(高清版)GBT 40251-2021 牡蠣單孢子蟲病診斷規(guī)程 原位雜交法

ICS65.020.30牡蠣單孢子蟲病診斷規(guī)程國家市場監(jiān)督管理總局國家標準化管理委員會IGB/T40251—2021本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提出。本文件由全國水產(chǎn)標準化技術委員會(SAC/TC156)歸口。本文件起草單位：中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所、全國水產(chǎn)技術推廣總站。1牡蠣單孢子蟲病診斷規(guī)程原位雜交法本文件規(guī)定了牡蠣單孢子蟲病診斷規(guī)程中病原定位方法的要求，針對主要病原尼氏單孢子蟲2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文SC/T7205.1—2007牡蠣包納米蟲病診斷規(guī)程第1部分：組織印片的細胞學診斷法3術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義。4縮略語AP:堿性磷酸酶(alkalinephosphatase)DAFA:戴維森氏乙醇-福爾馬林-乙酸固定液(davidson'salcohol-formalin-aceticacidfixative)DIG:地高辛(digoxigenin)EDTA-Na?·2H?O:二水合乙二胺四乙酸二鈉(Ethylenediaminetetraaceticacid,disodiumdi-hydrate)MgCl?·6H?O:六水合氯化鎂(magnesiumchloridehexahydrate)Na?HPO?·12H?O:十二水合磷酸氫二鈉(sodiumphosphatedibasicdodecahydrate)Na?C?H?O?·2H?O:二水合檸檬酸三鈉(sodiumcitratedihydrate)NBT:氯化硝基四氮唑藍(4-Nitrobluetetrazoliumchloride)KH?PO?:磷酸二氫鉀(potassiumphosphatemonobasic)KCl:氯化鉀(potassiumchloride)PBS:磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffersalinebuffer)SSC:枸櫞酸鈉緩沖液(salinesodiumcitratebuffer)Tris:三羥甲基氨基甲烷(Tris[hydroxymethyl]aminomethane)25.3Na?C?H?O?·2H?O。5.5Na?HPO?·12H?O。5.6KH?PO?。5.10EDTA-Na?·2H?O。5.13蛋白酶K。5.14多聚賴氨酸(相對分子質量25000)。5.15聚乙烯醇(相對分子質量30000～70000)。5.17俾斯麥棕Y。5.19聚蔗糖400。5.20聚乙烯吡咯烷酮360。5.24石蠟(熔點52℃~54℃):切片級。5.26丹哈特液(Denhardt's)。5.27鮭精DNA。5.32堿性磷酸酶偶聯(lián)的DIG抗體(AP-抗DIG,0.75U/μL,4℃):生化試劑。5.3695%乙醇。5.37甲醛(37%)。3GB/T40251—20215.4180%乙醇：按A.2配制。5.4270%乙醇：按A.3配制。5.4350%乙醇：按A.4配制。5.452×SSC:按A.7配制。5.470.5×SSC:按A.9配制。5.48PBS:按A.10配制。5.49100pg/mL蛋白酶K:按A.12配制。5.500.4%甲醛：按A.13配制。5.52緩沖液I:按A.16配制。5.53緩沖液Ⅱ:按A.17配制。5.54緩沖液Ⅲ:按A.19配制。5.55緩沖液IV:按A.21配制。5.570.5%俾斯麥棕Y(BismarkbrownY):按A.24配制。6.4普通冰箱。6.5切片保濕孵育箱。6.6展片水浴鍋。6.7烘片機。7樣品采樣數(shù)量、方法和保存運輸應符合SC/T7205.1—2007附錄B的要求。海水溫度高于10℃,且鹽度高于15%時為采樣的最佳時期。7.3樣品的采集套膜。48試驗步驟組織塊依次浸入盛有不同濃度乙醇溶液的燒杯中；流程如下：70%乙醇(1h45min)→80%乙醇脫水后的組織塊依次浸入盛有無水乙醇：二甲苯(1:1)混合液和二甲苯溶液的燒杯中，流程如下：無水乙醇：二甲苯(1:1)(25min)→二甲苯(20min)→二甲苯(20min)。用蠟鏟或刀片將包埋塊四周修平，使上下兩面修成平行面，保留組織周圍(每次3min)。8.2.2切片平放在切片保濕孵育箱中，吸取500μL100pg/mL蛋白酶K溶液，加到每張組織切片上，8.2.3把組織切片上的蛋白酶K溶液吸凈，然后將其浸入預冷到4℃的0.4%甲醛溶液中5min。8.2.5把組織切片平放在切片保濕孵育箱中，添加500μL雜交緩沖液至每張組織切片，42℃孵育8.2.6添加500μL含2ng/μLDIG標記的寡聚核苷酸探針雜交混合液至每張組織切片，置于90℃~95℃平板烘片機上保溫10min。8.2.7將組織切片置于平整的冰面上淬冷1min。5GB/T40251—20218.2.8在切片保濕孵育箱內(nèi)42℃下孵育16h～18h。8.2.9依次用緩沖液2×SSC(5min,室溫)、2×SSC(5min,室溫)、1×SSC(5min,室溫)、1×SSC緩沖液I(1min～2min,室溫)。8.2.10加500μL緩沖液Ⅱ封閉組織切片，37℃溫浴30min。8.2.11用緩沖液Ⅱ將AP-抗DIG稀釋至0.75U/μL(1pL0.75U/μLAP-抗DIG加到1mL緩沖液Ⅱ8.2.13吸500μL顯色液于每張組織切片上，在暗處于室溫放置1h～3h,隨時觀察顯色情況，當陽性對照有明顯顯色或陰性對照開始普遍出現(xiàn)非特異性顯色，立即終止顯色。8.2.14把組織切片置于緩沖液IV中15min終止反應。8.2.16空氣自然干燥后，滴加2滴中性樹膠，封片。8.2.17顯微鏡下(400倍),尋找著色明顯的藍黑色雜交信號，并拍照。9結果判定9.1檢測結果成立條件陽性對照樣品組織病灶部位觀察到明顯的藍黑色雜交信號，陰性對照樣品組織中未觀察到任何的9.2檢測結果判定檢測樣品組織中觀察到藍黑色雜交信號(參見附錄B),則原位雜交檢測結果為陽性，判定為尼氏單孢子蟲感染；待測樣品組織中未觀察到藍黑色雜交信號，則原位雜交檢測結果為陰性。牡蠣單孢子蟲病及其主要病原簡介參見附錄C。6GB/T40251—202195%乙醇甲醛(37%)冰醋酸過濾海水95%乙醇加水定容至95%乙醇加水定容至95%乙醇加水定容至A.5500μg/mL多聚賴氨酸多聚賴氨酸(相對分子質量25000)加水定容至A.620×SSCNaClNa?C?H?O?·2H?O加水溶解定容至調節(jié)pH至A.72×SSC20×SSC水(規(guī)范性)試劑配方330mL220mL335mL950mL700mL950mL500mL950mL900mL720×SSCA.90.5×SSC20×SSCA.10PBSNa?HPO?·12H?O2.9gKH?PO?蛋白酶KA.12100μg/mL蛋白酶K10mg/mL蛋白酶K0.25mLPBS甲醛(37%)5.4mLA.14雜交緩沖液10mg/mL鮭精DNA2.5mL25%硫酸葡聚糖10mL8GB/T40251—2021加水定容至1000mL高壓蒸氣滅菌，4℃貯存。A.16緩沖液I10×緩沖液I100mLA.17緩沖液ⅡTritonX-1000.3g山羊血清2mL緩沖液I100mL在60℃~80℃水浴中溶解，不斷晃動，直至顆粒溶解。4℃可貯存2周。A.1810×緩沖液ⅢNaCl58.4g加水溶解至800mL用濃HCl調節(jié)pH至9.5MgCl?·6H?O101.6g加水定容至1000mLA.19緩沖液Ⅲ10×緩沖液Ⅲ100mL水混勻，0.45μm濾膜過濾除菌，4℃貯存，出現(xiàn)沉淀后丟棄。A.2010×緩沖液NEDTA-Na?·2H?O3.7g用HCl調pH至8.0,高壓滅菌。4℃貯存。A.21緩沖液IV10×緩沖液IV100mL水900mLA.2210%聚乙烯醇聚乙烯醇(相對分子質量30000～70000)10g加水溶解至100mL9A.23顯色液緩沖液Ⅲ鹽酸左旋咪唑10%聚乙烯醇4℃保存用前在每1mL上述混合液中加入：NBTA.240.5%俾斯麥棕Y俾斯麥棕Y水把染料溶于水中，過濾。室溫貯存。A.25NBT貯存液NBT二甲基甲酰胺水A.26BCIP貯存液BCIP二甲基甲酰胺A.2720×丹哈特液牛血清白蛋白聚蔗糖400聚乙烯吡咯烷酮360加水溶解并定容至90mL500mL0.9310.402mLmL2mLgggmLA.2825%硫酸葡聚糖硫酸葡聚糖加水定容至將鮭精DNA鈉鹽加入水中，用玻璃棒攪拌直至完全溶解。用6號針頭的注射器反復抽打數(shù)次。在100℃水浴中加熱10min,立即放于冰浴中淬冷，分裝于無菌小試管中，-20℃保存。使用