GB∕T 30737-2014 海洋微微型光合浮游生物的測定 流式細胞測定法（正式版）

海洋微微型光合浮游生物的測定流式細胞測定法2014-06-09發(fā)布GB/T30737—2014 I 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 4方法原理 25主要儀器設(shè)備 26試劑 27樣品采集與處理 38測定步驟 39結(jié)果分析與計算 4附錄A(規(guī)范性附錄)海洋微微型光合浮游生物測定流式細胞測定法采樣和測定結(jié)果記錄表格式 7參考文獻 I本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標準由國家海洋局提出。本標準由全國海洋標準化技術(shù)委員會(SAC/TC283)歸口。本標準起草單位：國家海洋局南海環(huán)境監(jiān)測中心、廈門大學(xué)、國家海洋局第二海洋研究所、華東師范大學(xué)、中國科學(xué)院南海海洋研究所。1海洋微微型光合浮游生物的測定流式細胞測定法本標準規(guī)定了海洋微微型光合浮游生物中原綠球藻、聚球藻和微微型真核藻類細胞數(shù)量的流式細胞測定法。本標準適用于海洋微微型光合浮游生物中上述3個主要類群細胞數(shù)量的流式細胞測定。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T12763.6—2007海洋調(diào)查規(guī)范第6部分：海洋生物調(diào)查3術(shù)語和定義GB/T12763.6—2007界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。注：改寫GB/T12763.6—2007,定義3.9。微微型浮游生物picoplankton粒徑范圍在0.2μm～2μm的浮游生物。注1:微微型浮游生物不是一個嚴格的生物學(xué)概念，而是一個生態(tài)學(xué)概念。注2:改寫GB/T12763.6—2007,定義3.9。微微型光合浮游生物photosyntheticpicoplankton能進行光合作用的微微型浮游生物。注：微微型光合浮游生物又包括自養(yǎng)和異養(yǎng)兩種類型，以自養(yǎng)型的占絕對優(yōu)勢。自養(yǎng)型的微微型光合浮游生物由三個主要類群組成：原綠球藻、聚球藻和微微型真核藻類。異養(yǎng)型的微微型光合浮游生物主要為不產(chǎn)氧光合細菌(anoxygenicphototrophicbacteria,APB)。藍細菌(Cyanobacteria)中的一屬，為原核生物，粒徑一般為0.6μm左右，其主要特征色素為二乙烯基葉綠素(DiVinyl-Chlorophyll,DVChl)。藍細菌中的一屬，為原核生物，粒徑一般為1μm左右，除了含有葉綠素a(Chlorophylla)外，其主2要特征色素為藻膽蛋白(phycobiliprotein,PBP),cyanin,PC).包括藻紅蛋白(phycoerythrin,PE)和藻藍蛋白(phyco-微微型真核藻類picoeukaryotes;Euk.由多種隸屬于不同門類的真核浮游植物組成，粒徑范圍在0.2μm～2μm,它們的主要色素為葉綠4方法原理本方法是一種在單細胞水平上對微微型光合浮游生物細胞物理化學(xué)和生物化學(xué)性質(zhì)進行快速測定的方法。含有熒光物質(zhì)的微微型光合浮游生物細胞在檢測區(qū)受激光照射后，產(chǎn)生前向散射光、側(cè)向散射光和熒光。前向散射光信號表征細胞的大小和形狀，側(cè)向散射光信號表征細胞質(zhì)的顆粒性，熒光信號表征細胞的熒光物質(zhì)含量。根據(jù)原綠球藻、聚球藻和微微型真核藻類上述信號的不同進行區(qū)分和計數(shù)。5主要儀器設(shè)備主要儀器設(shè)備如下：a)流式細胞儀(配備488nm激光器);b)液氮罐；c)超低溫冰箱(-80℃);d)漩渦振蕩器。6試劑6.1固定劑樣品可采用多聚甲醛溶液(固定終濃度為1%)或戊二醛溶液(固定終濃度為0.1%)進行固定，也可同時加入多聚甲醛溶液和戊二醛溶液進行固定(固定終濃度分別為1%和0.05%)。多聚甲醛溶液和戊二醛溶液獲得方法如下：a)多聚甲醛溶液：市售電子顯微鏡用多聚甲醛溶液或自制10%多聚甲醛溶液。自制10%多聚甲醛溶液配置方法是：在通風(fēng)櫥中稱取10g多聚甲醛粉末放入70mL煮沸的蒸餾水中，連續(xù)攪拌至少2h(可使用恒溫磁力攪拌器);加入少量氫氧化鈉(NaOH)溶液(0.1mol/L)直至溶液澄清；加入10mL10%的磷酸鹽緩沖液(PBS),調(diào)節(jié)到pH7.5;定容至100mL;用孔徑為0.2μm的注射器過濾器過濾。過濾后的多聚甲醛溶液可分裝于15mL的小管中，—20℃保存。未凍結(jié)的多聚甲醛溶液(4℃保存)使用不宜超過1周。b)戊二醛溶液：市售電子顯微鏡用25%或50%戊二醛溶液。注：上述固定終濃度均為體積百分比。鞘液宜使用經(jīng)孔徑0.2μm濾膜過濾的現(xiàn)場海水，也可使用超純水。6.3標準熒光小球(beads)懸浮工作液用超純水稀釋直徑1μm的標準黃綠熒光小球懸浮液至濃度約為10?個/μL的工作液。3GB/T30737—2014注：標準熒光小球在流式細胞測定時能產(chǎn)生固定強度的紅色和橙色熒光，而且小球顆粒大小固定，因此可作為熒光和散射光信號的內(nèi)部參考物質(zhì)。7樣品采集與處理7.1樣品采集按GB/T12763.6—2007中7.1.1、7.1.2的規(guī)定進行。7.2采水量每次采水量宜不少于30mL。7.3樣品固定與保存7.3.1水樣應(yīng)先用孔徑20μm篩絹預(yù)過濾至潤洗2次～3次的清潔小燒杯中。7.3.2可在12h內(nèi)上機分析的樣品，可置于4℃避光保存。7.3.3樣品固定保存方法如下：a)吸取預(yù)過濾水樣至2mL或5mL的凍存管中，加入固定劑(見6.1a)或6.1b)],用漩渦振蕩器(見第5章d)]充分混勻，用鋁箔紙包裹好，避免光照；b)在室溫下放置15min后，置于液氮(見第5章b)]中速凍，然后轉(zhuǎn)移到一80℃超低溫冰箱[見第5章c)]保存或直接存放在液氮(見第5章b)]中直至分析。7.4記錄將采樣情況記錄于表A.1。8測定步驟8.1測定準備8.1.1將鞘液(見6.2)置入流式細胞儀(見第5章a)]中，當使用過濾海水作為鞘液時，宜短接儀器內(nèi)的鞘液過濾器以防止鞘液過濾器受污染。若不短接鞘液過濾器，當鞘液過濾器受污染導(dǎo)致背景噪音增多和流路不穩(wěn)定等情況時，應(yīng)更換鞘液過濾器。8.1.2開機預(yù)熱。8.2測定方法8.2.1流量校準法進行流量校準，方法如下：進樣管中加入過濾海水或超純水，測量樣品重量；卸下進樣針的針管套，待鞘液滴從進樣針中滴下，在下一滴鞘液滴滴下前放上進樣管，還原托架位置，同時開始計時；至少10min后取下進樣管，同時停止計時，記錄測定時長，測定剩余樣品的重量。流量計算用式(1):4式中：T——測定時間，單位為分(min);W;——初始重量，單位為毫克(mg);W.——測定后所剩重量，單位為毫克(mg);d——進樣管內(nèi)液體密度，單位為毫克每微升(mg/μL)。注：過濾海水d=1.03mg/μL,超純水d=1.00mg/μL。冷凍保存樣品置于常溫或37℃水浴中避光解凍備用。標準熒光小球懸浮工作液(見6.3),用漩渦振蕩器[見5d]]混勻。將裝有水樣的進樣管放置于樣品托架上后開始進樣。設(shè)定儀器各散射光和熒光通道的電壓值，在紅色熒光通道設(shè)定閾值，保證目標細胞群出現(xiàn)在分析圖譜中。電壓值的大小應(yīng)視樣品散射光和熒光信號的強弱而定。注：一般各散射光和熒光通道電壓參考值為：前向散射FSC為E01(個別儀器型號需設(shè)定具體電壓值),側(cè)向散射SSC為420V,綠色熒光FL1為630V,橙色熒光FL2為550V,紅色熒光FL3為600V,紅色熒光FL3閾值為50V。所有電壓信號設(shè)定為對數(shù)放大模式(Log檔)。選擇流量檔，流量宜控制在10μL/min～30μL/min范圍內(nèi)，采集顆粒速度50個/s～100個/s為宜。穩(wěn)定至少15s后開始采集數(shù)據(jù)，采集數(shù)量宜大于10000個顆粒。記錄樣品分析時儀器的電壓設(shè)置。流量校準法為仲裁方法。除本方法外，另有內(nèi)標法(見8.2.2)。標定標準熒光小球懸浮工作液(見6.3)的濃度。標定方法可使用熒光顯微鏡直接計數(shù)法。標定前用漩渦振蕩器(見5d)]混勻，防止熒光小球凝聚沉底。有條件者可使用絕對計數(shù)管，絕對計數(shù)管內(nèi)含有已知數(shù)量的標準小球，不需對標準熒光小球懸浮工作液(見6.3)的濃度進行標定。樣品解凍、加樣、進樣、儀器參數(shù)設(shè)定、流量檔選擇和數(shù)據(jù)采集按照～規(guī)定的步驟進行。9結(jié)果分析與計算9.1不同類群細胞的區(qū)分根據(jù)各細胞群光散射信號和熒光信號(橙色熒光和紅色熒光，分別表征藻膽蛋白和葉綠素含量)的差異區(qū)分原綠球藻、聚球藻和微微型真核藻類。(當使用超純水作為鞘液時，會對散射光/熒光信號的絕對值產(chǎn)生一定影響，但對于各細胞類群散射光/熒光信號的相對強弱無顯著影響，不影響細胞類群的區(qū)分與計數(shù)。)前向散射光、側(cè)向散射光和紅色熒光信號強度大小依次為：微微型真核藻類>聚球藻>原綠球藻；橙色熒光信號強度大小依次為：聚球藻>原綠球藻≈微微型真核藻類。流式細胞分析圖譜中細胞類群的區(qū)分見示意圖1。5紅色熒光紅色熒光橙色熒光紅色熒光紅色熒光橙色熒光前向散射光側(cè)向散射光橙色熒光側(cè)向散射光圖1流式細胞分析圖譜中原綠球藻、聚球藻和微微型真核藻類區(qū)分示意圖9.2獲取細胞數(shù)在儀器分析結(jié)果的散點圖上圈出目標細胞群，儀器自帶的分析軟件將自動給出該類群細胞的數(shù)量，做好記錄。9.3細胞密度計算9.3.1使用流量校準法時，樣品中每個類群的細胞密度可用式(2)計算： 式中：C——細胞密度，單位為個每毫升(cells/mL);N——獲取該類群的細胞數(shù)量，單位為個(cells);V,——樣品體積加上添加物(固定劑、標準熒光小球懸浮工作液等)的體積，單位為微升(μL)V、——樣品體積(不含固定劑，標準熒光小球懸浮工作液等添加物體積),單位為微升(μL);R——樣品流量，單位為微升每分(μL/min);T——樣品測定時間，單位為分(min)。9.3.2使用內(nèi)標法時，樣品中每個類群的細胞密度可用式(3)計算：式中：C——細胞密度，單位為個每毫升(cells/mL);Q,——樣品中添加的標準熒光小球數(shù)量，單位為個；N——獲取該類群的細胞數(shù)量，單位為個(cells);6N,——獲取標準熒光小球數(shù)量，單位為個；Vs——樣品體積(不含固定劑，標準熒光小球懸浮工作液等添加物體積),單位為微升(μL)。將測定結(jié)果和計算結(jié)果填于表A.2。7(規(guī)范性附錄)海洋微微型光合浮游生物測定流式細胞測定法采樣和測定結(jié)果記錄表格式表A.1～表A.3給出了海洋微微型光合浮游生物流式細胞測定采樣和測定記錄表格式。表A.1海洋微微型光合浮游生物流式細胞測定海上采樣記錄表序號站位采樣采樣時間水深m水層m樣品編號水樣體積mL固定劑體積mL編號經(jīng)度緯度o!M123456789備注校對者：表A.2海洋微微型光合浮游生物流式細胞測定結(jié)果記錄表(流量校準法)序號站位樣品編號采樣日期水層m散射/熒光通道電壓V激光功率mW流量進樣時間min獲取細胞數(shù)個樣品體積細胞密度前向側(cè)向綠色橙色紅色/閾值Pro.無添加物含添加物Pro.123456789備注注1:前向散射光設(shè)置為E01時，無需在表中填寫具體前向散射電壓值注2:“Pro.”表原綠球藻(Prochlorococcusspp.),“Syn.”表聚球藻(Synechococcusspp.),“Euk.”表微微型真核藻類(picoeukaryotes)表A.3海洋微微型光合浮游生物流式細胞測定結(jié)果記錄表(內(nèi)標法)序號站位樣品編號采樣日期水層m散射/熒光通道電壓V激光功率mW樣品中熒光小球數(shù)103個獲取熒光小球數(shù)個獲取細胞數(shù)個樣品體積細胞密度前向側(cè)向綠色橙色紅色/閾值Pro.Pro.123456789備注注1:前向散射光設(shè)置為E01時，無需在表中填寫具體前向散射電壓值。注2:“P