(高清版)GBT 18647-2020 動(dòng)物球蟲(chóng)病診斷技術(shù)

ICS11.220代替GB/T18647—2002Diagnostictechniquesforanimalcoccidiosis國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)IGB/T18647—2020本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T18647—2002《動(dòng)物球蟲(chóng)病診斷技術(shù)》。本標(biāo)準(zhǔn)與GB/T18647—2002相比，除編2002年版的2.2.1.8b)];---“病理檢查”中裂殖子/裂殖體檢查部分增加了對(duì)兔肝臟和鴨、鵝腎臟的檢查(見(jiàn)5.3.1);——增加了結(jié)果“綜合判定”部分(見(jiàn)第6章);請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專(zhuān)利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專(zhuān)利的責(zé)任。本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提出。本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC181)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所。本標(biāo)準(zhǔn)所代替標(biāo)準(zhǔn)的歷次版本發(fā)布情況為：ⅡGB/T18647—2020生動(dòng)物等均有不同程度的危害，特別在集約化養(yǎng)殖中，若控制不嚴(yán)，會(huì)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。本病對(duì)家禽和兔危害較大，急性暴發(fā)的死亡率可超過(guò)30%;其次是豬、牛、羊等家畜，急性感染常引起下痢，生長(zhǎng)嚴(yán)魚(yú)類(lèi)和野生動(dòng)物發(fā)生球蟲(chóng)病的報(bào)道。本病的病原為頂復(fù)器門(mén)(Apicomplexa)、類(lèi)椎體綱(Conoidasida)、真球蟲(chóng)目(Eucoccidiorida)、艾美耳科(Eimeriidae)中的艾美耳屬(Eimeria)、等孢屬(Isospora)、泰澤屬(Tyzzeria)、溫?fù)P屬(Wenyonella)球蟲(chóng)。每種動(dòng)物都有各自特有的球蟲(chóng)種類(lèi)，文獻(xiàn)記錄的畜禽和野生動(dòng)物球蟲(chóng)種類(lèi)已達(dá)2000多種。國(guó)內(nèi)外對(duì)球蟲(chóng)病的經(jīng)典診斷方法是病原檢查，并結(jié)合臨床癥狀和病理剖檢進(jìn)行綜合診斷。盡管?chē)?guó)內(nèi)外學(xué)者建立了免疫學(xué)、血清學(xué)和分子生物學(xué)等多種診斷技術(shù)，如色素試驗(yàn)法、子孢子制動(dòng)反應(yīng)、間接血凝試驗(yàn)、免疫熒光抗體試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等，但由于這些方法檢出的準(zhǔn)確性和操作復(fù)雜等問(wèn)題，尚不能代替現(xiàn)有方法。病原檢查和綜合診斷技術(shù)仍是目前最常用的方法。綜合診斷主要用于發(fā)病或死亡后的診斷，確定前，又可用于發(fā)病后，以確定動(dòng)物或動(dòng)物群感染球蟲(chóng)的程度。病原檢查可廣泛用于流行病學(xué)調(diào)查、防治藥物的篩選和臨床驗(yàn)證、進(jìn)出口檢疫、無(wú)本病健康動(dòng)物群的建立等。1GB/T18647—2020動(dòng)物球蟲(chóng)病診斷技術(shù)1范圍2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件GB/T6682—2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法NY/T541—2016獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范3臨床診斷根據(jù)發(fā)病臨床特征，球蟲(chóng)病可分為急性型和慢性型。有以上臨床癥狀者，可以懷疑為球蟲(chóng)病，確診需進(jìn)一步進(jìn)行病原或病理檢查。4病原檢查4.1材料與試劑4.1.1試劑：飽和鹽水，2.5%重鉻酸鉀溶液，配制方法分別見(jiàn)附錄A中A.1和A.2,配制用水符合GB/T6682—2008三級(jí)水要求。鏡等。300g,若是個(gè)體采樣，采集新鮮糞便不少100g。4.2.2樣品的保存：樣品采集后置于樣品保存袋中，封口后，每份樣品的包裝袋上均要貼上標(biāo)簽，寫(xiě)明采集地點(diǎn)、采集時(shí)間、動(dòng)物種類(lèi)、動(dòng)物年齡、糞便性狀等詳細(xì)資料，置于2℃~8℃冰箱內(nèi)保存。2016要求。24.3操作方法4.3.1定性檢查4.3.1.1將被檢動(dòng)物或動(dòng)物群的新鮮糞便充分?jǐn)噭蚝笕?0g,放入50mL燒杯中，加入適量水。4.3.1.2輕輕攪勻，經(jīng)60目銅絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過(guò)濾；對(duì)于豬、牛、羊、馬等大型動(dòng)物，濾液再經(jīng)100目銅絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過(guò)濾。4.3.1.3將濾液移入50mL試管，2500r/min離心10min。4.3.1.4傾去上清液，沉淀物中加入少量飽和鹽水，混勻，將管內(nèi)的沉淀物混懸液移入10mL玻璃瓶?jī)?nèi)。4.3.1.5用飽和鹽水加滿(mǎn)玻璃瓶，蓋上蓋玻片(蓋玻片應(yīng)與液面接觸),靜置10min。4.3.1.6取下蓋玻片，將有液體的一面蓋在載玻片上。4.3.1.7置載玻片于顯微鏡載物臺(tái)上，用10×10或10×40的倍數(shù)進(jìn)行檢查。4.3.1.8定性檢查的判定標(biāo)準(zhǔn)如下：a)發(fā)現(xiàn)球蟲(chóng)卵囊，判為陽(yáng)性，說(shuō)明該動(dòng)物(群)已感染球蟲(chóng)。將球蟲(chóng)陽(yáng)性糞樣置于2.5%重鉻酸鉀溶液中，在25℃~28℃環(huán)境中培養(yǎng)至孢子化卵囊后，參見(jiàn)附錄B球蟲(chóng)卵囊形態(tài)特征，確定為哪一屬的球蟲(chóng)。b)未發(fā)現(xiàn)球蟲(chóng)卵囊，需從4.3.1.1開(kāi)始重復(fù)檢查5次，仍未見(jiàn)球蟲(chóng)卵囊，該糞樣可判為陰性。對(duì)于家禽、犬、貓等，需連續(xù)采集糞便7d～10d,每天檢查，均未發(fā)現(xiàn)球蟲(chóng)卵囊，方可說(shuō)明該動(dòng)物(群)未感染球蟲(chóng)；而對(duì)于豬、牛、羊、馬、兔等家畜，需連續(xù)采集糞便14d～21d,每天檢查，均未發(fā)現(xiàn)球蟲(chóng)卵囊，說(shuō)明該動(dòng)物(群)未感染球蟲(chóng)。4.3.2定量檢查4.3.2.1對(duì)定性檢查中呈陽(yáng)性的糞樣，需進(jìn)行定量檢查。4.3.2.2每份糞樣取3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)根據(jù)待檢動(dòng)物種類(lèi)不同取不同糞便量，家禽、犬、貓、兔等小型動(dòng)物取糞樣2g,豬、牛、羊、馬等大型動(dòng)物取糞樣10g,放入50mL燒杯。4.3.2.3加入適量自來(lái)水?dāng)噭?，?jīng)60目銅絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過(guò)濾，用少量自來(lái)水沖洗3次～5次濾網(wǎng)；對(duì)于豬、牛、羊、馬等大型動(dòng)物，濾液再經(jīng)100目銅絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過(guò)濾，用少量自來(lái)水沖洗3次～5次濾網(wǎng)。4.3.2.4將濾液移入50mL試管，2500r/min離心10min,棄去上清液。4.3.2.5用少量飽和鹽水將沉淀物攪勻，移入100mL量筒，加飽和鹽水至60mL處，充分混勻。4.3.2.6用吸管吸取混懸液注滿(mǎn)麥?zhǔn)舷x(chóng)卵計(jì)數(shù)板的2個(gè)計(jì)數(shù)室，靜置5min。4.3.2.7將麥?zhǔn)舷x(chóng)卵計(jì)數(shù)板置于顯微鏡下檢查，用10×10的倍數(shù)數(shù)出每個(gè)計(jì)數(shù)室(1cm×1cm×0.15cm=0.15cm3)內(nèi)的所有卵囊數(shù)，將兩個(gè)計(jì)數(shù)室的卵囊數(shù)之和除以2即得卵囊平均值。對(duì)壓線(xiàn)的卵囊，按左、上壓線(xiàn)計(jì)，右、下壓線(xiàn)不計(jì)處理。根據(jù)每個(gè)重復(fù)的卵囊平均值，計(jì)算出三個(gè)重復(fù)的平均值A(chǔ)。等動(dòng)物的OPG按式(2)計(jì)算： OPG=(A÷0.15)×60÷10=A×40 (2)4.3.2.9對(duì)卵囊數(shù)較多的糞樣，可在60mL總體積的基礎(chǔ)上，用飽和鹽水再稀釋B倍后計(jì)數(shù)，家禽、犬、貓、兔等動(dòng)物的OPG按式(3)計(jì)算，豬、牛、羊、馬等動(dòng)物的OPG按式(4)計(jì)算：OPG=A×200×B (3)OPG=A×40×B (4)4.3.2.10定量檢查的判定標(biāo)準(zhǔn)如下：a)OPG>10×10?,為嚴(yán)重感染；3GB/T18647—2020b)1×10?≤OPG≤10×10?,為中度感染；c)OPG<1×10?,為輕度感染。5病理檢查5.1.1磷酸鹽緩沖液(PBS),配制方法見(jiàn)A.3,配制用水符合GB/T6682—2008三級(jí)水要求。5.1.3疑為發(fā)生球蟲(chóng)感染致死或?qū)⒁劳龅膭?dòng)物。5.2.2主要檢查球蟲(chóng)寄生部位(器官)的病變。大多數(shù)的球蟲(chóng)寄生于腸上皮細(xì)胞，若腸道明顯腫大、脹5.3.3在高倍鏡下觀(guān)察，如見(jiàn)有大量球形的像剝了皮的橘子似的裂殖體(直徑大多為10μm～50μm)許有灰白色斑的黏膜，放在載玻片上，滴1滴～2滴磷酸鹽緩沖液6綜合判定凡出現(xiàn)第3章的臨床癥狀和/或符合5.2的病變特征，可判為球蟲(chóng)病疑似病例。凡符合5.2的病變特征，并滿(mǎn)足5.3和/或5.4中檢查結(jié)果為球蟲(chóng)感染，或糞便定量檢查結(jié)果滿(mǎn)足4(規(guī)范性附錄)試劑及其配制A.1飽和鹽水配制稱(chēng)取400g食鹽，放入三角燒瓶中，加入1000mL水，加熱燒瓶至沸騰，充分?jǐn)嚢韬罄鋮s至室溫，有少量鹽析出，即為飽和鹽水，密度約1.18g/cm3。A.22.5%重鉻酸鉀溶液配制稱(chēng)取25g重鉻酸鉀固體，放入1L燒杯中，加入開(kāi)水至1000mL刻度處，充分?jǐn)嚢枋怪劂t酸鉀完全溶解后，冷卻至室溫，即為2.5%重鉻酸鉀溶液。A.3磷酸鹽緩沖溶液(PBS)配制將下列試劑按次序加入到1000mL定量瓶中。氯化鈉氯化鉀磷酸氫二鈉磷酸二氫鉀蒸餾水800mL充分?jǐn)噭?，用適量1mol/L鹽酸(HCl)調(diào)溶液的pH值至7.4,再加蒸餾水定容至1L。分裝至500mL或250mL的玻璃瓶中，在103.41kPa壓力下蒸氣滅菌20min,室溫保存。5(資料性附錄)球蟲(chóng)卵囊形態(tài)特征B.1球蟲(chóng)卵囊呈橢圓形、圓形、卵圓形或梨形等不同的形態(tài)，均有卵囊壁。B.2未發(fā)育成熟的卵囊稱(chēng)為未孢子化卵囊，其顆粒狀的原生質(zhì)多數(shù)呈圓形，位于卵囊中間[圖B.1中B.3發(fā)育成熟的卵囊稱(chēng)為孢子化卵囊，因?qū)俨煌鋬?nèi)含的孢子囊和子孢子數(shù)不相同：a)艾美耳屬(Eimeria)球蟲(chóng)卵囊內(nèi)有4個(gè)孢子囊，每個(gè)孢子囊含2個(gè)子孢子(圖B.1中b)],卵囊b)等孢屬(Isospora)球蟲(chóng)卵囊內(nèi)有2個(gè)孢子囊，每個(gè)孢子囊含4個(gè)子孢子[圖B.1中c]