲型三重?zé)晒釸T-PCR檢測方法本文件規(guī)定了動物A型流感病毒與北美種和歐洲種豬繁殖與呼吸綜合征病毒三重?zé)晒釸T-PCR檢測方本文件適用于動物A型流感病毒與北美種和歐洲種豬繁殖與呼吸綜合征病毒的4縮略語AIV-A:動物A型流感病毒(AnimalInfluenzaAVirus)PRRSV-NA:北美種豬繁殖與呼吸綜合征病毒(NorthAmericanPorcineRespiratoryandReproductiveSyndromeVirus)PRRSV-EU:歐洲種豬繁殖與呼吸綜合征病毒(EuropeanPorcineRespiratoryandReproductiveSyndromeVirus)2FAM:6-羧基熒光素(6-CarboxyfluorescHex:六氯-6-甲基熒光素(6-HexachlBHQ:熒光淬滅基團(tuán)多通道熒光PCR儀、生物安全柜、冰箱(2℃~6℃和-20℃)、臺式冷凍離心機(jī)、組織勻漿機(jī)、漩渦6試劑和材料6.1病毒總核酸提取試劑TIANampVirusDNA/R照GB/T6682《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)引物和探針序列見附錄B。7病料采集和處理8病毒總核酸的提取表1一步法多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)體系(總體積20uL)31×Multiplex酶混合液11×5注:1.引物混合物指的是3種病原的所有引物;2.此反應(yīng)體積以Path-IDTMMultiplexone-stepRT-PCRkit9.2熒光RT-PCR反應(yīng)程序表2熒光RT-PCR反應(yīng)程序48℃9.3結(jié)果描述及判定9.3.1質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)所有陽性對照(FAM、Cy5和Hex)均有S形擴(kuò)增曲線,陰性對照(FAM、Cy5和Hex)均無9.3.2結(jié)果判斷和鑒別Ct值仍然<40,則判定為核酸檢測陽性,如果Ct45atgagtcttctaaccgaggtcgaaacgtatgttctctctatcgttccgtcaggccccctcaaagccgagatagcgcagagactcgaagatgtgtttgcagggaaaaacaccgatcttgaagcactcatggaatggttaaagacaagaccaatcctgtcacctctgactaaggggattttaggatttgtgttcacgctcaccgtgcccagtgagcgaggactgcagcgtagacgctttgtccagaatgccctaaatgggaatggtgatccgaacaacatggacaaagcggtcaaactgtacagaaaacttaaaagggaaataacattccacggggccaaagaagtagcgctcagttactctgctggtgcacttgccagttgcatgggcctcatatacaacagaatggggactgtcaccgctgaggtggcctttggtctagtatgcgcaacctgtgaacaaattgctgattcccagcatcgatctcatagacaaatggtgacaacaaccaatccactaatcaggcatgagaacagaatggtactagccagcacaacagctaaagccatggaacaaatggctggatcaagtgaacaagcagcagaggctatggaggttgctagccaggctagacaaatggtacaggcaatgagaacaattgggactcaccctagttccagtgctggtctaaaagatgatcttcttgaaaatctacaggcctatcagaaacgaatgggagtgcaaatgcaacgattcaagtgatcctctcattgctgccgcaagcatcattgggattttgcacctgatattgtggattcttgatcgtctttttttcaaatgcatttaccatcactttaaatatggtcgaaaaagagggccttctacggaaggagtgccggagtccatgagggaagaatatcggcagaaacagcagagtgctgtggatgttgacgatggtcattttgtcaacatagtgctagagtaaatgccaaataacaacggcaagcagcaaaagaaaaagaaggggaatggccagccagtcaatcagctgtgccaaatgctgggtaagatcatcgcccaacaaaaccagtccagaggcaagggaccggggaagaaaaataggaagaaaaacccggagaagccccatttccctctagcgactgaagatgacgtcaggcatcactttacccctagtgagcggcaattgtgtctgtcgtcgatccagactgccttcaatcagggcgctggaacttgtgccctgtcagattcagggaggataagttacactgtggagtttagtttgccgacgcaacatactgtgcgtctgatccgcgccacagcatcaccctcagcgtgaatggccggtaaaaaccagagccagaagaaaaagaaaagtacagctccgatggggaatggccagccagtcaatcaactgtgccagttgctgggtgcaatgataaagtcccagcgccagcaacctaggggaggacaggccaa6aaagaaaaagcctgagaagccacattttcccctggctgctgaagatgacatccggcaccacctcacccagactgaacgctccctctgcttgcaatcgatccagacggctttcaatcaaggcgcaggaactgcgtcgctttcatccagtgggaaggtcagttttcaggttgagttcatgctgccggttgctcatacagtgcgcctgattcgcgtgacttctacatccgccagtcagggtgcaagttaa7sN基因N基因M基因Cy5-ACGCTCACCGTGCCS8向裝有310μgCarrierRNA凍干粉的管子中加入310μLRNase-FreeddH2O,將CarrierRNA徹底溶解,得到終濃度為1μg/μL的溶液,并分裝、置于-20℃儲存。根據(jù)樣品數(shù)量計(jì)算所需緩沖液GB和CarrierRNA溶液的體積(計(jì)算公式如下1和2),將緩沖液GB與CarrierRNA溶液顛倒混勻,即得到CarrierRNA工作液;為避免溶液出現(xiàn)起泡現(xiàn)象,請勿使用渦旋公式(1)y=nxm公式(1)中:y為需要加入緩沖液GB的體積(mLn為同時(shí)提取的樣品個(gè)數(shù);公式(2)Z=YXX公式(2)中:z為需要加入CarrierRNA溶液的體積(μLy為需要加入緩沖液GB的體積(mL),2.5加入250μL無水乙醇,渦旋振蕩15sec,徹底混勻,在室溫

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 人人文庫網(wǎng)僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評論

0/150

提交評論