土壤中銅、鉛、鎘的快速測(cè)定 酶聯(lián)免疫法

1土壤中銅、鉛、鎘的快速測(cè)定酶聯(lián)免疫法本文件規(guī)定了采用膠體金免疫層析試紙條快速測(cè)定土壤中銅、鉛、鎘含量的方法。本文件適用于土壤中銅、鉛、鎘的快速測(cè)定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法HJ/T166土壤環(huán)境監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范HJ605土壤和沉積物揮發(fā)性有機(jī)物的測(cè)定吹掃捕集/氣相色譜-質(zhì)譜法3術(shù)語(yǔ)和定義HJ605界定的術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。4試驗(yàn)原理利用二氧化鈦對(duì)土壤浸提液中的重金屬離子進(jìn)行吸附、解吸附操作，氨水調(diào)節(jié)pH值，富集得到的重金屬離子可通過(guò)免疫學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)，也即應(yīng)用膠體金試紙檢測(cè)二級(jí)以下的土壤中的重金屬離子。膠體金免疫層析法試紙條結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。當(dāng)T線和C線同時(shí)出現(xiàn)紅色帶時(shí)，若T線顏色較C線深或者顏色相同，表示樣品中待檢物質(zhì)濃度低于檢測(cè)限，或不含待檢物質(zhì)，檢測(cè)結(jié)果為陰性；若T線顏色較C線淺或T線未顯色，則表示樣品中待檢物質(zhì)濃度高于檢測(cè)限，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；若C線未顯色，檢測(cè)結(jié)果無(wú)效，可能是因?yàn)椴僮鬟^(guò)程不正確或試紙條已失效。圖1膠體金免疫層析法試紙條結(jié)構(gòu)示意圖25試劑和材料除非另有說(shuō)明，分析中僅使用符合GB/T6682規(guī)定的—級(jí)水。5.1硝酸（HNO3）：優(yōu)級(jí)純。4M的硝酸溶液：用超純水將26.88mL的濃硝酸稀釋到100mL；分別配制0.5M、1M、2M、3M的稀硝酸溶液。5.2鹽酸（HCL）：優(yōu)級(jí)純。4M的鹽酸溶液：用超純水將33.12mL的濃鹽酸稀釋到100mL；分別配制0.5M、1M、2M、3M的稀鹽酸。5.3硫酸：優(yōu)級(jí)純。4M的硫酸溶液：用超純水將18mL的濃硫酸稀釋到100mL；分別配制0.5M、1M、2M、3M的稀硫酸溶5.4混合酸溶液。按需要取各個(gè)濃度的稀鹽酸、稀硝酸、稀硫酸溶液分別按1：3、1：1、3：1的體積比兩兩混合。5.5氯化鈉：分析純。5.6EDTA·2Na：分析純。0.1MEDTA·2Na：先配制0.15MPBST緩沖液，稱取氯化鈉8.0g、磷酸二氫鉀0.2g、氯化鉀0.2g、磷酸氫二鈉2.9g、Tween-200.5mL，加蒸餾水至1.0L；用超純水和氫氧化鈉配制1M的EDTA·2Na溶液，然后用PBST緩沖液將其稀釋10倍。5.7鎘離子標(biāo)準(zhǔn)溶液：1000μg/mL。5.8鉛離子標(biāo)準(zhǔn)溶液：1000μg/mL。5.9銅離子標(biāo)準(zhǔn)溶液：1000μg/mL。5.10標(biāo)準(zhǔn)土壤：GBW07407(GSS-7)。5.11二氧化鈦：銳鈦，5nm～10nm，純度99.8％。二氧化鈦在使用前用5M的硝酸浸泡30min，然后于4000rpm下離心10min，去掉上清，用二次水進(jìn)行洗滌，直至將上清液洗至中性，對(duì)沉淀物進(jìn)行抽濾，然后于100℃下烘干，研磨過(guò)篩后于避光干燥處保存?zhèn)溆谩?.12氨水：分析純濃度為22%氨水溶液：用超純水和氨水配制。5.13膠體金免疫層析試紙條，不同金屬離子試紙條不同。市售有證膠體金免疫層析試紙條，也可以配制。6儀器和設(shè)備6.1樣品瓶：帶聚四氟乙烯-硅膠襯墊螺旋蓋的40mL棕色寬口玻璃瓶。6.2采樣器：一次性塑料注射器或不銹鋼專用采樣器。6.3離心機(jī)。6.4高速離心機(jī)。6.5超濾離心管。6.6便攜式pH計(jì)。6.7混合振蕩儀。6.8便攜式pH計(jì)。6.9膠體金讀數(shù)儀。6.10微量移液器：10μl～200μl、100μl～1000μl。36.11一般實(shí)驗(yàn)室常用儀器和設(shè)備。7樣品7.1樣品采集土壤樣品的采集參考HJ/T166的規(guī)定。采樣部位均為0.0cm～20.0cm的表層土壤，利用蛇形采樣法進(jìn)行，將10個(gè)取樣點(diǎn)的土壤混合為一個(gè)土壤樣品，除去土樣中的石子和動(dòng)植物殘?bào)w，利用四分法取1kg左右土壤于聚四氟乙烯密封袋中。將土壤樣品于90℃的鼓風(fēng)干燥箱中烘干，利用四分法取0.25kg左右的土壤，用瑪瑙棒碾碎，過(guò)2mm尼龍篩，混勻，繼續(xù)研磨，過(guò)0.154mm(100目)檢驗(yàn)篩，于陰涼干燥處保存?zhèn)溆谩?.2樣品保存樣品采集后應(yīng)冷藏運(yùn)輸。運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后應(yīng)盡快分析。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)樣品存放區(qū)域應(yīng)無(wú)有機(jī)物干擾，在4℃以下保存時(shí)間為10d。8試驗(yàn)步驟8.1樣品處理8.1.1鎘提取液稱取1.0000g±0.0005g土壤樣品于50mL離心管中，加入5mL4M的鹽酸和15mL4M的硫酸，振蕩30s，40℃下反應(yīng)20min，然后于8000rpm轉(zhuǎn)速下離心10min，上清液待用。將鎘提取液轉(zhuǎn)入50mL比色管中，用濃度25%氨水調(diào)節(jié)pH至8.5，并用超純水定容至刻度。加入50mg納米TiO2，振蕩5min，靜置20min后于4000rpm下離心8min，加入1mL0.1M的E靜置20min后于4000rpm下離心8min，取上清液待用。8.1.2鉛提取液稱取1.0000g±0.0005g土壤樣品于50mL離心管中，加入10mL4M的鹽酸和10mL4M的硝酸，振蕩30s，60℃下反應(yīng)50min，然后于8000rpm轉(zhuǎn)速下離心10min，上清液待用。將鉛提取液轉(zhuǎn)入50mL比色管中，用濃度25%氨水調(diào)節(jié)pH至8.5，并用超純水定容至刻度。加入50mg納米TiO2，振蕩5min，靜置20min后于4000rpm下離心8min，加入1mL0.1M的E靜置20min后于4000rpm下離心8min，取上清液待用。8.1.3銅提取液稱取1.0000g±0.0005g土壤樣品于50mL離心管中，加入1mL4M的鹽酸和3mL4M的硫酸，振蕩30s，80℃下反應(yīng)60min，然后于8000rpm轉(zhuǎn)速下離心10min，上清液待用。將銅提取液轉(zhuǎn)入50mL比色管中，用濃度25%氨水調(diào)節(jié)pH至8.5，并用超純水定容至刻度。加入50mg納米TiO2，振蕩5min，靜置20min后于4000rpm下離心8min，加入1mL0.1M的E靜置20min后于4000rpm下離心8min，取上清液待用。8.2試樣測(cè)試8.2.1取出2℃~8℃保存的膠體金試紙條，并恢復(fù)至15℃~25℃。分別取8.1上清液80μL加入加樣孔A中，水平放置8min～15min，觀察結(jié)果。8.2.2膠體金免疫層析法試樣測(cè)試也可參考附錄A、附錄B試驗(yàn)方法。49結(jié)果判定膠體金免疫層析法結(jié)果判定見(jiàn)圖2。當(dāng)T線和C線同時(shí)出現(xiàn)紅色帶時(shí)，若T線顏色較C線深或者顏色相同，表示樣品中待檢物質(zhì)濃度低于檢測(cè)限，或不含待檢物質(zhì)，檢測(cè)結(jié)果為陰性；若T線顏色較C線淺或T線未顯色，則表示樣品中待檢物質(zhì)濃度高于檢測(cè)限，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；若C線未顯色，檢測(cè)結(jié)果無(wú)效，可能是因?yàn)椴僮鬟^(guò)程不正確或試紙條已失效。圖2膠體金免疫層析法結(jié)果判定示意圖10檢出限以0.1M的EDTA·2Na溶液為溶劑，將1g/L重金屬離子標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋到150μg/L、300μg/L、600μg/L、900μg/L、1200μg/L等濃度，充分混勻后取80μL用試紙條檢測(cè)，8min～15min內(nèi)立即讀值，觀察結(jié)果并拍照，每個(gè)濃度重復(fù)5次，考察重金屬離子膠體金免疫層析試紙條的檢測(cè)限。本文件定義膠體金免疫層析試紙條的定量下限：肉眼下能明顯區(qū)別檢測(cè)線（T）比控制線（C）顏色淺，此時(shí)的濃度為試紙條的定量下限。鎘離子：隨鎘離子濃度的增加，T線的顏色逐漸變淺，150μg/L時(shí)T線顏色明顯比C線顏色淺，6000μg/L時(shí)T線完全消失，確定膠體金試紙條的檢出限為0.15mg/kg。鉛離子：鉛離子膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)時(shí)間在15min內(nèi)，檢出限為0.041mg/kg，定量限為097mg/kg。5附錄A鎘離子膠體金免疫層析試紙?jiān)囼?yàn)A.1試劑和材料A.1.1硝酸（HNO3）：優(yōu)級(jí)純。A.1.2鹽酸（HCL）：優(yōu)級(jí)純。A.1.3硫酸：優(yōu)級(jí)純。A.1.4EDTA·2Na：分析純。0.1MEDTA·2Na：先配制0.15MPBST緩沖液，稱取氯化鈉8.0g、磷酸二氫鉀0.2g、氯化鉀0.2g、磷酸氫二鈉2.9g、Tween-200.5mL，加蒸餾水至1.0L；用超純水和氫氧化鈉配制1M的EDTA·2Na溶液，然后用PBST緩沖液將其稀釋10倍。A.1.5二氧化鈦：銳鈦，5nm～10nm，純度99.8％。A.1.6氨水：分析純A.1.7鎘離子膠體金免疫層析試紙條。A.2儀器和設(shè)備A.2.1膠體金讀數(shù)儀(BMZ6000北京美正生物科技有限公司)。A.2.2移液器：10μl～200μl。A.2.3離心機(jī)：A.2.4超濾離心管：A.2.5便攜式pH計(jì)：A.2.6混合振蕩儀：A.2.7一般實(shí)驗(yàn)室常用儀器和設(shè)備A.3測(cè)試步驟B.3.1樣品處理稱取1.0000g±0.0005g土壤樣品于50mL離心管中，加入5mL4M的鹽酸和15mL4M的硫酸，振蕩30s，40℃下反應(yīng)20min，然后于8000rpm轉(zhuǎn)速下離心10min，上清液待用。將鎘提取液轉(zhuǎn)入50mL比色管中，用濃度25%氨水調(diào)節(jié)pH至8.5，并用超純水定容至刻度。加入50mg納米TiO2，振蕩5min，靜置20min后于4000rpm下離心8min，加入1mL0.1M的EDTA·2Na溶液，振蕩15min，靜置20min后于4000rpm下離心8min，取上清液（待測(cè)樣品）待用。B.3.2測(cè)試將待測(cè)樣品滴于免疫層析試紙加樣孔中，由于毛細(xì)作用，液體向前移動(dòng)；到達(dá)T線時(shí)，待測(cè)樣品中的Cd-EDTA與包被在T線上的Cd-ITCBE-BSA偶聯(lián)物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Cd單克隆抗體膠體金復(fù)合物。當(dāng)測(cè)定有效進(jìn)行時(shí)，控制線(C線)總會(huì)顯示紅色；若不顯色，則測(cè)試無(wú)效。當(dāng)待測(cè)樣品中Cd-EDTA質(zhì)量濃度小于最低檢測(cè)限濃度時(shí)，膠體金結(jié)合墊中的Cd單克隆抗體膠體金復(fù)合物與T線上Cd-ITCBE-BSA及C線上羊抗鼠IgG大量結(jié)合，T線呈色與C線相近，結(jié)果為陰性；反之，則抗Cd單克隆抗體膠體金復(fù)合物6基本上與檢測(cè)試樣中的Cd-EDTA結(jié)合，T線顏色將比C線淺或完全看不到顏色(樣品中Cd-EDTA質(zhì)量濃度越高，T線顯色越淺)，結(jié)果為陽(yáng)性。7鉛離子膠體金免疫層析試紙?jiān)囼?yàn)B.1試劑和材料B.1.1硝酸（HNO3）：優(yōu)級(jí)純。B.1.2鹽酸（HCL）：優(yōu)級(jí)純。B.1.3硫酸：優(yōu)級(jí)純。B.1.4EDTA·2Na：分析純。B.1.5二氧化鈦：銳鈦，5nm～10nm，純度99.8％。B.1.6氨水：分析純B.1.7鉛離子膠體金免疫層析試紙條。B.2儀器和設(shè)備B.2.1膠體金讀數(shù)儀(BMZ6000北京美正生物科技有限公司)。B.2.2移液器：10μl～200μl。B.2.3離心管。B.2.4離心機(jī)。B.2.5禍旋混合器。B.2.6一般實(shí)驗(yàn)室常用儀器和設(shè)備。B.3測(cè)試步驟B.3.1樣品處理稱取1.0000g±0.0005g土壤樣品于50mL離心管中，加入10mL4M的鹽酸和10mL4M的硝酸，振蕩30s，60℃下反應(yīng)50min，然后于8000rpm轉(zhuǎn)速下離心10min，上清液待用。將鉛提取液轉(zhuǎn)入50mL比色管中，用濃度25%氨水調(diào)節(jié)pH至8.5，并用超純水定容至刻度。加入50mg納米TiO2，振蕩5min，靜置20min后于4000rpm下離心8min，加入1mL0.1M的E靜置20min后于4000rpm下離心8min，取上清液待用。B.3.2測(cè)試a）在進(jìn)行檢測(cè)前先完整閱讀使用說(shuō)明書(shū)，從原包裝中取出試劑桶，打開(kāi)后取出所需數(shù)量的微孔試劑和試紙條，并做好標(biāo)記，微孔試劑取出后，請(qǐng)立即蓋好試劑桶蓋；b）使用前將試紙條微孔試劑和待檢樣品恢復(fù)至室溫25℃,將所需微孔試劑置于加熱器上的微孔中。一次檢測(cè)樣品數(shù)量不要超過(guò)4個(gè)，如果一次檢測(cè)樣品數(shù)量超過(guò)4個(gè)，請(qǐng)按照4個(gè)一組，分批檢測(cè)；c）用微量移液器移取200μL回溫后的樣品于微孔試中