高考生物（山東專用）復(fù)習(xí)專題22基因工程教學(xué)課件

專題22基因工程

生物山東省專用考點(diǎn)1重組DNA技術(shù)的基本工具一、限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)來源主要來自原核生物特點(diǎn)識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列,并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開作用結(jié)果產(chǎn)生黏性末端或平末端同尾酶:識別位點(diǎn)不同但切出的DNA片段具有相同的末端序列,在構(gòu)建基因表達(dá)載體

時,使切割位點(diǎn)的選擇范圍擴(kuò)大。同尾酶切割后的連接如圖所示:

小表達(dá)

限制酶不切割細(xì)菌本身DNA分子的原因可能是

。答案:細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)自身的限制酶識別位點(diǎn)進(jìn)行了修飾(如DNA甲基化)二、DNA連接酶種類E.coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源大腸桿菌T4噬菌體特點(diǎn)只“縫合”黏性末端“縫合”黏性末端和平末端作用催化兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵小表達(dá)

DNA連接酶與DNA聚合酶的作用有何不同:

。答案:DNA聚合酶以單鏈DNA為模板,只能催化單個核苷酸加到已有的核酸片段3'末

端的羥基上,形成磷酸二酯鍵;而DNA連接酶不需要模板,催化兩個DNA片段之間形成

磷酸二酯鍵三、載體特點(diǎn)(1)能在受體細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制,或整合到受體DNA上,隨受體DNA同步復(fù)制;(2)具有一個至多個限制酶切割位點(diǎn);(3)具有標(biāo)記基因種類質(zhì)粒(最常用)、噬菌體、動植物病毒等作用攜帶外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞易混易錯

天然的質(zhì)粒一般不完全具備上述條件,往往需要進(jìn)行人工改造后才能用作

基因工程載體?？键c(diǎn)2DNA的粗提取與鑒定、DNA片段的擴(kuò)增與電泳鑒定一、DNA的粗提取與鑒定項目內(nèi)容實(shí)驗(yàn)原理(1)DNA不溶于酒精,但某些蛋白質(zhì)溶于酒精;DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同,其能溶于2mol·L-1的NaCl溶液。(2)在一定溫度下,DNA遇二苯胺試劑會呈現(xiàn)藍(lán)色操作流程

注意事項(1)過濾時應(yīng)選用紗布而不是濾紙,如果用濾紙可能會把DNA分子過濾下來。(2)加入DNA酶抑制劑和低溫操作能防止DNA酶降解DNA。(3)在DNA進(jìn)一步提純時,選用冷卻的體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精的作用是溶解雜質(zhì)和析出DNA二、DNA片段的擴(kuò)增——PCR擴(kuò)增項目

內(nèi)容原理DNA半保留復(fù)制和DNA的熱變性條件基本條件DNA模板提供DNA復(fù)制的模板脫氧核苷酸PCR中所需原料為dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP),dNTP既可作為合成DNA子鏈的原料,又可為DNA的合成提供能量酶耐高溫的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)可催化合成DNA子鏈引物一對短單鏈核酸,使DNA聚合酶從引物的3‘端開始連接脫氧核苷酸激活劑(Mg2+)真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此,PCR反應(yīng)緩沖液中一般要添加Mg2+

過程由圖可知,理論上通過三次循環(huán)可以得到目的基因PCR產(chǎn)物鑒定一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定小表達(dá)

1.利用PCR擴(kuò)增目的基因時,需用兩種不同引物的原因是

。2.PCR

(填“可以”或“不可以”)擴(kuò)增mRNA,原因是

。1.答案:每個DNA分子由兩條反向平行的脫氧核苷酸鏈構(gòu)成,PCR擴(kuò)增時只能從各自模

板鏈的3'端開始,故需堿基序列不同的兩種引物2.答案:不可以PCR是以DNA雙鏈為模板,不能直接用單鏈RNA進(jìn)行PCR,必須把

mRNA逆轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA后才能進(jìn)行PCR三、DNA片段的電泳鑒定1.原理(1)瓊脂糖凝膠電泳利用DNA分子在泳動時的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)(分子本身的大

小和構(gòu)象),達(dá)到分離混合物的目的。(2)凝膠中的DNA分子通過染色,可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來。2.過程3.注意事項(1)電泳時,電泳緩沖液以沒過凝膠1mm為宜。(2)PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓蒸汽滅菌處理。(3)實(shí)驗(yàn)用到的酶、引物、模板DNA、4種脫氧核苷酸的混合液、擴(kuò)增緩沖液等均需

分裝成小份,并在-20℃儲存。使用前,將所需試劑從冰箱拿出后放在冰塊或PCR冷凍

冰盒上緩慢融化。小表達(dá)

DNA的電泳鑒定實(shí)驗(yàn)中,影響DNA分子遷移速率的主要因素是

。答案:分子本身的大小和構(gòu)象,DNA分子的遷移速率與其大小成反比考點(diǎn)3基因工程的基本操作程序一、目的基因的篩選與獲取項目內(nèi)容篩選合適的目的基因(1)對于未知序列要進(jìn)行測序及蛋白質(zhì)功能的鑒定;(2)利用序列數(shù)據(jù)庫和序列比對工具等,篩選結(jié)構(gòu)和功能已知的基因獲得目的基因的途徑(1)已知目的基因的核苷酸序列,人工合成目的基因。(2)以mRNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA作為目的基因。(3)構(gòu)建基因文庫,獲取目的基因。(4)利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因(常用)二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建——基因工程的核心項目內(nèi)容目的使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在,并遺傳給下一代構(gòu)成

構(gòu)建過程易混易錯

啟動子、終止子、起始密碼子、終止密碼子的區(qū)分

啟動子終止子起始密碼子終止密碼子位置DNADNAmRNAmRNA目的基因上游目的基因下游編碼序列首端三個堿基編碼序列尾端三個堿基作用RNA聚合酶識別和

結(jié)合的部位,驅(qū)動

基因的轉(zhuǎn)錄使轉(zhuǎn)錄停止翻譯的起始信號(編碼氨基酸:甲硫氨酸)翻譯的結(jié)束信號

(一般不編碼氨基酸)知識拓展(1)誘導(dǎo)型啟動子是指能被誘導(dǎo)表達(dá)的啟動子。常見的誘導(dǎo)型啟動子有Lac乳糖操縱

子。當(dāng)誘導(dǎo)物存在時可以激活或抑制目的基因的表達(dá)。(2)根據(jù)基因表達(dá)載體上的標(biāo)記基因可篩選出已成功轉(zhuǎn)入基因表達(dá)載體的受體細(xì)胞和

未成功轉(zhuǎn)入基因表達(dá)載體的受體細(xì)胞。(3)空載體和重組載體的分子大小有區(qū)別,可用限制酶酶切產(chǎn)物電泳的方法來鑒定[例

如,2021遼寧,24(4)]。小表達(dá)

構(gòu)建基因表達(dá)載體時,常使用兩種不同的限制酶分別切割目的基因和質(zhì)粒,該過程不

使用同一種限制酶的原因是

。答案:防止目的基因自身環(huán)化和質(zhì)粒自身環(huán)化,保證目的基因與質(zhì)粒正確連接,因?yàn)橥?/p>

種限制酶酶切產(chǎn)生的末端相同,會產(chǎn)生正連和反連的情況,增大篩選正確重組載體的

工作量,正連和反連圖示如下:三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

常用方法受體細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程植物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法體細(xì)胞將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA中→轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細(xì)胞→目的基因插入受體細(xì)胞的染色體DNA上→表達(dá)花粉管通道法受精卵(1)可以在植物受粉后的一定時間內(nèi),剪去柱頭,將DNA溶液滴加在花柱切面上,使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入胚囊;(2)用微量注射器將含有目的基因的DNA溶液直接注入子房動物細(xì)胞顯微注射法受精卵利用顯微注射將目的基因注入動物的受精卵中微生物Ca2+處理法原核生物Ca2+處理大腸桿菌細(xì)胞→細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)→基因表達(dá)載體導(dǎo)入其中小表達(dá)

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中重組與導(dǎo)入的次數(shù)分別是幾次,請簡述重組與導(dǎo)入的內(nèi)容:

。答案:重組和導(dǎo)入的次數(shù)都是兩次,第一次重組是將目的基因重組到Ti質(zhì)粒的T-DNA

上,第二次重組是指插入目的基因的T-DNA拼接到受體細(xì)胞的染色體DNA上;第一次

導(dǎo)入是將含目的基因的Ti質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌,第二次導(dǎo)入是指含目的基因的T-DNA導(dǎo)入

受體細(xì)胞四、目的基因的檢測與鑒定

考點(diǎn)4基因工程的應(yīng)用及蛋白質(zhì)工程一、基因工程的應(yīng)用

小表達(dá)

利用乳腺生物反應(yīng)器,構(gòu)建基因表達(dá)載體時需要將

等調(diào)控元件重組在

一起,原因是

。答案:藥用蛋白基因與乳腺中特異表達(dá)的基因的啟動子只有連接了乳腺蛋白基因的

啟動子,才能保證相應(yīng)的目的基因在雌性動物泌乳期時在乳腺細(xì)胞內(nèi)得以表達(dá)二、蛋白質(zhì)工程1.概念基礎(chǔ)蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系目的合成滿足人類生產(chǎn)和生活需求的蛋白質(zhì)手段基因改造或基因合成2.基本思路3.應(yīng)用項目內(nèi)容臨床研發(fā)出速效胰島素類似物產(chǎn)品醫(yī)藥工業(yè)干擾素的保存等農(nóng)業(yè)改造某些參與調(diào)控光合作用的酶,提高光合作用的效率;設(shè)計優(yōu)良微生物農(nóng)藥等其他工業(yè)改進(jìn)酶的性能或開發(fā)新的工業(yè)用酶1.DNA的粗提取與鑒定深挖教材(1)實(shí)驗(yàn)中涉及的主要試劑及作用(選擇性必修3P74)(2022江蘇,24,12分)(2021山東,13,

2分)試劑作用體積分?jǐn)?shù)為95%的冷酒精溶液溶解蛋白質(zhì),提取DNA2mol/L的NaCl溶液溶解DNA二苯胺試劑鑒定DNA(2)鑒定:在

條件下,DNA遇

呈現(xiàn)藍(lán)色(選擇性必修3P74—75)(2023廣東,11,2分)(2022山東,13,2分)。(3)該實(shí)驗(yàn)是定性實(shí)驗(yàn)。沸水浴二苯胺試劑真題演練

(2023廣東,11,2分)“DNA粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的基本過程是:裂解→分離

→沉淀→鑒定。下列敘述錯誤的是

(

)A.裂解:使細(xì)胞破裂釋放出DNA等物質(zhì)B.分離:可去除混合物中的多糖、蛋白質(zhì)等C.沉淀:可反復(fù)多次以提高DNA的純度D.鑒定:加入二苯胺試劑后即呈現(xiàn)藍(lán)色

D2.基因工程的基本操作程序深挖教材(1)利用PCR獲取目的基因:需要

作為原料,通過

方式打開

DNA雙鏈,利用

催化合成DNA子鏈,同時要加入一對引物,引物的作用是

(選擇性必修3P77)(2022天津,15,10分)(2022江蘇,24,12分)(2022山東,25,12分)(2022遼寧,12,2分)。4種脫氧核苷酸加熱耐高溫的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)使DNA聚合酶能夠從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸(2)基因表達(dá)載體的構(gòu)建:基因表達(dá)載體由目的基因、復(fù)制原點(diǎn)、

、啟動

子、

等組成。啟動子位于基因的

,作用是

。誘導(dǎo)型啟動子的作用是

(選擇性必修3P80)(2023廣東,20,14分)(2023山東,25,10分)。標(biāo)記基因終止子上游RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位,驅(qū)動基因的轉(zhuǎn)錄當(dāng)誘導(dǎo)物存在時,可以激活或抑制目的基因的表達(dá)(3)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞:植物常采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,需將目的基因插入Ti質(zhì)粒的

中(選擇性必修3P81)(2023海南,20,13分)(2023廣東,20,14分)。動物常采用顯

微注射技術(shù)將目的基因?qū)?/p>

;將目的基因?qū)氪竽c桿菌時需先用

處

理,使之處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)(選擇性必修3P82)。T-DNA受精卵Ca2+

(4)目的基因的檢測與鑒定:分子水平的檢測,常采用

等技術(shù)檢測DNA和RNA,檢

測是否表達(dá)出相應(yīng)的蛋白質(zhì)常采用

;最終還要進(jìn)行

水平的鑒定(選擇性必修3P82)(2023山東,25,10分)(2023全國乙,38,15分)(2022

山東,25,12分)(2022天津,15,10分)(2022江蘇,24,12分)。PCR抗原—抗體雜交技術(shù)個體生物學(xué)易混易錯

標(biāo)記基因用來判斷目的基因的導(dǎo)入是否成功,目的基因表達(dá)與否用來判斷

基因工程是否成功。真題演練

(2022天津,15,10分)研究者擬構(gòu)建高效篩選系統(tǒng),將改進(jìn)的苯丙氨酸合成關(guān)

鍵酶基因P1導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌,以提高苯丙氨酸產(chǎn)量。

(1)如圖是該高效篩選系統(tǒng)載體的構(gòu)建過程。載體1中含有KanR(卡那霉素抗性基因)和SacB兩個標(biāo)記基因,為去除篩選效率較低的SacB,應(yīng)選擇引物

和

,并在引物的

(5'/3')端引入XhoⅠ酶識別序列,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)酶切、連接后

環(huán)化成載體2。(2)PCR擴(kuò)增載體3中篩選效率較高的標(biāo)記基因RpsL(鏈霉素敏感基因)時,引物應(yīng)包含

(EcoRⅠ/HindⅢ/XhoⅠ)酶識別序列,產(chǎn)物經(jīng)單酶切后連接到載體2構(gòu)建高

效篩選載體4。(3)將改進(jìn)的P1基因整合到載體4構(gòu)建載體5。將載體5導(dǎo)入鏈霉素不敏感(由RpsL突變

造成)、卡那霉素敏感的受體菌。為獲得成功導(dǎo)入載體5的菌株,應(yīng)采用含有

的平板進(jìn)行初步篩選。(4)用一定的方法篩選出如下菌株:P1基因脫離載體5并整合到受體菌擬核DNA,且載

體5上其他DNA片段全部丟失。該菌的表型為

。A.卡那霉素不敏感、鏈霉素敏感B.卡那霉素敏感、鏈霉素不敏感C.卡那霉素和鏈霉素都敏感D.卡那霉素和鏈霉素都不敏感(5)可采用

技術(shù)鑒定成功整合P1基因的菌株。之后以發(fā)酵法檢測苯丙氨酸產(chǎn)量。答案

(1)14(以上兩空可調(diào)換)5'

(2)XhoⅠ

(3)卡那霉素

(4)B

(5)PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),答案合理即可)考法1

PCR技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用中的問題分析1.引物(1)概念及選擇原則概念一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對的短單鏈核酸選擇原則(1)長度適宜;(2)適量的CG含量(保證有較高的復(fù)性溫度);(3)引物自身及引物之間不存在堿基互補(bǔ)配對;(4)引物的3‘端必須和DNA模板嚴(yán)格互補(bǔ)配對,5’端不需要與DNA模板嚴(yán)格互補(bǔ)配對,5'端可以修飾(2)引物5'端修飾方法和作用5'端修飾方法作用加入限制酶酶切位點(diǎn)可以利用限制酶切割產(chǎn)生末端,方便基因重組放射性同位素、生物素、熒光素等標(biāo)記物方便擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測增添、缺失或替換部分堿基可以產(chǎn)生定點(diǎn)突變2.PCR和電泳(1)PCR①PCR參數(shù)設(shè)置循環(huán)程序變性復(fù)性延伸預(yù)變性94℃,5min--30次94℃,30s55℃,30s72℃,1min最后1次94℃,1min55℃,30s72℃,10min注意:擴(kuò)增的DNA長度不同,延伸預(yù)設(shè)的時間也不同。②PCR需要兩種引物,兩種引物分別與兩條模板鏈的3'端互補(bǔ),引物位于目的基因兩

側(cè)。

(2)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行電泳時異常情況分析未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的可能原因模板DNA含有雜蛋白或TaqDNA聚合酶的抑制劑;TaqDNA聚合酶失活;引物出現(xiàn)質(zhì)量問題;引物濃度不合適;Mg2+濃度過低;變性溫度過低;變性時間過短等出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條帶的可能原因模板DNA出現(xiàn)污染;TaqDNA聚合酶出現(xiàn)質(zhì)量問題;引物特異性不強(qiáng)(如與非目的序列有同源性)或形成引物二聚體;Mg2+濃度過高;復(fù)性時的溫度過低CR循環(huán)次數(shù)過多等例

(2023泰安學(xué)業(yè)仿真模擬,13)通過設(shè)計引物,運(yùn)用PCR技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)目的基因的定

點(diǎn)誘變。如圖為基因工程中獲取突變基因的過程,其中引物1序列中含有一個堿基T不

能與目的基因片段配對,但不影響引物與模板鏈的整體配對,反應(yīng)體系中引物1和引物

2的5'端分別設(shè)計增加限制酶a和限制酶b的識別位點(diǎn)。下列有關(guān)敘述正確的是

(

)A.在PCR反應(yīng)體系中還需要加入4種游離核苷酸、解旋酶、TaqDNA聚合酶等B.第3輪PCR結(jié)束后,含突變堿基對且兩條鏈等長的DNA占1/2C.引物中設(shè)計兩種限制酶識別位點(diǎn)有利于目的基因定向插入載體D.第2輪PCR,引物1能與圖中②結(jié)合并且形成兩條鏈等長的突變基因

解析

PCR反應(yīng)體系通過高溫使DNA解旋(變性),不需要加入解旋酶,A錯誤;第3輪PCR結(jié)束后,含突變堿基對且兩條鏈等長的DNA有2個,而總DNA分子有8個,即占1/4,B

錯誤;引物中設(shè)計兩種限制酶識別位點(diǎn),可以使目的基因定向插入限制酶切割后的載

體,C正確;第2輪PCR,引物1能與圖中②結(jié)合并且形成兩條鏈不等長的突變基因,其中

②較短,D錯誤。

答案

C考法2CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)由Cas9(核酸內(nèi)切酶)和人工設(shè)計的gRNA(向?qū)NA)構(gòu)成。在

gRNA引導(dǎo)下,Cas9與靶序列結(jié)合并將DNA雙鏈切斷。隨后細(xì)胞通過自身的DNA損傷

修復(fù)機(jī)制,將斷裂上下游兩端的序列連接起來,但通常會在斷裂處造成少量核苷酸的

插入或缺失。當(dāng)DNA雙鏈斷裂后,如果細(xì)胞中有DNA修復(fù)模板(由需要插入的目的基

因和靶序列上下游的同源序列組成),斷裂部分可依據(jù)修復(fù)模板進(jìn)行精確修復(fù),從而將

目的基因插入指定位點(diǎn)(如圖1)。通過在Cas9基因中引入突變,獲得了只有切割一條鏈活性的nCas9。將nCas9與胞

嘧啶脫氨酶(或腺嘌呤脫氨酶)融合,利用單堿基編輯技術(shù),能夠?qū)Π形稽c(diǎn)進(jìn)行精準(zhǔn)的堿

基編輯,最終可以實(shí)現(xiàn)C—G→T—A(如圖2)(或A—T→G—C)的轉(zhuǎn)換。該技術(shù)的目的是實(shí)現(xiàn)敲除、敲入、單堿基編輯、激活或抑制基因表達(dá)。例

(2021海南,25節(jié)選)CRISPR/Cas9是一種高效的基因編輯技術(shù),Cas9基因表達(dá)的Cas

9蛋白像一把“分子剪刀”,在單鏈向?qū)NA(sgRNA)引導(dǎo)下,切割DNA雙鏈以敲除目

標(biāo)基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的工作原理如圖所示。

回答下列問題。(1)過程①中,為構(gòu)建CRISPR/Cas9重組質(zhì)粒,需對含有特定sgRNA編碼序列的DNA進(jìn)

行酶切處理,然后將其插入經(jīng)相同酶切處理過的質(zhì)粒上,插入時所需要的酶是

。(2)過程②中,將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞的方法是

。(3)過程③~⑤中,sgRNA與Cas9蛋白形成復(fù)合體,該復(fù)合體中的sgRNA可識別并與目標(biāo)

DNA序列特異性結(jié)合,二者結(jié)合所遵循的原則是

。隨后,Cas9蛋白可切

割

序列。(4)某種蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白?？蒲腥藛T將該蛋白酶基因插入CRISPR/Cas9質(zhì)粒中獲得重組質(zhì)粒,隨后將其導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞,通過基因編輯把該蛋白酶基

因插入基因組DNA中,構(gòu)建得到能大量分泌該蛋白酶的工程菌。據(jù)圖簡述CRISPR/

Cas9重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞內(nèi),將該蛋白酶基因插入基因組DNA的編輯過程:

。

解析

(1)將目的基因插入經(jīng)相同酶切處理過的質(zhì)粒上,插入時所需要的酶是DNA連接酶。(2)大腸桿菌是原核生物,屬于微生物,將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞的方法是Ca2+

處理法。(3)sgRNA分子與目標(biāo)DNA進(jìn)行特異性結(jié)合遵循堿基互補(bǔ)配對原則;由圖知,

Cas9可切割目標(biāo)DNA。(4)根據(jù)圖示可知:CRISPR/Cas9重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄出

sgRNA和表達(dá)出Cas9蛋白,二者形成復(fù)合體,該復(fù)合體中的sgRNA可識別并與目標(biāo)

DNA序列特異性結(jié)合,引導(dǎo)Cas9蛋白切割目標(biāo)DNA序列,插入新的基因。

答案

(1)DNA連接酶

(2)Ca2+處理法

(3)堿基互補(bǔ)配對目標(biāo)(目的)DNA(基因)

(4)表達(dá)Cas9蛋白和sgRNA,兩者形成復(fù)合體;sgRNA識別并結(jié)合目標(biāo)DNA序列;引導(dǎo)

Cas9蛋白切割目標(biāo)DNA序列考法3基因工程中核酸序列閱讀、分析1.核酸序列閱讀、分析時核酸鏈的選擇

(1)在進(jìn)行核酸序列的閱讀、分析時,可只分析非模板鏈和mRNA鏈,而模板鏈中的核酸序列與編碼蛋

白質(zhì)的mRNA的序列是互補(bǔ)的;(2)模板鏈和mRNA鏈堿基排列順序一致(只是mRNA不含T只含U)、方向一致(都從5'端→3'端),且都

蘊(yùn)含著基因的編碼信息2.移碼突變構(gòu)建融合基因表達(dá)載體時易發(fā)生移碼突變,如圖P基因與編碼FLAG的序列形成一個融

合基因:編碼鏈與mRNA中堿基排列順序一致(只是mRNA中不含T只含U),起始密碼子是AUG,那么編碼鏈核酸序列的閱讀、分析就從ATG開始,三聯(lián)體密碼子閱讀框架的改變會造

成翻譯結(jié)果的改變。若發(fā)生移碼突變應(yīng)再插入一定數(shù)量堿基對,保持原基因編碼的密

碼子順序不變。3.核酸序列閱讀、分析需要注意方向性目的基因的方向性(1)一般采用雙酶切,切出不同的黏性末端,保證目的基因按正確的方向插入。(2)若目的基因兩端沒有合適的酶切位點(diǎn),通過PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時可以在引物的5'端加入酶切位點(diǎn)序列。(3)目的基因上游與啟動子一端連接,確保轉(zhuǎn)錄的mRNA序列正確引物的方向性一對引物要分別結(jié)合在兩條模板鏈的3'端,新鏈延伸的方向?yàn)閺?'端到3'端例

(2020北京,17節(jié)選)C1酶基因以B鏈為轉(zhuǎn)錄模板鏈,轉(zhuǎn)錄時mRNA自身的延伸方向

為5'→3'。為了使C1酶基因按照正確的方向與已被酶切的HT質(zhì)粒連接,克隆C1酶基因

時在其兩端添加了SmaⅠ和BamHⅠ的酶切位點(diǎn)。該基因內(nèi)部沒有這兩種酶切位點(diǎn)。

圖中酶切位點(diǎn)1和2所對應(yīng)的酶分別是

。

解析

由“C1酶基因以B鏈為轉(zhuǎn)錄模板鏈,轉(zhuǎn)錄時mRNA自身的延伸方向?yàn)?'→3'”,知轉(zhuǎn)錄從DNA鏈的3'端開始,mRNA自身的延伸方向?yàn)?'→3',即沿B鏈從3'→5'方向轉(zhuǎn)

錄,即B鏈3'端為基因上游,結(jié)合質(zhì)粒上啟動子的方向分析,B鏈3'端應(yīng)該用BamHⅠ進(jìn)行

切割,而其5'端應(yīng)該用SmaⅠ進(jìn)行切割。

答案

BamHⅠ、SmaⅠ考法4不同基因