GB/T 42239.1-2022 洗滌用酶制劑 第1部分：堿性蛋白酶（正式版）

ICS71.100.40GB/T42239.1—2022洗滌用酶制劑第1部分：堿性蛋白酶國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會IGB/T42239.1—2022本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)起草。本文件是GB/T42239《洗滌用酶制劑》的第1部分。GB/T42239已經(jīng)發(fā)布了以下部分：——第1部分：堿性蛋白酶；——第2部分：脂肪酶。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由全國表面活性劑和洗滌用品標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(SAC/TC272)歸口。ⅡGB/T42239.1—2022洗滌用品行業(yè)是酶制劑重要的應(yīng)用領(lǐng)域之一，制定GB/T42239《洗滌用酶制劑》,對于我國洗滌用品行業(yè)規(guī)范含酶類洗滌用品細(xì)分領(lǐng)域的市場，指導(dǎo)行業(yè)內(nèi)企業(yè)創(chuàng)新開發(fā)新產(chǎn)品，杜絕不良企業(yè)欺騙消費GB/T42239《洗滌用酶制劑》擬由以下2個部分構(gòu)成：—第1部分：堿性蛋白酶，目的在于確立洗滌用堿性蛋白酶的分類和技術(shù)要求； 第2部分：脂肪酶，目的在于確立洗滌用脂肪酶的分類和技術(shù)要求。1GB/T42239.1—2022洗滌用酶制劑第1部分：堿性蛋白酶2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文GB/T191包裝儲運圖示標(biāo)志GB4789.2食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定GB4789.3食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗大腸菌群計數(shù)GB/T6003.1試驗篩技術(shù)要求和檢驗第1部分：金屬絲編織網(wǎng)試驗篩GB/T6005試驗篩金屬絲編織網(wǎng)、穿孔板和電成型薄板篩孔的基本尺寸GB/T6368表面活性劑水溶液pH值的測定電位法GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB15258化學(xué)品安全標(biāo)簽編寫規(guī)定JJF1070定量包裝商品凈含量計量檢驗規(guī)則QB/T2739洗滌用品常用試驗方法滴定分析(容量分析)用試驗溶液的制備3術(shù)語和定義3.1能在堿性反應(yīng)條件下切斷蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的肽鍵，使蛋白質(zhì)分子變成小分子多肽3.2蛋白酶在堿性條件下催化蛋白質(zhì)水解的能力。注：堿性蛋白酶活力以堿性蛋白酶活力單位表示，1g固體酶粉(或1mL液體酶),在一定溫度和pH條件下，1min水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸，即為1個酶活力單位，以U/g或U/mL4產(chǎn)品分類按產(chǎn)品形態(tài)分為液體劑型和固體劑型。2GB/T42239.1—20225要求產(chǎn)品的外觀和理化性能指標(biāo)應(yīng)符合表1的規(guī)定。指標(biāo)液體劑型固體劑型外觀淺黃色至棕褐色液體白色、灰白色、黃褐色或其他顏色可自由流動的顆粒pH(25℃,1%水溶液)≤酶活力“/(U/g或U/mL)≥標(biāo)示值干燥失重/%≤粒度(150μm標(biāo)準(zhǔn)篩通過率)/%≤“酶活力標(biāo)示值由供需雙方按合同規(guī)定或生產(chǎn)商明示，酶活力值測定按附錄A仲裁。酶活力只適用于對同一種堿性蛋白酶的質(zhì)量控制，不能用于不同種類堿性蛋白酶的比較；不同種類的堿性蛋白酶，水解底物的方式和特性不同，酶活力值的高低并不代表實際去污效果。用于食品用洗滌劑的酶制劑，微生物限量應(yīng)符合表2規(guī)定。表2微生物限量指標(biāo)菌落總數(shù)/(CFU/g或CFU/mL)≤大腸菌群/(CFU/g或CFU/mL)≤每批產(chǎn)品的銷售包裝凈含量應(yīng)符合JJF1070的要求。6試驗方法除非另有說明，在分析中僅使用確認(rèn)為分析純的試劑和GB/T6682中規(guī)定的三級或以上的水。按GB/T6368的規(guī)定進(jìn)行。36.4酶活力按照附錄A進(jìn)行，也可以參考附錄B進(jìn)行。6.5干燥失重6.5.1.1電熱干燥箱。6.5.1.2分析天平：精度為0.0001g。6.5.1.3稱量瓶。用烘干至恒重的稱量瓶稱取2g試樣(稱準(zhǔn)至士0.001g),置于103℃±2℃電熱干燥箱中，將蓋取下，側(cè)放在稱量瓶旁，烘干2h,取出，加蓋，放入干燥器中冷卻至室溫，稱量。6.5.3結(jié)果計算干燥失重w?以質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示，按式(1)計算：式中：W?——樣品的干燥失重；m?——干燥前稱量瓶加樣品的質(zhì)量，單位為克(g);m?——干燥后稱量瓶加樣品的質(zhì)量，單位為克(g);m——稱量瓶的質(zhì)量，單位為克(g)。以兩次平行測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示至小數(shù)點后一位作為測定結(jié)果。按照附錄C進(jìn)行。6.7菌落總數(shù)按GB4789.2的規(guī)定進(jìn)行。6.8大腸菌群按GB4789.3的規(guī)定進(jìn)行。6.9凈含量按JJF1070的規(guī)定進(jìn)行。7檢驗規(guī)則7.1檢驗分類7.1.1出廠檢驗出廠檢驗項目為表1規(guī)定的外觀、酶活力。當(dāng)適用于食品用洗滌劑產(chǎn)品時，增加表2規(guī)定的項目。4GB/T42239.1—20227.1.2型式檢驗型式檢驗為表1規(guī)定的全部項目。當(dāng)適用于食品用洗滌劑產(chǎn)品時，增加表2規(guī)定的項目。在下列情況下應(yīng)進(jìn)行型式檢驗：化可能影響產(chǎn)品質(zhì)量和性能時；c)長期停產(chǎn)后再恢復(fù)生產(chǎn)時；d)出廠檢驗結(jié)果與上次的型式檢驗有較大差異時；e)市場監(jiān)督管理機構(gòu)、使用單位提出型式檢驗要求時。7.2組批與抽樣原則產(chǎn)品應(yīng)經(jīng)生產(chǎn)廠的質(zhì)量檢驗部門按本文件規(guī)定的檢驗方法檢驗合格，并出具產(chǎn)品質(zhì)量檢驗合格證方可出廠。收貨單位應(yīng)在到貨一個月內(nèi)，憑合格證驗收，必要時可按7.2.3抽樣驗收。7.2.3抽樣根據(jù)批量大小，按表3確定樣本大小，從批中隨機抽取樣本單位。在取樣前應(yīng)將選定的樣本包裝中的樣品混合均勻，在保證均勻的前提下方可取樣。表3批量和樣本大小單位為桶/箱/袋批量樣本大小2347.3判定規(guī)則與復(fù)檢外觀指標(biāo)檢驗不合格，可重新抽樣進(jìn)行復(fù)檢，復(fù)檢結(jié)果仍不合格則判該批產(chǎn)品不合格。理化指標(biāo)檢驗結(jié)果按修約值比較法修約后與指標(biāo)比較判定合格與否，如有一項指標(biāo)不合格，可重新取兩倍箱樣本采取樣品，對不合格項進(jìn)行復(fù)檢產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗及仲裁機構(gòu)抽查檢驗時不進(jìn)行二次抽樣。收貨單位如發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品質(zhì)量不符合本文件規(guī)定的要求，應(yīng)在到貨1個月內(nèi)向生產(chǎn)者交涉。若因檢驗結(jié)果不同，不能取得協(xié)議時，雙方應(yīng)按7.2.3取樣。取樣總量不應(yīng)少于450g,將選取的試樣仔細(xì)混勻存，保存期1個月。仲裁檢驗結(jié)果為最后依據(jù)。5GB/T42239.1—2022產(chǎn)品的外包裝使用符合GB/T191要求的標(biāo)志。產(chǎn)品的包裝上應(yīng)貼有牢固的標(biāo)簽。標(biāo)簽內(nèi)容應(yīng)包括產(chǎn)品名稱、凈含量、生產(chǎn)者和(或)經(jīng)銷者的名應(yīng)符合GB15258的要求。產(chǎn)品的內(nèi)包裝和(或)包裝容器的內(nèi)涂料應(yīng)符合相關(guān)規(guī)定。產(chǎn)品在25℃以下，保質(zhì)期不少于12個月。6GB/T42239.1—2022A.1方法概要堿性蛋白酶在一定的溫度與pH條件下，水解酪蛋白底物，產(chǎn)生含有酚基的氨基酸(如：酪氨酸、色氨酸等),在堿性條件下，將福林試劑(Folin)還原，生成鉬藍(lán)與鎢藍(lán)，用分光光度計于波長680nm下測定溶液的吸光度。酶活力與吸光度成比例，由此可以計算產(chǎn)品的酶活力。A.2儀器和設(shè)備A.2.2紫外-可見分光光度計。A.2.5磁力攪拌子。A.2.9移液器。A.3.1福林(Folin)試劑(1mol/L)25.0g、水700mL、85%磷酸50mL、濃鹽酸100mL。小火沸騰回流10h。取下回流冷卻器，在通風(fēng)櫥中加入硫酸鋰(Li?SO?)50g、水50mL和數(shù)滴濃溴水(99%),再微沸15min,以除去多余的溴(冷后仍有綠色應(yīng)再加溴水，再煮沸除去過量的溴),冷卻，加水定容至1000mL?；靹?，過濾。制得的試劑應(yīng)呈A.3.2福林試劑使用溶液一份福林試劑與兩份水混合，搖勻。也可使用市售福林溶液配制。稱取無水碳酸鈉(Na?CO?)42.4g,用水溶解并定容至1000mL。A.3.4三氯乙酸(65.4g/L)稱取三氯乙酸65.4g,用水溶解并定容至1000mL。稱取氫氧化鈉片劑20.0g,加水900mL并攪拌溶解。待溶液冷卻到室溫后續(xù)水定容至1000mL,攪拌均勻。7A.3.6鹽酸溶液(1mol/L、0.1mol/L)按QB/T2739配制。A.3.7硼酸緩沖溶液(pH=10.5)0.5mol/L氫氧化鈉溶液(A.3.5)調(diào)整pH至10.5±0.05,定容至10稱取1.000g標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白(NICPBP國家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)),加入約80mL相應(yīng)的緩沖溶液，再加入磁加熱時間以免煮沸導(dǎo)致蛋白變性，冷卻到室溫后轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，用緩沖溶液稀釋定容。定容前檢查并調(diào)整pH至10.5。此溶液在冰箱內(nèi)貯存，有效期為3d。使用前重新確認(rèn)并調(diào)整pH至10.5。不同來源或批號的酪蛋白對試驗結(jié)果有影響。如使用不同的酪蛋白作為底物，使用前應(yīng)與以上標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白進(jìn)行結(jié)果比對。后定容至100mL,即為1mg/mL的L-酪氨酸溶液。A.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制按表A.1用移液管精密量取配制L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。L-酪氨酸稀釋液應(yīng)在稀釋后立即進(jìn)行測定。表A.1L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制管號L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(A.3.9)的體積mL加水的體積mL000119228337446555分別取上述溶液各1.00mL(應(yīng)做平行試驗),各加5.00mL碳酸鈉溶液(A.3.3)、1.00mL福林試劑使用溶液(A.3.2),振蕩均勻，置于40℃±0.2℃水浴中顯色20min,取出，用分光光度計于680nm波酪氨酸的0號管為空白，分別測定其吸光度。以吸光度A為縱坐8GB/T42239.1—2022利用回歸方程，計算出當(dāng)吸光度為1時的L-酪氨酸的量(μg),即為吸光常數(shù)K值。其K值應(yīng)在95～100范圍內(nèi)。如不符合，應(yīng)重新配制試劑，進(jìn)行試驗。A.4.2樣品測定A.4.2.1待測酶液的制備液體劑型：精密量取1mL試樣，用緩沖溶液溶解稀釋到一定濃度并記錄其稀釋倍數(shù)。固體劑型：稱取1g試樣(稱準(zhǔn)至0.001g),然后加入一定的緩沖溶液溶解并記錄質(zhì)量(克),用保鮮膜密封，于磁力攪拌器上攪拌15min以上，濾紙過濾或于離心機(4000r/min,5min)離心后備用。推薦濃度范圍為酶活力10U/mL～15U/mL。A.4.2.2測定先將酪蛋白溶液(A.3.8)放入40℃±2℃恒溫水浴中，預(yù)熱5min。取四支試管(一支空白管，三支樣品管),分別準(zhǔn)確加入1mL稀釋好的待測酶液，于40℃±2℃恒溫水浴中，預(yù)熱2min。然后向空白管中加入2mL三氯乙酸(A.3.4),再向樣品管中準(zhǔn)確加入1mL酪蛋白溶液(A.3.8),搖勻準(zhǔn)確計時10min后，立即向樣品管中補加2mL三氯乙酸(A.3.4);向空白管中準(zhǔn)確加入1mL酪蛋白溶液(A.3.8)。將四支試管取出搖勻后分別用慢速定性濾紙過濾備用。準(zhǔn)確吸取1mL濾液分別置于另外四支試管中，再于四支試管中分別依次加入5mL碳酸鈉溶液(A.3.3)后加入1mL福林試劑使用溶液(A.3.2),搖勻立即置于40℃±2℃恒溫水浴中顯色20min,取出備用。于680nm波長處，用10mm比色皿，分別測定其吸光度。A.4.3結(jié)果計算樣品的酶活力X?按式(A.1)計算：………………(A.1)式中：X?——樣品的酶活力，單位為酶活力單位(U/mL或U/g);4——反應(yīng)試劑的總體積，單位為毫升(mL);n?———樣品的稀釋倍數(shù)；10——反應(yīng)時間，單位為分(min)。以兩次平行測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示至個位作為測定結(jié)果。A.5精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不大于這兩個測定值的算術(shù)平均值的3%,以大于3%的情況不超過5%為前提。9GB/T42239.1—2022(資料性)堿性蛋白酶活力的測定紫外分光光度法B.1方法概要堿性蛋白酶在一定的溫度與pH條件下，水解酪蛋白底物產(chǎn)生酪氨酸，然后加入三氯乙酸終止酶反應(yīng)，并沉淀未水解的酪蛋白，濾液中的酪氨酸對紫外光有吸收，可用紫外分光光度法于275nm下測定。根據(jù)吸光度與酶活力的比例關(guān)系計算其酶活力。不同的蛋白酶制劑其紫外法結(jié)果與福林法結(jié)果的換算系數(shù)不同，參考比值為紫外法相對于福林法的1.50倍～1.80倍。如需要，相關(guān)方可根據(jù)實驗結(jié)果統(tǒng)計，確定兩個方法的換算系數(shù)。B.2儀器和設(shè)備B.3試劑和溶液B.4分析步驟B.4.1求K值按福林法的表A.1配制不同濃度的L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后，直接用紫外分光光度計測定其吸光度(A),并計算K值。K值應(yīng)在130～135范圍內(nèi)，如不符合，應(yīng)重新配制試劑，進(jìn)行試驗。B.4.2待測酶液的制備按A.4.2.1制備的樣品稀釋液最終的濃度應(yīng)在15U/mL～25U/mL范圍內(nèi)。B.4.3測定操作按A.4.2.2中的取液、反應(yīng)、靜止沉淀，其中三氯乙酸取樣量改為5mL,直至過濾。濾液用紫外分光光度計，在275nm波長處，測定其吸光度。當(dāng)測試結(jié)果不平行，可以考慮將加入三氯乙酸的試樣溶液返回到水浴中保溫30min,然后再測定吸光度。B.5結(jié)果計算樣品的酶活力X?按式(B.1)計算：………………(B.1)式中：X?———樣品的酶活力，單位為酶活力單位(U/mL或U/g);n?———稀釋倍數(shù)；7——反應(yīng)試劑的總體積，單位為毫升或克(mL或g);GB/T42239.1—2022以兩次平行測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示至個位作為測定結(jié)果。在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不大于這兩個測定值的算術(shù)平均值的3%,以大于3%的情況不超過5%為前提。