DB14T 3007-2024化妝品用原料 重組人源化膠原蛋白的鑒定

ICS11.120.20CCSC30IdentificationprocessofrecombinanthumanizedcollagenIDB143007—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由山西錦波生物醫(yī)藥股份有限公司提出。本文件由山西省化妝品標準化技術委員會歸口。本文件起草單位：山西錦波生物醫(yī)藥股份有限公司，山西省檢驗檢測中心（山西省標準計量技術研究院）。本文件主要起草人：王建、于玉鳳、盧彥宏、孫丹丹、何振瑞、李喜梅、張朝敏、張永健、劉欣。1DB143007—2024化妝品用原料重組人源化膠原蛋白的鑒定本文件適用于化妝品用原料重組人源化膠原蛋白的鑒定。本文件規(guī)定了化妝品用原料重組人源化膠原蛋白的鑒定項目、材料和設備、鑒定方法、結果判定2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。YY/T1888-2023重組人源化膠原蛋白中華人民共和國藥典（2020年版）3術語和定義YY/T1888-2023界定的以及下列術語和定義適用于本文件。3.1肽段覆蓋率（氨基酸序列覆蓋度）Peptidecoverage肽段覆蓋率（氨基酸序列覆蓋度）是指檢測到的肽段的氨基酸數(shù)量占該蛋白質(zhì)總氨基酸數(shù)量的比例。蛋白質(zhì)經(jīng)過酶切后，采用LC-MS進行檢測，鑒定到的酶切后肽段占理論序列氨基酸數(shù)量的比例。3.2末端氨基酸序列Terminalaminoacidsequence末端氨基酸序列是指蛋白質(zhì)序列中N端和C端的一段序列。4原理選用適宜的蛋白酶對重組人源化膠原蛋白進行酶解，酶解后的肽段采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測肽段覆蓋率和氨基酸序列。依據(jù)樣品氨基酸序列與人膠原蛋白某亞型序列匹配度判斷是否為重組人源化膠原蛋白。5材料和設備5.1試劑和材料a)水：GB/T6682，一級；b)碳酸氫銨：純度≥99.5%；2DB143007—2024c)鹽酸胍：純度≥99%；d)二硫蘇糖醇（DTT）：純度≥99%；e)碘乙酰胺（IAM）:純度≥99%；f)甲酸：質(zhì)譜級；g)乙腈：質(zhì)譜級；h)超濾管；i)胰蛋白酶（Trypsin）：測序級。注：根據(jù)不同蛋白序列選擇適合的酶進行酶切，可采用多種酶切綜合鑒定，常用的蛋白內(nèi)切酶還有賴氨酸蛋白酶（Lys-C）、谷氨酰蛋白內(nèi)切酶（Gl5.2試劑配制5.2.1碳酸氫銨溶液（50mmol/L）：準確稱取0.395g碳酸氫銨定容于100mL水中，混勻。5.2.2鹽酸胍溶液（6mol/L準確稱取28.66g鹽酸胍定容于50mL的碳酸氫銨溶液（5.2.1）中，混勻（現(xiàn)用現(xiàn)配）。5.2.3DDT溶液（1mol/L）：準確稱取0.154g二硫蘇糖醇溶于鹽酸胍溶液（5.2.2）中，混勻（現(xiàn)用現(xiàn)配）。5.2.4IAM溶液（1mol/L準確稱取0.185gIAM溶于1mL鹽酸胍溶液（5.2.2）中，混勻后避光放置（現(xiàn)用現(xiàn)配）。5.2.5Trypsin溶液（0.2μg/μL）：準確稱取20μgTrypsin，溶于100μL水中，混勻。5.2.60.1%甲酸水溶液：取1mL甲酸加水定容至1000mL,混勻。5.2.70.1%甲酸乙腈溶液：取500μL甲酸定容于500mL乙腈中，混勻。5.3儀器設備5.3.1高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜儀:配有電噴霧離子源（ESI）。5.3.2高速冷凍離心機：轉(zhuǎn)速不低于12000r/min。5.3.3分析天平：感量0.0001g。5.3.4水浴鍋：溫度均勻度±0.3℃。5.3.5渦旋振蕩器。6鑒定方法6.1樣品處理1)取100μL重組人源化膠原蛋白溶液(1μg/μL)置于超濾管接收管中，12000r/min離心15min；2)變性：加入100μL鹽酸胍溶液（5.2.23)還原：加入2μLDTT溶液（5.2.3渦旋震蕩使蛋白均勻分布于溶液中，42℃孵育1h；4)烷基化處理：超濾管接收管中加入5μLIAM溶液（5.2.4渦旋震蕩使蛋白均勻分布于溶液中，避光室溫放置30min，14000g離心15min；5)置換溶液：接收管中加入100μL碳酸氫銨溶液（5.2.112000r/min離心15min，重復兩次；6)酶切：將接收管取出置于新的超濾管中，再加入碳酸氫銨溶液（5.2.1）100μL，0.2Trypsin溶液（5.2.5）15μL，旋渦震蕩，使蛋白溶液均勻分布；7)封口膜封好放置于37℃孵育18小時；8)將超濾管倒置離心，收集溶液。3DB143007—20246.2儀器條件6.2.1高效液相色譜參考條件a)色譜柱：C18，150*2.1mm（內(nèi)徑），粒度1.6μm，或相當者；b)流動相A：0.1%甲酸水溶液（5.2.6）；c)流動相B：0.1%甲酸乙腈溶液（5.2.7）；d)流速：0.2mL/min；e)柱溫：40℃;f)進樣體積：4μL；g)流動相梯度洗脫程序見表1。表1色譜分離梯度021255226.2.2質(zhì)譜參考條件a)離子源：ESI；b)檢測方式：正離子模式；c)MS掃描范圍200-2000m/z；d)MS/MS掃描范圍50-2500m/z。6.3數(shù)據(jù)分析產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)及圖譜由數(shù)據(jù)分析軟件識別標峰并導出對應圖譜，通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)和相關質(zhì)譜鑒定圖譜進行數(shù)據(jù)庫匹配，得出肽段覆蓋率及末端氨基酸序列鑒定結果（具體示例見附錄A中A.1及A.2）。7結果判定樣品檢測出的氨基酸序列需與理論氨基酸序列一致，肽段覆蓋率需達到100%。將氨基酸序列檢測結果和人膠原蛋白某亞型序列進行比對，判斷樣品是否為重組人源化膠原蛋白(具體比對示例見附錄A中A.3）。將樣品檢測出的氨基酸序列與人膠原蛋白某亞型序列進行比對，匹配度100%，為“A型重組人源化膠原蛋白”；匹配度大于等于80%，小于100%，為“B型重組人源化膠原蛋白”；匹配度小于80%，則該樣品不屬于重組人源化膠原蛋白。0DB143007—2024一種重組人源化膠原蛋白質(zhì)譜鑒定結果A.1肽段覆蓋率鑒定結果示例。圖A.1重組人源化膠原蛋白Trypsin酶解產(chǎn)物總離子流（TIC）圖表A.1重組人源化膠原蛋白Trypsin酶解肽段信息1DB143007—2024圖A.2重組人源化膠原蛋白Lys-C酶解肽段覆蓋率A.2末端序列鑒定結果示例。圖A.3重組人源化膠原蛋白Lys-C酶解產(chǎn)物C末端肽段序列2DB143007—2024圖A.4重組人源化膠原蛋白Lys-C酶解產(chǎn)物C末端肽段二級譜圖圖A.5重組人源化膠原蛋白Lys-C酶解產(chǎn)物N末端肽段序列3DB143007—2024圖A.6重組人源化膠原蛋白Lys-C酶解產(chǎn)物N末端肽段二級譜圖A.3氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫比對檢測得到氨基酸序列為（GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP）16，檢索NCBI數(shù)據(jù)庫（https:///Blast.cgi），點擊“ProteinBLAST”，進入blastpsui