多糖結(jié)構(gòu)構(gòu)象及生物活性概述

天然產(chǎn)物活性多糖的結(jié)構(gòu)與構(gòu)象及生物活性的研究組員：李冰，劉晨，史蕊，薛冰，朱傳勝1

多糖的結(jié)構(gòu)的概述1·1結(jié)構(gòu)層次

多糖的結(jié)構(gòu)分類沿用了蛋白質(zhì)和核酸的分析方法。單糖是糖類的組成單元,單糖之間脫水形成糖苷鍵,并以糖苷鍵線性或分支連接成寡糖和多糖。一般將少于20個糖基的糖鏈稱為寡糖,多于20個糖基的糖鏈稱為多糖。寡糖和多糖的結(jié)構(gòu)也可分為一級、二級、三級、四級結(jié)構(gòu)。1·1·1一級結(jié)構(gòu)

多糖的一級結(jié)構(gòu)是指糖基的組成、糖基排列順序、相鄰糖基的連接方式、異頭碳構(gòu)型以及糖鏈有無分支、分支的位置與長短等。糖的一級結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜,再加上糖殘基上可以連接硫酸基團、乙酯基團、磷酸基團、甲基化基團,這就更加劇了糖一級結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性。多糖的一級結(jié)構(gòu)同多糖雜多糖直鏈淀粉的一級結(jié)構(gòu)支鏈淀粉的一級結(jié)構(gòu)1·1·2二級結(jié)構(gòu)

多糖的二級結(jié)構(gòu)指多糖骨架鏈間以氫鍵結(jié)合所形成的各種聚合體,只關(guān)系到多糖分子中主鏈的構(gòu)象,不涉及側(cè)鏈的空間排布。在多糖鏈中,糖環(huán)的幾何形狀幾乎是硬性的,各個單糖殘基繞糖苷鍵旋轉(zhuǎn)而相對定位,可決定多糖的整體構(gòu)象。通常糖苷鍵有兩個可旋轉(zhuǎn)的主鏈二面角:φ(H1-C1-O1-C糖配基),ψ(C1-O1-C糖配基-H糖配基),兩個單糖若為1→6連接,則還有第三個可旋轉(zhuǎn)的二面角ω(O6-C6-C5-O5),解決寡糖構(gòu)象的關(guān)鍵在于確定φ、ψ、ω的取值。但是,它們的取值受相鄰糖環(huán)之間的空間阻礙和相鄰糖殘基間的非共價鍵相互作用的嚴(yán)格限制。因此,多糖的二級結(jié)構(gòu)形式主要依賴一級結(jié)構(gòu)的排步。直鏈淀粉的二級結(jié)構(gòu)1·1·3三級和四級結(jié)構(gòu) 多糖鏈一級結(jié)構(gòu)的重復(fù)順序,由于糖單位的羥基、羧基、氨基以及硫酸基之間的非共價相互作用,導(dǎo)致有序的二級結(jié)構(gòu)空間有規(guī)則而粗大的構(gòu)象,即是多糖鏈的三級結(jié)構(gòu)。多糖的四級結(jié)構(gòu)是指多聚鏈間非共價鍵結(jié)合形成的聚集體。

2多糖結(jié)構(gòu)的研究趨勢

近20年來,許多糖類物質(zhì)不斷進入臨床研究,主要集中在抗感染、抗腫瘤、抗風(fēng)濕、抗消化道潰瘍和增進免疫功能等方面實驗與應(yīng)用。但由于多糖本身的結(jié)構(gòu)復(fù)雜,很多特殊的生物活性都與其復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)關(guān)系密切,因此對多糖結(jié)構(gòu)的研究是開發(fā)新一代糖類藥物的關(guān)鍵。目前,國內(nèi)外對多糖結(jié)構(gòu)的研究主要有兩個趨勢:

一是在多糖常規(guī)結(jié)構(gòu)分析方法基礎(chǔ)上,引入免疫生物化學(xué)、PCR等現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù),進行多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)與活性的系統(tǒng)研究;

二是借助最新的儀器與計算機模擬技術(shù),研究和模擬多糖在溶液中的構(gòu)象變化,以研究糖類物質(zhì)在參與生命活動、產(chǎn)生生物效應(yīng)時的精細(xì)結(jié)構(gòu)。3多糖結(jié)構(gòu)的分析方法

與其它生物大分子一樣，糖鏈的二級以上高級結(jié)構(gòu)是以一級結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的。不同的是，與蛋白質(zhì)或核酸大分子相比，糖鏈的一級結(jié)構(gòu)“含義”要豐富得多。測定糖鏈的一級結(jié)構(gòu)，要解決以下幾個問題：（1）相對分子質(zhì)量；

（2）糖鏈的糖基組成，各種單糖組成的摩爾比；

（3）有無糖醛酸及具體的糖醛酸類型和比例；

（4）各單糖殘基的D-或L-構(gòu)型，吡喃環(huán)或呋喃環(huán)形式；

（5）各個單糖殘基之間的連接順序；（6）每個糖苷鍵所取的α-或β-異頭異構(gòu)形式；

（7）每個糖殘基上羥基被取代情況；

（8）糖鏈和非糖部分連接情況；

（9）主鏈和支鏈連接位點；

（10）糖殘基可能連接硫酸酯基、乙?；?、磷酸基、甲基的類型等。

多糖結(jié)構(gòu)的分析手段很多，不僅有儀器分析法，如紅外、核磁共振、質(zhì)譜等，還有化學(xué)方法，如部分酸水解、完全酸水解、高碘酸氧化、Smith降解、甲基化反應(yīng)等，以及生物學(xué)方法，如特異性糖苷酶酶切、免疫學(xué)方法等（見表1）

表1多糖的結(jié)構(gòu)分析方法

多糖的相對分子質(zhì)量可以用量均相對分子質(zhì)量（Mw）、數(shù)均相對分子質(zhì)量（Mn）、重均相對分子質(zhì)量（Mw）和粘均相對分子質(zhì)量（Mv）表示。

目前測定多糖相對分子質(zhì)量的方法主要有滲透壓法、蒸汽壓法、端基法、光散射法、黏度法、超過濾法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法、凝膠過濾法和HPGPC（高效凝膠滲透色譜法）等。HPGPC測定多糖相對分子質(zhì)量具有快速、高分辨率和重現(xiàn)性好等優(yōu)點，在國內(nèi)外得到廣泛使用。3·1相對分子質(zhì)量的測定3·2化學(xué)降解分析方法3·2·1單糖組成測定

多糖水解后生成的單糖混合物或單糖甲基糖苷混合物可以用TLC（薄層色譜法）、HPLC（高效液相色譜法）或GC（氣相色譜法）等方法作定性鑒定和定量分析。GC分析時，待測樣品要轉(zhuǎn)換成易揮發(fā)、熱穩(wěn)定性好的衍生物，如糖三甲基硅醚、糖醇乙酸酯、糖三氟乙酸酯等。樣品的水解方法有甲醇水解、鹽酸水解、硫酸水解和三氟乙酸水解等，其中三氟乙酸水解法最為常用。3·2·2部分酸水解

通過部分酸水解的方法將多糖水解成易于分析的小片段。一般來說，吡喃型糖基比呋喃型糖基穩(wěn)定，己糖比戊糖穩(wěn)定，1-6糖苷鍵對酸水解相對穩(wěn)定，主鏈的糖基比支鏈的糖基穩(wěn)定。因此，通過部分酸水解可以判斷糖苷鍵的斷裂次序，推斷可能的糖苷鍵類型。多糖可在溫和條件下水解或者在劇烈條件（高溫、較高濃度酸）下水解。在完全水解前，終止水解，可得到不同的寡糖片段和可能的多糖主鏈，然后綜合采用單糖測定、甲基化分析和核磁共振等方法可深入解析多糖結(jié)構(gòu)。3·2·3高碘酸氧化

高碘酸及其鹽可以選擇性地斷裂糖分子中的連二羥基或連三羥基，生成相應(yīng)的多糖醛、甲醛或甲酸。糖的非還原末端或非末端的（1→6）-鍵與鄰三元醇相似，其與過碘酸鹽作用，糖環(huán)開裂得一分子比例的甲酸而消耗二分子比例的過碘酸鹽。非末端的（1→2）-或（1→4）-鍵與鄰二元醇相似，其開裂后產(chǎn)生二分子醛而消耗一分子比例之過碘酸鹽。對于非末端的（1→3）-鍵或C-2和C-4有分枝的，則不受過碘酸鹽影響。因此多糖氧化后定量測定過碘酸鹽的消耗、甲酸的生成和剩余糖的比例，就可確定多糖中各種單糖的鍵型及其比例。多糖的過碘酸鹽氧化一般在pH3~5的水溶液中進行（暗處）。過低pH導(dǎo)致酸水解，過高pH引起無選擇性氧化。確定糖苷鍵的位置時，需要與Smith降解相結(jié)合。3·2·4Smith降解

Smith降解是將高碘酸氧化的產(chǎn)物還原后進行酸水解。由于糖基之間不同的位置縮合，因此用高碘酸氧化后生成不同的產(chǎn)物。將氧化產(chǎn)物用硼氫化鈉還原成穩(wěn)定的多羥基化合物，水解后用紙層析或者GLC（氣液分配色譜法）鑒定水解產(chǎn)物，由降解的產(chǎn)物推斷糖苷鍵的位置。由于實驗中加入乙二醇終止反應(yīng)，所以檢測終產(chǎn)物中乙二醇沒有意義，一般以甘油、赤蘚醇和其它糖等作為糖苷鍵的特征終產(chǎn)物。3·2·5甲基化分析

甲基化分析是確定寡糖和多糖中單糖間糖苷鍵位置的重要手段。其原理是：先將多糖中各種單糖殘基中的游離羥基全部甲基化，將甲基化多糖水解得到甲基化的單糖進行衍生處理，最后用GC-MS（氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法）方法結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)譜圖分析，可得到部分甲基化單糖衍生物的歸屬，從而確定單糖殘基的連接位點。同時根據(jù)不同甲基化單糖的比例推出這種連接鍵型在多糖重復(fù)結(jié)構(gòu)中的比例。然而甲基化分析無法確定異頭碳糖苷鍵構(gòu)型和單糖殘基的順序信息。

多糖甲基化通過一系列的改進，目前有多種方法，如Purdie法、Haworth法、Menzies法、Hakomori法、Cicanu法、Needs法等，其中Needs改良的甲基化方法較為常用。針對易溶于水、難溶于DMSO（二甲基亞砜）的多糖，可以先用少量水使多糖溶解，再與DMSO混合，然后加入分子篩脫水，采用Needs法進行多糖甲基化，可得到甲基化程度比較完全的產(chǎn)物。在甲基化分析過程中，需要注意以下幾點：

（1）多糖甲基化后用紅外檢測其是否含有羥基，如果仍有羥基峰存在，則表示甲基化不完全，需重復(fù)進行甲基化或者采用氯仿等溶劑將已甲基化的多糖萃取出來并作后續(xù)處理分析；

（2）含有糖醛酸或氨基己糖殘基的多糖比較難甲基化，可能會產(chǎn)生二級產(chǎn)物。對于含有糖醛酸、氨基己糖以及某些取代基團的多糖，在甲基化分析時需要考慮甲基化和酸水解是否會引發(fā)副反應(yīng)。3·3儀器分析法3·3·1紫外光譜法

紫外光譜法是多糖結(jié)構(gòu)研究中常用的儀器分析方法之一，如采用苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法等測定多糖含量，咔唑-硫酸法測定糖醛酸含量，柱層析過程中利用苯酚-硫酸法繪制多糖洗脫曲線，考馬斯亮藍法或Folin-酚試劑法測定多糖復(fù)合物中的蛋白含量等。在波長280、260nm處考察多糖中是否含有蛋白、核酸等。利用紅外光譜中多糖的特征吸收峰，可鑒定多糖中糖的種類、糖環(huán)構(gòu)型，提供異頭碳的信息。3·3·2氣相色譜法（GC）

氣相色譜法主要用于單糖組成、糖醛酸種類和組成、Smith降解產(chǎn)物等分析。GC具有樣品用量少、分辨率強、靈敏度高、分析速度快等優(yōu)點，然而該法需要對多糖樣品進行處理，衍生成易揮發(fā)、對熱穩(wěn)定的衍生物后再進行分析。液相色譜法（HPLC）也可用于糖的分析，如多糖純化及其相對分子質(zhì)量測定，單糖組成、糖醛酸種類分析以及糖含量測定，通常選用示差檢測器。3·3·3質(zhì)譜法

在糖類的研究中質(zhì)譜法顯示出不可替代的作用。GC-MS已廣泛應(yīng)用于糖組成分析和甲基化分析，以確定糖殘基連接方式。上世紀(jì)80年代各軟電離技術(shù)的誕生，如快原子轟擊質(zhì)譜（FAB-MS）、電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）、基質(zhì)輔助激光解析離子化質(zhì)譜（MALDI-MS）等，使糖結(jié)構(gòu)分析研究取得了日新月異的發(fā)展。3·3·4核磁共振（NMR）技術(shù)

NMR是研究多糖糖鏈結(jié)構(gòu)的一種有效方法，常用來解決多糖結(jié)構(gòu)中糖普鍵的構(gòu)型和重復(fù)結(jié)構(gòu)中單糖的數(shù)目。其中’H-NMR主要解決多糖結(jié)構(gòu)中糖普鍵的構(gòu)型問題;’3c-NMR的化學(xué)位移較’H-NMR寬，分辨率較高，因此不僅能夠確定各種碳的位置，還能夠區(qū)別分子的構(gòu)型和構(gòu)象。這種方法的顯著優(yōu)點是不破壞樣品。3·4生物分析方法3·4·1

酶學(xué)法

酶學(xué)法主要是利用特異性糖苷酶對多糖分子進行酶切，可用于確定多糖的糖苷鍵類型，也可用于分析糖苷連接方式。到現(xiàn)在為止，已分離得到的糖苷酶有數(shù)十種。目前，最新酶學(xué)方法是試劑陳列分析方法(R擬姍)，根據(jù)這一方法原理，把酶學(xué)手段和儀器分析方法相結(jié)合，已經(jīng)生產(chǎn)出新型的寡糖序列分析儀，但這還只適用于結(jié)構(gòu)規(guī)律較明確的糖鏈。3·4·2

免疫學(xué)法

該方法的原理是一定結(jié)構(gòu)的多糖會抑制抗原、抗體的結(jié)合。不同的糖有不同的抑制常數(shù)，因此當(dāng)某種未知結(jié)構(gòu)的糖鏈對抗原、抗體的結(jié)合產(chǎn)生了抑制作用，通過測定其抑制常數(shù)，再與已知結(jié)構(gòu)的糖鏈作比較，如有相近抑制常數(shù)，其結(jié)構(gòu)也會相似。

像上面提到的，多糖的結(jié)構(gòu)分析方法很多，但是還沒有一種方法可以單獨完成多糖結(jié)構(gòu)的分析，因此需要將各種方法結(jié)合起來才能完成多糖結(jié)構(gòu)的分析。4天然產(chǎn)物活性多糖的生物活性功能

對多糖的功能研究主要集中在2個方面：一是作為非特異治療劑，作用于相類似的對應(yīng)分子，調(diào)節(jié)各種生理功能或糾正病理過程。二是作為信息分子進入機體，發(fā)揮補充調(diào)節(jié)或抑制的作用。4·1多糖的免疫調(diào)節(jié)作用

多糖的免疫調(diào)節(jié)功能是其最重要的功能活性，多糖能在多條途徑、多個層面對免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用。具體表現(xiàn)在：（1）提高巨噬細(xì)胞吞噬能力。

植物多糖對巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用主要表現(xiàn)在影響巨噬細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生、細(xì)胞因子的分泌（如白細(xì)胞介素IL、腫瘤壞死因子TNF、干擾素IFN集落刺激因子CSF等）、細(xì)胞增殖和吞噬活性等，從而起到對天然免疫和適應(yīng)性免疫的調(diào)控作用。從Aloebarbadensis分離得到的甘露聚糖表現(xiàn)出顯著的刺激單核巨噬細(xì)胞生成的效應(yīng)，車前子多糖具有抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性、刺激體外RAW264.7巨噬細(xì)胞增殖并提高NO釋放的作用。（2）對T、B淋巴細(xì)胞的作用。香菇多糖是一種典型的T淋巴細(xì)胞增強劑，在體內(nèi)外均能促進特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生，提高該細(xì)胞的殺傷活性。（3）對NK（自然殺傷細(xì)胞）、LAK（淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞）的作用。大量的研究表明獼猴桃莖多糖、牛膝多糖等對NK、LAK細(xì)胞活性都有增強作用，其增強作用呈劑量依賴性。（4）通過不同途徑激活補體系統(tǒng)。有些是通過替代通路激活補體，有些是通過經(jīng)典途徑，這一類多糖有柴胡多糖和三七多糖等。（5）以促進樹突狀細(xì)胞（DCs）增殖、表面表達分子MHCⅡ分泌等方式促進DCs誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答啟動，比如靈芝多糖可明顯刺激小鼠脾臟DCs增殖。大粒車前子多糖通過促進DCs表面MHCⅡ類分子、共刺激分子的表達及Th1型細(xì)胞因子的分泌，刺激T淋巴細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答并增強CTL對腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷活力；通過促進DCs表面趨化因子受體CCR7mRNA的表達，促進DCs的移行和發(fā)育成熟，即通過對DCs移行、成熟、功能的上調(diào)作用而促進免疫應(yīng)答的啟動，增強機體的免疫功能。4·2多糖的抗腫瘤活性根據(jù)多糖的抗腫瘤作用將其可以分為兩大類：

一類是具有通過激活機體的免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)細(xì)胞分化，刺激造血，抗轉(zhuǎn)移，抗新生血管生成，誘導(dǎo)NO產(chǎn)生等生物活性的多糖，這類多糖與機體的免疫細(xì)胞通過分子水平的接觸，免疫細(xì)胞被激活，釋放出某些類型的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)信號，從而激發(fā)和增強免疫反應(yīng)，再通過增強機體的免疫功能間接抑制或殺死腫瘤細(xì)胞。具有抗腫瘤活性的多糖大多是通過這種途徑發(fā)揮作用的。

另一類是具有細(xì)胞毒性的多糖，可以直接殺死腫瘤細(xì)胞，如牛漆多糖、青錢柳多糖和茶多糖均可以抑制癌細(xì)胞體外生長，青錢柳多糖可以顯著抑制人宮頸癌Hela細(xì)胞的生長，誘使細(xì)胞發(fā)生凋亡，使細(xì)胞在S期發(fā)生阻滯。然而后一類多糖在體外直接殺傷腫瘤細(xì)胞的機制還不是很清楚。

4·3抗病毒作用

20世紀(jì)70年代以來，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多多糖具有抗皰疹病毒及流感病毒作用，如對艾滋病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒等有明顯的抑制作用。多糖通過以下方式達到抗病毒的作用：抑制病毒抗原的表達，抑制病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的活性以及抑制病毒表面蛋白gp120與細(xì)胞表面CD4受體結(jié)合等。如靈芝中的糖蛋白是通過與病毒分子結(jié)合，阻止病毒分子與細(xì)胞之間的結(jié)合感染。硫酸多糖無論在體外還是在體內(nèi)，都顯示出不同程度的抗病毒活性。硫酸多糖包括從植物中提取到的各種肝素、硫氨多糖、天然中性多糖的硫酸衍生物和人工合成的硫酸多糖，是一類多聚陰離子多糖，帶有大量負(fù)電荷。目前認(rèn)為其抗病毒機理可能是硫酸多糖掩蔽了病毒或細(xì)胞表面的正電荷區(qū)域，從而抑制了病毒的吸附。有研究發(fā)現(xiàn)，勻多糖的硫酸酯抗病毒活性大于雜多糖硫酸酯的活性；相對分子質(zhì)量大小、硫酸化程度、硫酸基的分布等因素均會對硫酸多糖的抗病毒活性有一定影響。4·4

抗氧化作用

許多從天然產(chǎn)物中分離得到的多糖類化合物具有清除自由基，抑制脂質(zhì)過氧化、亞油酸氧化等抗氧化作用，其可能的抗氧化機理有：直接清除活性氧，絡(luò)合產(chǎn)生活性氧所必需的金屬離子，提高抗氧化酶的活性等。提示多糖的抗氧化性可能是抗腫瘤、抗衰老、抗感染等的作用機理之一。車前子多糖具有體外清除DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼

)自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基等抗氧化能力。從茶葉水提物中分離、純化得到的3個多糖組分，其中相對分子質(zhì)量為4.2×104的TPC-3組分的抗氧化能力明顯高于相對分子質(zhì)量為26.8×104和11.8×104的組分。黑靈芝多糖能抑制缺氧/復(fù)氧引起的LDH的釋放及細(xì)胞活力的下降并呈劑量依賴性（可達100μg/mL），這種保護作用也伴隨著減少MDA(丙二醛)的含量，增強SOD（超氧化物歧化酶）、CAT(過氧化氫酶)、GSH-Px（谷胱甘肽過氧化物酶

）活性及蛋白表達，并且能減少缺氧/復(fù)氧引起的ROS(活性氧族