雞紅螨病診斷技術(shù)規(guī)范

1雞紅螨病診斷技術(shù)規(guī)范雞皮刺螨Dermanyssusgallina皮刺螨屬（Dermanyssus）的一種寄生于雞、鴿等多種禽類的體外3.2雞紅螨病Poultryredmit24縮略語(yǔ)ITS：內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（InternalTraBLAST：基礎(chǔ)比對(duì)工具（BasicLocalAlignLoadingBuffer。35.2耗材載玻片。454)用昆蟲針撥動(dòng)，使雞紅螨沉底，擺正姿勢(shì)，頭朝前，腹面向上，各足伸展，再放2)將離心管中戊二醛使用針管抽走，加入PBS浸泡清洗10分20min，用流動(dòng)純水將片子清洗干凈；再用2%檸檬酸鉛染色10分鐘，充分清洗并備用。），6將置于2mL的離心管中的雞紅螨蟲體，利用NDA提取試劑盒在室溫（15℃-25℃)下提取蟲體DNA，提取好的蟲體DNA立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增或者放置于-2應(yīng)按照附錄C1反應(yīng)體系，用引物18SrRNA·ITS·28SrRCoxI-R（見(jiàn)附錄C2）組合配制PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)體系為50μL。雞紅螨陽(yáng)性對(duì)照模板為5.1.18所列雞紅螨DNA2μL，陰性對(duì)照不加陽(yáng)性DNA模板及待檢樣品DNA。反應(yīng)程序見(jiàn)雞紅螨陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)519bp（18SrR），9.3結(jié)果判定（CoxI）擴(kuò)增片段，并且陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增條78A.1電泳緩沖液（TAE）的配制A.1.150×TAE貯存液：Tris-Base24用約800mL滅菌去離子水溶解，充分混勻后用滅菌去離A.21.0%的瓊脂糖凝膠A.35%氫氧化鈉B.1體視顯微鏡下吸血前（飽食前）和吸血后（飽食后）頭指向3個(gè)剛毛。as:肛板；ao：肛孔；dp：背板；gvp：生殖腹板；Pa：須肢；sp：胸板；LI-LIV：足體積(μL）KOD-plusBuffer10×2μM/μL25μM/μL25μM/μL25μM/μL1U/μL200ng/μL-5,-AGTTCAGCGGGTCGTCACACTTG-3,5,-TGATTTTTTGGTCACCCAGAAG-3,注引物來(lái)自本項(xiàng)目組已發(fā)表文獻(xiàn)及相關(guān)已公開劉成倩等，2020，雞皮刺螨病的PCR診斷及18SrRNA·ITS·28SrRNA基因序列C.4.2由于陽(yáng)性對(duì)照樣品中模板濃度相對(duì)較高，在PCR反應(yīng)體系配制過(guò)程中，陽(yáng)性對(duì)照DNA與待檢樣M:DL-2000DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；-：陰性對(duì)照；+M:DL-2000DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)TAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTATTGAATCAAAATCCATTCACTCACTCAGAGAGGATGGTACCTGTATGATGTGCTATCCTGTTGGGAGAGCCATTGCAATGTAATGACATGTATTCTAAATTTGTATCGCGTACTCACTTTACTAAGTTAGTCGCGTGTCGCCTCGGCTGGTTTGACAACAATTTTACCAaTTTGTGCTaTTgagaTTAAAAcAAAAcAAGACTCAATGTGGGGGATCACTTAGTCCTCGATGAAAAACATAGTAATTTGTGGAAAATGATGTGAGTTGTGAAATTTTGTGAGCATTGTGTTTTTGAATGAAAATTTCAGCTGCATGCGTGTCTATGCTGCATTTGTTTCAGTATATATCAATGTCAATTTGTCGTTACTATTGOTTGAAAGCAATAGTATAAACGCGATCACAAGTGTGATATCGATCTTGCGTTATATGACGTGTATCTGAAATCAAGTGTGACGACCCGCTTGATTTTTTGGTCACCCAGAAGTTTATATTTTAATTATTCCAGGATTTGGAATAATTTCCCACATTGTTTGTTATCAAACTGGAGAAACCTTTTGGAAATATTAGAATAATCTATGCAATATTAACAATTGGTATTTTAGGATTTATTGTTTGAGCCCACCATATATTTACAATCGGATTGGATATTGATACTCGGGCTTATTTTACTGCTGCCACGATAATTATTGCAATTCCGACAGGAATTAAGATTTTTTCATGAATTTCAACACTCCACGGAGTTAATATCAATTTTAACCCACCGATTCTTTGATCTTTAGGATTTATTTTTTTATTTACAATTGGTGGAATTACAGGGATTATTTTAGC