酶的分離和提純等

關(guān)于酶的分離和提純等上兩次課的內(nèi)容

第一節(jié)酶是生物催化劑第二節(jié)酶的結(jié)構(gòu)與功能第三節(jié)酶的作用機制第四節(jié)酶促反應(yīng)動力學(xué)本次課的內(nèi)容第五節(jié)酶的分離、提純和活性測定第六節(jié)重要的酶類第七節(jié)酶在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用第五章酶第2頁,共34頁，星期六，2024年，5月第五節(jié)酶的分離、提純和活性測定Section5theseparation,purificationandmeasurationofactivityofenzyme第3頁,共34頁，星期六，2024年，5月

一、酶的分離提純

目的：研究酶的理化性質(zhì)。包括結(jié)構(gòu)與功能、生物學(xué)作用。作為生化試劑及用作藥物的酶要求純度高第4頁,共34頁，星期六，2024年，5月根據(jù)酶在體內(nèi)作用部位胞外酶---易分離胞內(nèi)酶---須破碎cell分離提純的原則選擇酶含量豐富的材料目前多采用微生物發(fā)酵的方法來獲取大量的酶制劑避免蛋白質(zhì)變性：避免強酸、強堿，低溫每一步驟，都要測定酶的總活力和比活力第5頁,共34頁，星期六，2024年，5月a.選材動物、植物、微生物：含酶量高，易分離的酶分離提純的步驟選材-破碎細胞-抽提-純化-保存第6頁,共34頁，星期六，2024年，5月b．破碎細胞

動物細菌植物

研磨超聲波纖維素酶

勻漿溶菌酶

搗碎機化學(xué)溶劑(甲苯)

提取液c．抽提抽提條件的選取應(yīng)根據(jù)酶的溶解度和穩(wěn)定性等。

（用稀鹽、稀酸、稀堿溶液抽提）鹽：一般用等滲鹽溶液，如0.05mol/L的PBS，

0.15mol/L的NaCl等；T：一般在0～4℃；pH在其穩(wěn)定范圍內(nèi)且遠離其等電點。第7頁,共34頁，星期六，2024年，5月

操作要求：

A.盡量減少酶活性的損失

B.低溫0～

5℃攝氏度

有機溶劑：-15～-20℃攝氏度

C.抽提液加入EDTA（絡(luò)合金屬）

D.抽提液加入巰基乙醇（防止-SH氧化失活）

E.不能過度攪拌，以免產(chǎn)生大量泡沫，使酶變性

F.測定酶的比活力第8頁,共34頁，星期六，2024年，5月d.純化

小分子能自然去除,大分子中核酸用魚精蛋白或MnCl2沉淀去除,粘多糖用醋酸鉛去除。而主要工作則是去除雜蛋白。純化方法與蛋白質(zhì)基本相同,此外常用選擇性變性法如選擇性熱變性法(某些酶耐熱).第9頁,共34頁，星期六，2024年，5月純化方法選擇性變性法鹽析法有機溶劑沉淀法等電點沉淀方法吸附分離方法幾種方法配合使用第10頁,共34頁，星期六，2024年，5月

提純的目的:含量+純度工藝的選擇應(yīng)權(quán)衡含量與純度,根據(jù)酶的應(yīng)用目的和經(jīng)濟效益取得一個平衡點.每一步都要測定酶的純度(比活力)并計算純化倍數(shù)和產(chǎn)率以決定該步驟的效益和取舍.酶的比活力(純度)=活力單位數(shù)/毫克蛋白純化倍數(shù)=每次比活力/第一次比活力產(chǎn)率=(每次總活力/第一次總活力)×100%第11頁,共34頁，星期六，2024年，5月e．保存

將酶制品濃縮，結(jié)晶，以便保存（-20℃）

注意：酶易失活，不可烘干。

可用的方法：

（1）保存濃縮的酶液：（2）濃縮液加入等體積甘油-20℃長期保存第12頁,共34頁，星期六，2024年，5月二、酶的活力測定(定量)

酶的活力:又稱為酶活性，一般把酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力稱為酶活力，酶的活力大小可用在一定條件下它所催化的某一化學(xué)反應(yīng)的速度來表示,即可用單位時間內(nèi)、單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物的生成量來表示.

一般采用高底物濃度[S]≥100Km(零級反應(yīng))測定初速度來定量酶濃度.第13頁,共34頁，星期六，2024年，5月

酶活力單位:最適條件下,單位時間內(nèi),酶催化底物的減少量或產(chǎn)物的生成量.1個U（1U）:特定條件下,1分鐘內(nèi)生成1微摩爾產(chǎn)物的酶量(或轉(zhuǎn)化1微摩爾底物的酶量).Kat:最適條件下,每秒鐘可使1摩爾底物轉(zhuǎn)化的酶量.即1Kat=6×107IU

習(xí)慣單位表示酶活力第14頁,共34頁，星期六，2024年，5月酶的轉(zhuǎn)換數(shù)（turnovernumber）單位時間，每個催化中心所轉(zhuǎn)換的底物分子數(shù)。通常指每秒鐘每個酶分子轉(zhuǎn)換底物的微摩爾數(shù)，在數(shù)值上，Kcat＝K3第15頁,共34頁，星期六，2024年，5月第六節(jié)重要的酶類一、寡聚酶(oligomericenzyme)含有2個以上的亞基，分子量大（35000以上）?？煞譃楹嗤瑏喕墓丫勖负秃煌瑏喕墓丫勖?。寡聚酶普遍存在，單體酶的數(shù)量則較少。（含不同亞基的）寡聚酶的不同亞基執(zhí)行不同的功能。催化功能和底物載體的功能。寡聚酶是代謝調(diào)節(jié)的方式之一。第16頁,共34頁，星期六，2024年，5月二、同工酶(isoenzyme)

概念：存在于同一種屬或不同種屬，同一個體的不同組織或同一組織、同一細胞（位置），具有不同分子形式（結(jié)構(gòu)）、理化性質(zhì)和免疫學(xué)性質(zhì)，但卻能催化相同的化學(xué)反應(yīng)（功能）的一組酶，稱之為同工酶（isoenzyme）。乳酸脫氫酶是研究的最多的同工酶。第17頁,共34頁，星期六，2024年，5月乳酸脫氫酶同工酶形成示意圖多肽亞基mRNA四聚體結(jié)構(gòu)基因a

b乳酸脫氫酶同工酶電泳圖譜+–H4MH3M2H2M3HM4點樣線第18頁,共34頁，星期六，2024年，5月不同組織中LDH同工酶的電泳圖譜LDH1(H4)LDH2(H3M)LDH3(H2M2)LDH4(HM3)LDH5(M4)心肌腎肝骨骼肌血清-+原點第19頁,共34頁，星期六，2024年，5月同工酶在各學(xué)科中的應(yīng)用醫(yī)學(xué)和臨床診斷：體內(nèi)同工酶的變化，可看作機體組織損傷，或遺傳缺陷，或腫瘤分化的的分子標志。

適應(yīng)不同組織或不同細胞器在代謝上的不同需要第20頁,共34頁，星期六，2024年，5月

心肌梗死和肝病病人血清LDH同工酶譜的變化1酶活性心肌梗死酶譜正常酶譜肝病酶譜2345第21頁,共34頁，星期六，2024年，5月

關(guān)于同工酶的敘述，哪一個是正確的

A.是能催化同一反應(yīng)，但分子組成，理化性質(zhì)以及免疫學(xué)特征都不相同的一組酶

B.由同一基因編碼，生成相同的mRNA，然后把翻譯的蛋白質(zhì)經(jīng)加工而形成的不同分子形式的酶

C.催化同一反應(yīng)，理化性質(zhì)相同，只是分布不同的酶

D.催化同一反應(yīng)，分子組成不同，理化性質(zhì)相同，免疫學(xué)特征不相同的一組酶

E.催化同一反應(yīng)，分子組成和理化性質(zhì)不同，但免疫學(xué)特征相同的一組酶第22頁,共34頁，星期六，2024年，5月三、誘導(dǎo)酶（inducedenzyme）含量在誘導(dǎo)物存在下顯著增高。誘導(dǎo)物是該酶的底物類似物或底物本身。半乳糖苷酶（無葡萄糖時利用乳糖）因為長期服用某種藥物而產(chǎn)生抗藥性第23頁,共34頁，星期六，2024年，5月四、調(diào)節(jié)酶

一般催化代謝反應(yīng)鏈中的單向反應(yīng)或速度最慢的步驟,因而可調(diào)節(jié)、控制反應(yīng)鏈的總的方向和總速度.

調(diào)節(jié)酶一般位于代謝反應(yīng)鏈的開端或分枝點上。第24頁,共34頁，星期六，2024年，5月（一）共價調(diào)節(jié)酶調(diào)節(jié)劑通過共價鍵與酶分子結(jié)合,以增減酶分子上的基團來改變酶的活性(高/低,有/無).

常見類型磷酸化與脫磷酸化（最常見）乙?；兔撘阴；谆兔摷谆佘栈兔撓佘栈璖H與－S－S互變第25頁,共34頁，星期六，2024年，5月

酶的磷酸化與脫磷酸化-OHThrSerTyr酶蛋白H2OPi磷蛋白磷酸酶ATPADP蛋白激酶ThrSerTyr-O-PO32-酶蛋白第26頁,共34頁，星期六，2024年，5月（二）變構(gòu)酶(別構(gòu)酶,屬寡聚酶)

（結(jié)構(gòu)）除活性中心外,還有別構(gòu)中心(結(jié)合調(diào)節(jié)物或稱效應(yīng)劑)

別構(gòu)效應(yīng):調(diào)節(jié)物與別構(gòu)中心結(jié)合引起酶蛋白構(gòu)象變化,使酶活性中心對底物的結(jié)合和催化作用受影響(改變酶活性),從而改變酶促反應(yīng)速度.

別構(gòu)激活/別構(gòu)抑制別構(gòu)效應(yīng)劑:

別構(gòu)激活劑:通常為底物或底物類似物別構(gòu)抑制劑:通常為產(chǎn)物第27頁,共34頁，星期六，2024年，5月同種效應(yīng)：一分子的配體結(jié)合在蛋白質(zhì)一個部位影響另一分子同樣配體在另一部位的結(jié)合。異種效應(yīng)是一分子的配體在一個部位的結(jié)合會影響另一分子的不同配體在另一部位的結(jié)合。第28頁,共34頁，星期六，2024年，5月*協(xié)同效應(yīng)(cooperativity)

一個寡聚蛋白質(zhì)的一個亞基與其配體結(jié)合后，能影響此寡聚體中另一個亞基與配體結(jié)合能力的現(xiàn)象，稱為協(xié)同效應(yīng)。如果是促進作用則稱為正協(xié)同效應(yīng)

(positivecooperativity)如果是抑制作用則稱為負協(xié)同效應(yīng)

(negativecooperativity)第29頁,共34頁，星期六，2024年，5月變構(gòu)酶的初速度—底物濃度的關(guān)系不符合典型的米氏公式。對于變構(gòu)酶來說，酶反應(yīng)速度對底物濃度的變化極為敏感。當?shù)孜餄舛劝l(fā)生較小變化時，變構(gòu)酶可以極大程度地控制著反應(yīng)速度。變構(gòu)酶可以靈敏地調(diào)節(jié)酶反應(yīng)速度。第30頁,共34頁，星期六，2024年，5月（一）血清酶測定應(yīng)用于肝膽疾病的診斷轉(zhuǎn)氨酶血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(SGOT)卵磷脂-膽固醇轉(zhuǎn)?；?LCAT)Υ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(Υ-GT)（二）血清酶測定應(yīng)用于急性心肌梗死的診斷肌酸激酶(CK-MB高6倍)乳酸脫氫酶LDH-H1/H2高（三）血清酶測定應(yīng)用于診斷腫瘤Υ-GTGal-T第七節(jié)酶在醫(yī)藥學(xué)上的應(yīng)用一、酶在疾病診斷上的應(yīng)用第31頁,共34頁，星期六，2024年，5月1.助消化酶2.消炎酶3.防治冠心病用酶4.止血酶和抗血栓酶5.抗腫瘤酶類6.其他酶類藥物二、酶在治療上的應(yīng)用第32頁,共34頁，星期六，20