(高清版)GBT 18645-2020 動(dòng)物結(jié)核病診斷技術(shù)

代替GB/T18645—2002Diagnostictechniquesforanimaltuberculo國家市場監(jiān)督管理總局國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì) Ⅲ 12規(guī)范性引用文件 1 1 14.1流行特點(diǎn) 14.2臨床癥狀 24.3病理變化 25細(xì)菌學(xué)檢查 25.1器材 25.2試劑 2 25.4染色鏡檢 35.5分離培養(yǎng)和生化鑒定 46結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn) 56.1器材 56.2試劑 56.3牛分枝桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng) 56.4禽分枝桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng) 66.5其他動(dòng)物結(jié)核皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng) 67PCR檢測 67.1器材 67.2試劑 67.3采樣及樣品處理 77.4PCR擴(kuò)增反應(yīng) 77.5電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 87.6質(zhì)控 87.7結(jié)果分析及判定 87.8PCR檢測結(jié)果的確證 88Y-干擾素(IFN-Y)體外檢測法(體外IFN-Y釋放試驗(yàn)檢測 88.1器材 88.2試劑 88.3操作方法 89診斷結(jié)果判定 IⅡGB/T18645—2020附錄A(資料性附錄)試劑的配方 附錄B(資料性附錄)標(biāo)本消化濃縮法 附錄C(規(guī)范性附錄)采樣及樣品處理(PCR檢測用) 附錄D(資料性附錄)DNA提取液 附錄E(資料性附錄)常規(guī)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物核酸序列 附錄F(規(guī)范性附錄)樣品采集、包裝和運(yùn)輸?shù)囊?ⅢGB/T18645—2020本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T18645—2002《動(dòng)物結(jié)核病診斷技術(shù)》。與GB/T18645—2002相比，主要技術(shù)內(nèi)容變化如下：-——增加了規(guī)范性引用文件(見第2章);——增加了縮略語(見第3章);-—增加了臨床診斷方法，包括流行特點(diǎn)、臨床癥狀和病理變化(見4.1、4.2和4.3);給以警示(見4.3); 增加了其他動(dòng)物皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)(見6.5):——增加了PCR檢測(見第7章);—增加了γ-干擾素(IFN-Y)體外檢測法(見第8章);——增加了診斷結(jié)果判定(見第9章);———增加了常規(guī)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物核酸序列(見附錄E);——增加了樣品采集、包裝和運(yùn)輸要求(見附錄F)。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專利的責(zé)任。本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提出。本標(biāo)準(zhǔn)由全國動(dòng)物衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC181)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所、中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)研究中心。本標(biāo)準(zhǔn)所代替標(biāo)準(zhǔn)的歷次發(fā)布版本情況為：—-—-GB/T18645—2002。GB/T18645—2020動(dòng)物結(jié)核病是由分枝桿菌屬的細(xì)菌引起的一種慢性、人獸共患性傳染病，在全世界范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康并影響畜牧業(yè)發(fā)展。分枝桿菌屬主要由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、麻風(fēng)分枝桿菌以及非結(jié)核分枝桿菌所組成。而牛分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌是結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的成員，禽分枝桿菌屬于非結(jié)核分枝優(yōu)先防治的國內(nèi)動(dòng)物疫病之一，其病原主要為牛分枝桿菌。牛分枝桿菌的宿主譜廣，幾乎包括所有的溫動(dòng)物結(jié)核病主要通過呼吸道和消化道感染，可侵害多種動(dòng)物，家畜中奶牛最易感，其次為黃牛、牦近年來國內(nèi)外對(duì)動(dòng)物結(jié)核病防控十分重視，如發(fā)病率高、危害較為嚴(yán)重的牛結(jié)核病被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為必須通報(bào)疫病，也是國際貿(mào)易必檢對(duì)象。隨著國際貿(mào)易的蓬勃發(fā)展，動(dòng)物結(jié)核病可在人及多種動(dòng)物間傳播，對(duì)畜牧業(yè)及公共衛(wèi)生安全危害嚴(yán)重。目前我國采用的動(dòng)物結(jié)核病的診斷技術(shù)國家標(biāo)準(zhǔn)為GB/T18645—2002《動(dòng)物結(jié)核病診斷技術(shù)》,其受當(dāng)時(shí)知識(shí)和技術(shù)條件所限，內(nèi)容已不能滿足當(dāng)前動(dòng)物結(jié)核病診斷、檢疫檢測需求。主要存在以下突出問題：1)對(duì)于人獸共患性動(dòng)物結(jié)核病診斷的國家標(biāo)準(zhǔn)，缺少必要的生物安全要求，以及流行病學(xué)、臨床癥狀和病理變化等臨床診斷的相關(guān)內(nèi)容。2)診斷方法涉及動(dòng)物接種實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，因確診時(shí)間長(至少1個(gè)月)和動(dòng)物福利的因素，國際上現(xiàn)已很少使用。3)診斷方法缺少新的通用成熟技術(shù)(如PCR、體外檢測γ干擾素法等)。4)需要對(duì)標(biāo)準(zhǔn)中涉及的煙酸試驗(yàn)或硝基苯甲酸試驗(yàn)的生化方法進(jìn)行規(guī)范統(tǒng)一。如GB/T18645—2002《動(dòng)物結(jié)核病診斷技術(shù)》與SN/T1310—2011《動(dòng)物結(jié)核病檢驗(yàn)檢疫技術(shù)規(guī)范》中涉及生化試驗(yàn)方法不統(tǒng)一。前者采用煙酸試驗(yàn)毒性較大，而后者采用對(duì)硝基苯甲酸試驗(yàn)相對(duì)安全。5)需要增加適用范圍，以滿足出入境檢驗(yàn)檢疫工作發(fā)展的需要。因此，修訂完善適用于我國動(dòng)物結(jié)核病診斷的國家標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于臨床獸醫(yī)、檢驗(yàn)檢疫等科研工1GB/T18645—2020動(dòng)物結(jié)核病診斷技術(shù)1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了動(dòng)物結(jié)核病的臨床診斷、細(xì)菌學(xué)檢查、皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)、PCR和Y-干擾素(IFN-Y)體外檢測的技術(shù)方法、操作程序和判定標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)適用于動(dòng)物結(jié)核病的診斷，其中流行特點(diǎn)、臨床癥狀、病理變化以及皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)適用于動(dòng)物結(jié)核病的臨床診斷；細(xì)菌學(xué)檢查中染色鏡檢適用于動(dòng)物結(jié)核病病原學(xué)初步診斷，細(xì)菌學(xué)檢查中分離培養(yǎng)和生化鑒定、病原分離和PCR試驗(yàn)適用于動(dòng)物結(jié)核病病原學(xué)確診；Y-干擾素(IFN-Y)體外檢測法適用于牛結(jié)核病的輔助診斷。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T18088出入境動(dòng)物檢疫采樣GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求3縮略語下列縮略語適用于本文件。OIE:世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(WorldOrganizationforAnimalHealth)PPD:提純蛋白衍生物(PurifiedProteinDerivative)IU:國際單位(InternationalUnit)PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction)ELISA:酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linkedImmuno-sorbentAssay)TCH:噻吩-2-羧酸肼培養(yǎng)基(Thiophen-2-carboxylicAcidHydrazide)IFN-Y:伽馬干擾素(GammaInterferon)PNB:對(duì)硝基苯甲酸(P-nitrobenzoicAcid)DNA:脫氧核糖核酸(DeoxyribonucleicAcid)dNTPs:脫氧核苷三磷酸(Deoxy-RibonucleosideTriphosphate)EDTA:乙二胺四乙酸(EthyleneDiamineTetraaceticAcid)4臨床診斷4.1流行特點(diǎn)2GB/T18645—2020兔肺部形成少量病灶，但可趨于痊愈而不致死。本病主要通過呼吸道和消化道感染，也可通過交配感染。污染的飼草飼料通過消化道感染也是一個(gè)重要的途徑。該病可發(fā)生在動(dòng)物的任何年齡，雌性動(dòng)物感染率高于雄性。4.2臨床癥狀狀亦不一致：核及全身性結(jié)核。b)禽結(jié)核病常表現(xiàn)貧血、消瘦，雞冠萎縮以及產(chǎn)蛋停止等。病禽可因衰竭或肝變性破裂而突然死亡。c)鹿結(jié)核病癥狀與牛結(jié)核病基本相同。核時(shí)主要表現(xiàn)消瘦、咳嗽、氣喘等癥狀。腸道有病灶時(shí)則可能發(fā)生下痢。e)綿羊及山羊結(jié)核病常不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀，往往在屠宰后才被發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)淋巴結(jié)可見結(jié)核病灶。警示——對(duì)本病剖檢采樣過程中應(yīng)防止病原微生物擴(kuò)散和感染。相關(guān)操作應(yīng)符合GB/T18088和GB19489的規(guī)定。根據(jù)結(jié)核病引起動(dòng)物機(jī)體病理變化的差異，可將其分為增生性和滲出性結(jié)核兩種，有時(shí)兩種病灶同時(shí)存在。當(dāng)機(jī)體抵抗力強(qiáng)時(shí)，對(duì)結(jié)核菌的反應(yīng)常以細(xì)胞增生為主，形成增生性結(jié)核結(jié)節(jié)，即由類上皮細(xì)胞和巨細(xì)胞集結(jié)在結(jié)核菌周圍形成特異性的肉芽腫，外周是一層密集的淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞從而形成非特異性肉芽組織。當(dāng)機(jī)體抵抗力低時(shí)，則以滲出性炎癥為主，即在組織中有纖維蛋白和淋巴細(xì)胞的5細(xì)菌學(xué)檢查5.1器材Ⅱ級(jí)生物安全柜、恒溫培養(yǎng)箱、冰箱(2℃~8℃,-15℃以下)、離心機(jī)(離心力可達(dá)2000g)、顯微鏡。5.2試劑溶液與培養(yǎng)基：4%硫酸、3%或4%氫氧化鈉溶液、5%～10%鹽酸溶液、氫氧化鈉消化液、0.1mol/L檸80)水解試驗(yàn)溶液、硝酸鹽還原試驗(yàn)溶液、0.12%尿素溶液、0.1%酚紅指示劑、噻吩-2-羧酸肼(TCH)培養(yǎng)基。配制方法參見附錄A。3GB/T18645—2020別是肺門淋巴結(jié))、縱隔及一些腸系膜的淋巴結(jié)作為細(xì)菌學(xué)檢查材料。樣品應(yīng)封裝在無菌的潔凈容器或樣品袋內(nèi)冷藏運(yùn)送。如當(dāng)天無法送達(dá)實(shí)驗(yàn)室的，應(yīng)予冷凍后運(yùn)送。當(dāng)無法提供冷凍條件時(shí)，可在病料中加入硼酸，使其終濃度為0.5%,但樣品處理保存時(shí)間不超過1周。樣品采集、包裝和運(yùn)輸詳細(xì)要求應(yīng)按附錄F的規(guī)定執(zhí)行。此法適用于痰、尿、糞和病變組織等的處理。處理前，病變組織先按常規(guī)方法研磨或勻漿將痰、尿、糞或病變組織等按1:5(樣品：溶液，質(zhì)量濃度)加入4%硫酸溶液充分混合，然后置37℃作用1h～2h,經(jīng)1000g離心30min,棄上清液，取沉淀物涂片鏡檢、培養(yǎng)；也可用硫酸處理后，在沉淀物中滴加3%氫氧化鈉溶液中和，然后涂片鏡檢或培養(yǎng)。硫酸消化法具體操作參見附錄B的B.2。此法適用于痰、尿、糞和病變組織等的處理。消化處理前，病變組織先按常規(guī)方法制成乳劑。將被檢的痰、尿、糞便或病變組織按1:5(樣品：溶液，質(zhì)量濃度)的比例加入氫氧化鈉消化液中，混勻后，37℃作用2h～3h,然后無菌滴加5%鹽酸溶液(參見A.3)進(jìn)行中和，將樣本的pH值調(diào)到6.8左右(此時(shí)顯淡黃綠色),以1000g,離心15min～20min,棄上清液，取沉淀物涂片鏡檢或培養(yǎng)。對(duì)痰液的消化濃縮還可采用以下處理方法：取4%氫氧化鈉溶液50mL、0.1mol/L檸檬酸鈉50mL、N-乙酰-L-半胱氨酸0.5g混合。將上述混合液與痰液按1:2的比例加入，作用24h～48h,以1000g離心15min,取沉淀物涂片鏡檢或培養(yǎng)。氫氧化鈉消化法具體操作參見B.3。此法適用于痰、乳、精液和子宮分泌液等處理。將被檢樣品置于試管中，加入3倍～4倍量的15%~20%安替福民溶液，充分搖勻后37℃作用1h,加1倍～2倍量的滅菌蒸餾水，搖勻，1000g離心20min～30min,棄上清液，沉淀物加蒸餾水恢復(fù)量后再離心一次，取沉淀物涂片鏡檢、培養(yǎng)。安替福民(antiformin)沉淀濃縮法具體操作參見B.4。5.4染色鏡檢先在玻片上涂布一層薄甘油蛋白，然后吸取處理好的樣品滴加其上，涂布均勻。如被檢樣品為乳汁等含脂肪較多的材料，在涂片制成后，滴加二甲苯或乙醚，使其覆蓋整個(gè)涂片，搖動(dòng)1min～2min脫脂后傾去，再滴加95%酒精，以除去二甲苯，待酒精揮發(fā)后即可染色。甘油蛋白的配制方法參見A.4。涂片經(jīng)火焰固定后，滴加苯酚復(fù)紅染色液，使其覆蓋整個(gè)涂片。之后，將玻片置于火焰上加熱至出現(xiàn)蒸汽但不產(chǎn)生氣泡，保持熱染色5min。如熱染過程出現(xiàn)染色液干涸，應(yīng)及時(shí)添加，適量補(bǔ)充。充分水洗后滴加3%鹽酸酒精脫色液，脫色30s～60s,至無色素脫下為止。充分水洗，以駱氏美藍(lán)染色液復(fù)4GB/T18645—2020染1min。水洗，吹干，鏡檢。萋-尼氏(Ziehl-Neelsen)抗酸染色配制方法參見A.5。性。在陳舊培養(yǎng)基或干酪性淋巴結(jié)內(nèi)，偶爾可見長達(dá)10μm或更長菌體。否則判為陰性。5.5分離培養(yǎng)和生化鑒定將經(jīng)過處理的病料接種到配氏培養(yǎng)基(參見A.6)或改良L-J培養(yǎng)基(參見A.7)上，每份樣品同時(shí)接種2管～4管，在37℃培養(yǎng)1d后，以熔化的石蠟封口，繼續(xù)培養(yǎng)至少8周(一般10周～12周)?；暇錆駶?、略顯粗糙，加入1%的丙酮酸鈉可促進(jìn)其生長。禽分枝桿菌在固體培養(yǎng)基上形成濕潤、彌漫狀、光滑菌落。結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌在42℃不生長，禽分枝桿菌可在42℃生長。5.5.2.1對(duì)硝基苯甲酸(PNB)試驗(yàn)準(zhǔn)備PNB培養(yǎng)基(參見A.8)1支，改良L-J培養(yǎng)基1支，每支培養(yǎng)基接種1μg細(xì)菌；37℃孵育4周，每周觀察一次結(jié)果并記錄兩種培養(yǎng)基上菌落的生長情況。牛分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌在PNB培養(yǎng)基上不生長，禽分枝桿菌可在PNB培養(yǎng)基上生長；三種菌均可在改良L-J培養(yǎng)基生長。5.5.2.2噻吩-2-羧酸肼(TCH)抗將細(xì)菌接種TCH培養(yǎng)基(參見A.9)和改良L-J培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)8周，1周后開始觀察，每周觀察一次結(jié)果并記錄兩種培養(yǎng)基上菌落的生長情況。禽分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌可在TCH培養(yǎng)基上生長，牛分枝桿菌在TCH培養(yǎng)基上不生長；三種菌均可在改良L-J培養(yǎng)基生長。準(zhǔn)備兩支試管，試管A加入3mLPBS(pH6.7,1/15mol/L)(參見A.10)和1滴0.1%酚紅指示劑(參見A.11);試管B加入用PBS(pH6.7,1/15mol/L)配制的0.12%尿素溶液(參見A.12)和1滴0.1%酚紅指示劑。挑取細(xì)菌約5mg移置于試管B中。兩支試管均置37℃培養(yǎng)3d后觀察結(jié)果。A管(空白對(duì)照)不變色，B管菌液生長使培養(yǎng)基變成紅色判為陽性，培養(yǎng)基不變色者判為陰性。取細(xì)菌約5mg,置于裝有2mL硝酸鹽還原試驗(yàn)溶液(參見A.13)的試管中，充分混勻，置37℃水浴2h,滴加1滴2倍稀釋的鹽酸，2滴0.2%氨基苯磺胺(參見A.14),2滴0.1%N-甲基鹽酸二氨基乙烯(參見A.15),混勻后觀察結(jié)果，1min內(nèi)呈紅色判為陽性，顏色無變化判為陰性。用生理鹽水配制含菌量為10mg/mL的菌液，分裝試管，每管0.5mL,分別置于68℃水浴20min,冷卻后緩緩加入0.5mL過氧化氫(H?O?)和吐溫-80混合液(10%吐溫-80加等量30%H?O?),觀察結(jié)果。如有小氣泡持續(xù)從管底升起判為陽性，否則為陰性。向吐溫-80水解試驗(yàn)培養(yǎng)基(參見A.16)試管中加入含菌量為10mg/mL的菌液0.5mL。3d～5d5GB/T18645—2020后觀察結(jié)果。如試管內(nèi)溶液由原來的琥珀色變?yōu)樘壹t色或紅色判為陽性，無顏色變化判為陰性。動(dòng)物結(jié)核病涉及的分枝桿菌生化試驗(yàn)的判定結(jié)果見表1。表1分枝桿菌生化鑒定判定結(jié)果生化試劑類型對(duì)硝基苯甲酸試驗(yàn)試驗(yàn)?zāi)蛩孛冈囼?yàn)硝酸鹽還原試驗(yàn)?zāi)蜔峤佑|酶試驗(yàn)吐溫-80水解試驗(yàn)牛分枝桿菌十禽分枝桿菌十十——十一結(jié)核分枝桿菌—十十十—士注：“+”’表示陽性反應(yīng)；“一”表示陰性反應(yīng)；“士”表示多數(shù)菌株陽性反應(yīng)，少數(shù)菌株陰性反應(yīng)。6結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)6.1器材6.2試劑6.2.1牛型PPD根據(jù)使用說明將原液用滅菌生理鹽水或稀釋用水稀釋至使用濃度(20000IU/mL)。PPD凍干粉現(xiàn)配現(xiàn)用)。6.2.2禽型PPD配制方法同6.2.1,使用濃度(25000IU/mL)。6.3牛分枝桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)出生后20d的牛即可用本試驗(yàn)，可單獨(dú)采用牛型PPD(PPD-B),也可同時(shí)采用牛型PPD和禽型PPD(PPD-A)進(jìn)行試驗(yàn)。皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)具體操作和觀察步驟為：a)注射部位及術(shù)前處理：將牛只進(jìn)行編號(hào)，采用頸側(cè)中部上1/3處或尾根部進(jìn)行皮內(nèi)注射，3個(gè)月以內(nèi)的犢牛也可在肩胛部進(jìn)行。對(duì)注射部位剪毛，直徑約10cm,用卡尺測量術(shù)部中央皮皺b)注射方法及劑量：牛型和禽型PPD的注射部位應(yīng)間隔開，在頸部同側(cè)、肩胛部同側(cè)應(yīng)間隔約12cm～15cm,或在不同側(cè)進(jìn)行。尾根部采用不同側(cè)(左側(cè)或右側(cè))無毛的褶皺部進(jìn)行注射，用75%酒精消毒注射部位，在皮內(nèi)注入牛型PPD或禽型PPD0.1mL,牛型PPD不低于2000IU/0.1mL,禽型PPD不低于2500IU/0.1mL,或按試劑說明書配制的劑量。c)注射次數(shù)和觀察反應(yīng)：皮內(nèi)注射后經(jīng)72h判定，仔細(xì)觀察局部有無熱痛、腫脹等炎性反應(yīng)，并以卡尺測量皮皺厚度，做好詳細(xì)記錄。對(duì)疑似反應(yīng)牛應(yīng)立即在另一側(cè)以同一批PPD同一劑量進(jìn)行第二回皮內(nèi)注射，再經(jīng)72h觀察反應(yīng)結(jié)果。對(duì)陰性牛和疑似反應(yīng)牛，于注射后96h和6GB/T18645—2020120h再分別觀察一次，以防個(gè)別牛出現(xiàn)較晚的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。牛型PPD單皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)及牛型PPD和禽型PPD比較皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)具體結(jié)果判定如下：a)牛型PPD單皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)牛型PPD單皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)包括頸部注射和尾根部注射：——頸部注射：注射部位前后出現(xiàn)明顯的炎性反應(yīng)，皮皺厚差值大于或等于4mm,判為陽性；無明顯炎性反應(yīng)，且皮皺厚差值為2mm～4mm,判為可疑；無明顯炎性反應(yīng)，皮皺厚值小于或等于2mm,判為陰性。對(duì)于已確認(rèn)感染的牛群，皮試出現(xiàn)任何可觸摸或可見的腫脹反應(yīng)均判為——尾根部注射：出現(xiàn)可觸摸或可見的炎性反應(yīng)(當(dāng)出現(xiàn)兩側(cè)褶皺部時(shí)，注射一側(cè)的褶皺部與對(duì)側(cè)的褶皺部厚度差達(dá)4mm及以上；當(dāng)僅出現(xiàn)一側(cè)褶皺部時(shí)，其尾褶厚度達(dá)8mm及以上)判為陽性，未出現(xiàn)可觸摸或可見的炎性反應(yīng)判為陰性。b)牛型PPD和禽型PPD比較皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)注射牛型PPD部位的皮皺厚差大于注射禽型PPD部位的皮皺厚差值大于4mm,判為陽性；注射牛型PPD部位的皮皺厚差大于注射禽型PPD部位的皮皺厚差值在4mm以下，判為可疑；注射牛型PPD部位的皮皺厚值等于或小于注射禽型PPD部位的皮皺厚，判為陰性。判為可疑反應(yīng)的，于42d后進(jìn)行復(fù)檢。結(jié)果仍為可疑或陽性的，判為陽性。6.4禽分枝桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)家禽可在肉髯皮內(nèi)注射禽型PPD,劑量為每羽0.1mL,約2500IU或按試劑說明書配制的劑量。注射后24h觀察判定結(jié)果。注射部位腫脹，出現(xiàn)硬結(jié)、擴(kuò)展至對(duì)側(cè)肉髯和頸部的廣泛性水腫等炎6.5其他動(dòng)物結(jié)核皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)鹿、豬、羊等其他中大動(dòng)物的皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)參照牛的皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)進(jìn)行判定。其中鹿的注7PCR檢測心機(jī)(離心力可達(dá)15000g)、旋渦混勻器、冰箱(2℃~8℃,-20℃,-80℃)、微量可調(diào)移液器(10μL,100μL,1000μL)及配套帶濾芯吸嘴。7.2試劑7.2.12×PCR反應(yīng)液：含Taq20mmol/LTris-HCL(pH8.3),100mmol/L氯化鉀，3mmol/L氯化鎂。也可采用等效商品化試劑。7GB/T18645—20207.2.2PCR擴(kuò)增引物序列：動(dòng)物結(jié)核病中涉及的分枝桿菌PCR擴(kuò)增引物及序列信息見表2。表2分枝桿菌引物名稱及序列目標(biāo)菌名稱引物名稱引物序列牛分枝桿菌MBF上游引物：5'-ACGCGACGACCTCATATTCC-3’MBR下游引物：5'-CACCCAGAAGGCGAACAGAT-3’結(jié)核分枝桿菌CSB1上游引物：5’-TTCCGAATCCCTTGTGA-3’CSB3下游引物：5'-AGTCGCCGTGGCTTCTCTTTTA-3’禽分枝桿菌DnaJ1上游引物：5'-GACTTCTACAAGGAGCTGGG-3’DnaJ2下游引物：5'-GAGACCGCCTTGAATCGTTC-3’上游引物：5'-GAGTTGACCGCGTTCATCG-3’下游引物：5'-CGTCGAGGAAGACATACGG-3’上游引物：5’-GGATTGCTAACCACGTGGTG-3’下游引物：5'-GCGAGTTGCTTGATGAGCG-37.2.3滅菌雙蒸水。7.2.4電泳試劑：Goldview或其他等效核酸染料，DNA標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子質(zhì)量(100bp～1kb)、Tris-乙酸(TAE)電泳緩沖液，2%瓊脂糖凝膠，配制方法參見附錄A。7.3采樣及樣品處理采樣及樣品處理按附錄C的規(guī)定執(zhí)行。其涉及的樣品采集、包裝和運(yùn)輸按附錄F的規(guī)定執(zhí)行。7.4PCR擴(kuò)增反應(yīng)7.4.1PCR擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備取出2×PCR反應(yīng)液、引物，在室溫下融化，瞬時(shí)離心5s后置冰上?；虿捎闷渌刃唐坊疨CR反應(yīng)試劑。PCR反應(yīng)混合液的試劑及用量見表3。表3PCR反應(yīng)混合液的成分及用量試劑2×PCR反應(yīng)液PCR引物(10μmol/L)滅菌雙蒸水用量補(bǔ)充反應(yīng)體系至24μL可根據(jù)需要選擇牛分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌以及禽分枝桿菌進(jìn)行PCR檢測。對(duì)于牛分枝桿菌，每個(gè)PCR反應(yīng)混合液中加MB上下游引物(10μmol/L)各1μL;對(duì)于結(jié)核分枝桿菌，每個(gè)PCR反應(yīng)混合在上述PCR反應(yīng)混合液中分別加入已提取好的樣品或?qū)φ蘸怂?μL,充分混勻。7.4.3PCR擴(kuò)增檢測牛分枝桿菌或結(jié)核分枝桿菌PCR反應(yīng)條件：第一步，94℃,3min;第二步，94℃,20s,牛分枝桿菌8GB/T18645—2020牛分枝桿菌PCR特異擴(kuò)增產(chǎn)物分子量為406bp,結(jié)核分枝桿菌禽分枝桿菌3條特異PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分子量分別為577bp(IS901基因片段)、385bp(IS1245基因片特異擴(kuò)增產(chǎn)物，判為結(jié)核分枝桿菌陽性；對(duì)于禽分枝桿菌PCR檢測，樣品同時(shí)呈現(xiàn)577bp、385bp和必要時(shí)，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序確證。將所測得的序列與標(biāo)準(zhǔn)序列(參見附錄E)進(jìn)行比對(duì)，序列吻合(擴(kuò)增區(qū)全序列比對(duì)同源性達(dá)95%以上)表明確證為陽性。酶標(biāo)儀(波長450nm)、Ⅱ級(jí)生物安全柜、二氧化碳培養(yǎng)箱或生化培養(yǎng)箱、混勻儀、冰箱(2℃~8℃,24孔細(xì)胞培養(yǎng)板。IFN-Y單克隆抗體1D4、100×HRP標(biāo)記鼠抗牛IFN-Y單克隆抗體4B5混勻3次～5次，18℃~25℃保存，30h內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行刺激培養(yǎng)。將抗凝血輕輕顛倒混勻，無菌分裝于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每份血液樣品分裝3孔，每孔加入1.5mL全血，分別加入0.1mL的PPD-B(使用工作濃度為：3000IU/mL)、PPD-A(使用工作濃度為：2500IU/mL)和PBS(0.01mol/L,pH7.2～7.4),輕輕振蕩混勻，置37℃、含5%CO?培養(yǎng)24h,收集9GB/T18645—20206次，最后一次輕輕拍干ELISA板。加入含有3%BSA的PBS溶液，200μL/孔，2℃~同8.3.3。洗滌后的單克隆抗體包被板可立即使用或用鋁箔袋包裝，置2℃~8℃保存?zhèn)溆?。將試劑盒中溶?100×HRP-抗牛IFN-Y單抗、陽性對(duì)照和陰性對(duì)照除外)從2℃~8℃取出后恢復(fù)至室溫；將20×洗滌液恢復(fù)至室溫(可在37℃水浴中加熱5min～10min使結(jié)晶溶解),然后用雙蒸水作20倍稀釋(10mL20×濃縮洗滌液加入190mL雙蒸水),充分混勻。取單抗包被板(根據(jù)樣品多少，可拆開分次使用),每孔先加入50μL樣品稀釋液，再分別加入50μL檢測樣品(包括PPD-B、PPD-A和PBS刺激樣品，及陰、陽性對(duì)照)充分混勻，封板，22℃~26℃避光反應(yīng)60min。取出反應(yīng)板，棄去反應(yīng)液，每孔加入250μL1×洗滌液，洗滌6次，最后1次輕輕拍干。用酶標(biāo)抗體稀釋液100倍稀釋100×HRP-抗牛IFN-Y單抗4B5(現(xiàn)配現(xiàn)用，1mL100×HRP-抗牛IFN-Y單抗4B5加入99mL酶標(biāo)抗體稀釋液),100μL/孔，22℃~26℃避光反應(yīng)60min。取出反應(yīng)加入底物顯色液，100μL/孔，從加入第1孔即開始計(jì)時(shí)，22℃~26℃避光反應(yīng)30min。按底物顯GB/T18645—20209診斷結(jié)果判定9.1對(duì)于牛，符合第4章，可判為疑似牛結(jié)核病；符合第4章，并且第5章、6.3、第7章、第8章四種方法中任何一種牛分枝桿菌結(jié)果為陽性，可診斷為牛結(jié)核?。环?.5.1中牛分枝桿菌分離培養(yǎng)并且生化鑒定陽性，或符合5.5.1中牛分枝桿菌分離培養(yǎng)并且第7章PCR檢測陽性，可診斷為牛結(jié)核病。符合6.3.2a)和b)試驗(yàn)結(jié)果陽性，或符合6.3.2a)和第8章試驗(yàn)結(jié)果陽性，可按牛結(jié)核病處理。9.2對(duì)于禽，符合第4章，可判為疑似禽結(jié)核病；符合第4章，并且第5章、6.4、第7章三種方法中任何一種禽分枝桿菌結(jié)果為陽性，可診斷為禽結(jié)核病；符合5.5.1中禽分枝桿菌分離培養(yǎng)并且生化鑒定陽性，或符合5.5.1禽分枝桿菌分離培養(yǎng)并且第7章PCR檢測為陽性，可診斷為禽結(jié)核病。符合6.4試驗(yàn)GB/T18645—2020(資料性附錄)試劑的配方A.14%H?SO?溶液配制方法先取水350mL,然后取98%的濃硫酸10mL(含H?SO?10×98%×1.84=18.03g),最后加水定容至450mL,混勻，即配制好的H?SO?溶液濃度為18/450=4%。A.23%和4%NaOH溶液配制方法稱取NaOH3g或4g溶于100mL無菌去離子水中，混勻。A.35%鹽酸溶液配制方法量取37%的濃鹽酸105.6mL,溶于864.9mL無菌去離子水中，混勻。A.4甘油蛋白配制方法A.4.1成分雞蛋白20mL水楊酸鈉0.4gA.4.2配制取1個(gè)～2個(gè)雞蛋，用自來水清潔蛋殼，并用75%酒精消毒蛋殼表面后，打開氣室處，棄蛋黃，取蛋白20mL,置燒杯中；另取甘油20mL,稱取水楊酸鈉0.4g于含有雞蛋白燒杯中，充分?jǐn)嚢杌靹蚣纯?。A.5萋-尼氏(Ziehl-Neelsen)抗酸染色液配制方法A.5.1苯酚復(fù)紅染色液堿性復(fù)紅飽和酒精溶液(每100mL95%酒精加3g堿性復(fù)紅)10mL,5%苯酚溶液90mL,兩者混合后用濾紙濾過。A.5.23%鹽酸酒精脫色液濃鹽酸3mL,95%酒精97mL,混勻。A.5.3駱氏美藍(lán)染色液乙液：0.01%KOH溶液100mLGB/T18645—2020將甲乙兩液相混合。新鮮脫脂牛奶450mL,馬鈴薯淀粉18g,天門冬素(或蛋白胨)2.6g,去皮馬鈴薯225g,雞蛋15個(gè)(棄去3個(gè)蛋清即含蛋黃15個(gè)和蛋清12個(gè)),甘油40g,2%孔雀綠水溶液30mL。A.6.2配制將馬鈴薯去皮擦成絲，加入馬鈴薯淀粉、天門冬素(或蛋白胨)、脫脂牛60min,并不時(shí)攪拌均勻，使成糊狀。待冷卻至50℃時(shí)加入打碎的雞蛋(蛋殼先用75%酒精消毒洗凈),混勻后用四層紗布過濾除渣。最后加入甘油和孔雀綠水溶液攪拌均勻，分裝于滅菌的試管中。將分裝培養(yǎng)基的試管置血清凝固器(或流通蒸汽鍋)內(nèi)，間歇滅菌3次，每日1次，第1日65℃滅菌30min,第2日、第3日75℃~80℃滅菌30min。分離培養(yǎng)分枝桿菌用。A.7改良L-J培養(yǎng)基配制方法A.7.1成分無水磷酸二氫鉀硫酸鎂檸檬酸鎂DL-天門冬素(DL-Asparagin)甘油(丙三醇)馬鈴薯淀粉新鮮雞卵液2%孔雀綠水溶液蒸餾水1000mL(約30個(gè)雞蛋)20mL600mLA.7.2配制加隨攪拌，水浴煮沸1h。雞蛋用75%酒精消毒外殼后，打開，將蛋清和蛋黃充分?jǐn)噭颍膶蛹啿歼^濾。將上述加馬鈴薯粉的鹽溶液冷卻至50℃時(shí)，加入雞蛋液和2%孔雀綠溶液，并充分?jǐn)噭?。分裝于試管中，80℃滅菌30min后，37℃培養(yǎng)48h,若無雜菌污染即可使用。配好的培養(yǎng)基，可在4℃保存4周。A.7.3用途分離培養(yǎng)分枝桿菌用。A.8對(duì)硝基苯甲酸(PNB)培養(yǎng)基GB/T18645—2020對(duì)硝基苯甲酸的比例添加到培養(yǎng)基溶液中。PNB培養(yǎng)基有商品化培養(yǎng)基，可按其使用說明配制。A.9TCH培養(yǎng)基L-J培養(yǎng)基100mL將改良L-J培養(yǎng)基水浴煮沸，加入TCH后，充分?jǐn)噭?。分裝于試管中。80℃滅菌30min后，37℃培養(yǎng)48h,若無雜菌污染即可使用。A.10PBS緩沖液(1/15mol/L)甲液(1/15mol/L磷酸二氫鈉溶液):稱取磷酸二氫鈉(NaH?PO·2H?O)23.87g,加雙蒸水溶解，定容至1000mL。121℃滅菌20min,4℃保存。乙液(15mol/L磷酸氫二鉀溶液):稱取磷酸氫二鉀(K?HPO?)9.07g,加雙蒸水溶解，定容至121℃滅菌20min,4℃保存。將甲液和乙液按3:2的比例混合，即為pH7.0的PBS緩沖液。將甲液和乙液按2:3的比例混合，即為pH6.7的PBS緩沖液。A.110.1%酚紅指示劑配制方法A.11.1成分酚紅0.1g0.1mol/L(0.4%)NaOH15mL去離子水85mLA.11.2配制稱取0.1g酚紅置研缽中，緩慢滴加0.1mol/LNaOH溶液15mL邊加邊磨，并不斷吸出已溶解的酚紅液，直至全部溶解，然后加入85mL雙蒸水，顏色為深紅，經(jīng)粗濾紙過濾后使用，室溫保存。A.120.12%尿素溶液尿素0.12g蒸餾水100mLA.13硝酸鹽還原試驗(yàn)溶液1/15mol/L,pH7.0磷酸鹽緩沖液100mL硝酸鈉85mg將硝酸鈉加入磷酸鹽緩沖液中，溶解后112kPa滅菌20min,分裝于試管，每管2mL。A.140.2%氨基苯磺胺稱取0.2g的氨基苯磺胺，用蒸餾水溶解，定容至100mL。A.150.1%N-甲基鹽酸二氨基乙烯稱取0.1g的N-甲基鹽酸二氨基乙烯，用蒸餾水溶解，定容至100mL。A.16吐溫-80水解試驗(yàn)培養(yǎng)基1/15mol/L,pH7.0磷酸鹽緩沖液吐溫-800.2%中性紅溶液將吐溫-80和0.2%(質(zhì)量濃度)中性紅溶液加入磷酸鹽緩沖液中，混勻，112kPa滅菌20min。分裝于試管中，每管2mL。冷卻后存放于4℃可保存2周。A.17檸檬酸鈉—磷酸緩沖液先配制pH6.8磷酸緩沖液：加蒸餾水溶解，定容至B液(0.2mol/LNa?HPO?溶液):稱取Na?HPO?·12H?O35.82g,加蒸餾水溶解，定容至分別量取51mLA液，49mLB液，混合即成100mLpH6.8磷酸緩沖液。稱取2.94g檸檬酸鈉(Na?C?H?O·2H?O),加入到100mLpH6.8磷酸緩沖液中，充分溶解。121℃±2℃高壓滅菌15min,貯存于4℃。A.18檸檬酸鈉緩沖液檸檬酸5.3g檸檬酸鈉15g葡萄糖16.2g稱取上述試劑，溶解于蒸餾水，定容至1000mL,混勻。121℃±2℃高壓滅菌15min,貯存于稱取186.1gEDTA,加入到800mL蒸餾水中，磁力攪拌器上劇烈攪拌，用氫氧化鈉調(diào)pH值至8.0定容至1000mL,分裝后121℃±2℃高壓滅菌15min,室溫貯存。A.200.01mol/LpH7.6PA液(0.2mol/LNaH?PO?,溶液):稱取一水合磷酸二氫鈉(NaH?PO?·H?O)27.6酸二氫鈉(NaH?PO?·2H?O)31.2g,溶于蒸餾水中，定容至1000mL。B液(0.2mol/LNa?HPO?溶液):稱取十二水合磷酸氫二鈉(Na?HPO?·12H?O)71.6合磷酸氫二鈉(Na?HPO?·2H?O)35.6g溶于蒸餾水中，定容至1000mL。g,或二水合磷稱取17g氯化鈉，用適量蒸餾水溶解，量取13mLA液加87mLB液，用蒸餾水定容至2000mL。A.21TAE電泳緩沖液10×TAE的配制：冰乙酸0.5mol/LEDTA加水定容至1000mL。使用時(shí)，用蒸餾水稀釋10倍即為1×TAE電泳緩沖液。A.221%瓊脂糖凝膠稱取1g瓊脂糖粉，加入100mL1×TAE電泳緩沖液，加熱溶解，冷卻至60℃,加5μLGoldview或其他等效核酸染料，混勻。A.230.01mol/L無菌PBS(pH7.2～7.4)稱取Na?HPO?1.42g,KCl0.2g,NaCl8.0g,KH?PO?0.27g,加雙蒸水至800mL,調(diào)pH值7.2~7.4,定容至1000mL,高壓滅菌或過濾除菌。A.24包被緩沖液(pH9.6)稱取Na?CO?1.59g,NaHCO?2.93g加雙蒸水至800mL,調(diào)pH9.6,定容至1000mL。A.2520×濃縮洗滌液稱取Na?HPO?28.4g,KCl4g,NaCl160g,KH?PO?5.4g溶于900mL的去離子水中，加入吐溫-2010mL,proclin3000.5mL,待完全溶解后用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.4,定容至1000mL,使用時(shí)用雙蒸水稀釋成1×洗滌液，過濾除菌。A.26樣品稀釋液蒸水至800mL,調(diào)pH7.2～7.4,定容至1000mL,過濾除菌。A.27酶標(biāo)抗體稀釋液蒸水至800mL,調(diào)pH7.2～7.4,定容至1000mL,過濾除菌。A.28封閉液稱取Na?HPO?1.42g,KCl0.2g,NaCl8.0g,KH?PO?0.27g,BSA30g,proclin3000.5mL,加雙蒸水至800mL,調(diào)pH7.2～7.4,定容至1000mL,過濾除菌。A.29TMB底物顯色溶液A液：醋酸鈉13.6g,檸檬酸1.6g,30%H?O?0.3mL,加雙蒸水至500mL,避光保存于2℃~B液：EDTA-Na?0.2g,檸檬酸0.95g,甘油50mL,TMB-2HCl(用DMSO溶解為10mg/mL)0.2g,加雙蒸水定容至500mL,避光保存于2℃~8℃。使用前，將A液和B液等體積混合，立即使用。亦可用商品化TMB底物顯色溶液。A.30終止液取37%濃鹽酸82.8mL加入917.2mL雙蒸水中，混勻，室溫保存。GB/T18645—2020(資料性附錄)標(biāo)本消化濃縮法B.1概述在培養(yǎng)或進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)時(shí)，常因污染的雜菌生長較快，使結(jié)核分枝桿菌被抑制。下列幾種消化濃縮方法可使檢驗(yàn)標(biāo)本中蛋白質(zhì)溶解、殺滅污染雜菌，而結(jié)核分枝桿菌因有蠟質(zhì)外膜而不死亡，并得到濃縮。B.2H?SO?消化法用4%H?SO?溶液和病灶組織等按質(zhì)量比約5:1之比例加入混合，然后置37℃作用1h～2h,經(jīng)3000g～4000g離心30min,棄上清，取沉淀物涂片鏡檢、培養(yǎng)和接種動(dòng)物。也可用H?SO?消化濃縮后，在沉淀物中加入3%NaOH中和，然后抹片鏡檢、培養(yǎng)。B.3NaOH消化法NaOH消化液配置及標(biāo)本處理方法如下：a)取NaOH35g～40g,鉀明礬2g,溴麝香草酚藍(lán)20mg(預(yù)先用60%酒精配制成0.4%濃度，應(yīng)用時(shí)按比例加入)、蒸餾水1000mL混合，即為NaOH消化液。b)將被檢病灶組織與NaOH消化液按量(質(zhì)量濃度)之比約1:5混合均勻后，37℃作用2h～3h,然后無菌滴加5%～10%HCl溶液進(jìn)行中和，調(diào)標(biāo)本的pH值到6.8左右(此時(shí)顯淡黃綠色),以3000g～4000g離心15min～20min,棄上清，取沉淀物涂片鏡檢、培養(yǎng)和接種動(dòng)物。c)在病料中加入等量(質(zhì)量濃度)的4%NaOH溶液，充分搖蕩5min～10min,然后以3000g離心15min～20min,棄上清，加1滴酚紅指示劑于沉淀物中，用2mol/L鹽酸中和至淡紅色，B.4安替福民(antiformin)沉淀濃縮法應(yīng)用時(shí)，將A、B兩液等量混合，再用蒸餾水稀釋成15%～20%后使用，該溶液應(yīng)存放于棕色瓶內(nèi)。將被檢樣品置于試管中，加入3倍～4倍量(質(zhì)量濃度)的15%～20%安替福民溶液，充分搖勻后37℃作用1h,加1倍～2倍量(體積分?jǐn)?shù))的滅菌蒸餾水，搖勻，3000g～4000g離心20min～30min,棄GB/T18645—2020(規(guī)范性附錄)采樣及樣品處理(PCR檢測用)C.1采樣工具采樣工具需采用121℃±2℃滅菌15min并烘干，或經(jīng)160℃干烤2h滅菌；或采用一次性無菌用等效工具。C.2采樣C.2.1血樣合。抗凝劑采用檸檬酸鈉緩沖液，或0.5mol/LEDTA。每6mL血液加1mL抗凝劑。條件允許時(shí)，應(yīng)優(yōu)先采集全血，以更有利于富集菌體。C.2.2奶樣無菌采集奶液于滅菌的容器中。一般以擠出的后段奶液含菌量較多，早晨擠出的奶液含菌量最高。C.2.3痰液動(dòng)物痰液采集：動(dòng)物咯痰極少，宜在清晨采集，用橡膠管自口腔伸入至氣管內(nèi)，外接注射器吸取痰液。亦可取咳出的痰塊。C.2.4組織器官采集動(dòng)物下頜、咽后、支氣管、肺(特別是肺門淋巴結(jié))、縱隔和腸系膜淋巴結(jié)，以及病變組織器官容器中。C.2.6樣品的保存和運(yùn)輸待檢樣品在2℃~8℃保存應(yīng)不超過24h;-20℃保存不超過3個(gè)月；-80℃以下長期保存。樣品應(yīng)置于低溫、密封的容器內(nèi)運(yùn)輸。C.3樣品處理C.3.1血樣前處理取1mL～2mL全血樣品，15000g離心10min,棄上清液；加等體積滅菌雙蒸水充分振蕩，15000gGB/T18645—2020取1mL～2mL血清樣品，15000g離心10min;棄上清液，加1mL0.01mol/LpH7.6PBS,充分振蕩混勻，15000g離心10min;棄上清液，收集沉淀物，繼續(xù)進(jìn)行核酸提取，或置-20℃貯存?zhèn)溆?。C.3.2奶樣前處理1mL0.01mol/LpH7.6PBS,充分振蕩混勻；將沉淀懸浮液移入微量離心管，15000g離心10min;棄C.3.3痰液的前處理在痰液樣品中加入2倍～4倍體積4%氫氧化鈉溶液，振蕩混勻，室溫放置30min,間或振蕩混勻，使其充分液化(無明顯固狀物并且吸出時(shí)無拖絲現(xiàn)象即為液化完全；若液化不完全，可適當(dāng)再加入少量4%氫氧化鈉溶液直至液化完全);15000g離心10min;棄上清液，加1mL0.01mol/LpH7.6PBS,充分振蕩混勻，15000g離心10min,棄上清液，重復(fù)本步驟1次；收集沉淀物，繼續(xù)進(jìn)行核酸提取，或置—20℃貯存?zhèn)溆谩Ｈ∵m量組織樣品(剔除脂肪、被膜),剪碎，按1:5的比例加入檸檬酸鈉-磷酸緩沖液(例，1g組織樣品加入5mL緩沖液),充分研磨；加等量4%氫氧化鈉溶液，繼續(xù)研磨5min～10min,使組織液化；移入離心管，充分振蕩，75℃溫浴0.5h～1h;取上清液(避免吸取粗渣),15000g離心10min;棄上清液，驟1次；收集沉淀物，繼續(xù)進(jìn)行核酸提取，或置—20℃貯存?zhèn)溆?。C.3.5糞樣前處理取糞樣1g～2g,按1:5的比例加入4%硫酸溶液(例，1g糞樣加5mL液體)充分振蕩混勻，室溫靜置0.5h～1h;取上層約3mL液體(避免吸取粗渣),5000g離心1min,取上清液，15000g離心棄上清液，重復(fù)本步驟1次；收集沉淀物，繼續(xù)進(jìn)行核酸提取，或置—20℃貯存?zhèn)溆?。在上述已完成前處理的樣?沉淀物)中加入50μL～100pLDNA提取液(參見附錄D),充分振蕩混勻，56℃溫浴30min,98℃~100℃加熱10min,瞬時(shí)離心使液滴聚集管底，加等體積三氯甲烷，振蕩混勻，12000g離心5min,取上清液，直接用于PCR或貯存于-80℃?zhèn)溆?適用于除糞樣外的其他樣品)。其中糞樣樣品還應(yīng)進(jìn)行以下步驟：加入等體積異丙醇(-20℃預(yù)冷),顛倒混勻，放置5min~10min;4℃、15000g離心10min,棄上清液，加3倍體積70%乙醇(4℃預(yù)冷),振蕩洗滌；4℃、15000g于PCR或貯存于-80℃?zhèn)溆??；虿捎玫刃У纳唐坊怂崽崛≡噭┖谢蚝怂崽崛≡O(shè)備。含100mmol/L(資料性附錄)Tris-HCL(pH8.0),0.01%TritonX-100,200μg/μL蛋白酶K。可采用等效商品GB/T18645—2020(資料性附錄)常規(guī)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物核酸序列E.1牛分枝桿菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列擴(kuò)增區(qū)域?yàn)镸b1543c和Mb1544基因ACGCGACGACCTCATATTCCGAATCCCTTGTGAAGTAGTAATGTGCGAGCTGAGCGATGTCGCCGCTCCCAAAAATTACCAATGGTTTGGTCATGACGCCTTCCTAACCAGAATTGTGAATTCATACAAGCCGTAGT