(高清版)GBT 41915-2022 納米技術(shù) MTS法測定納米顆粒的細(xì)胞毒性

國家市場監(jiān)督管理總局國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會I Ⅲ 1 1 1 25材料 25.1細(xì)胞系 25.2檢測 3 36儀器 3 38準(zhǔn)備 48.1概述 4 4 48.4驗證細(xì)胞生長狀態(tài) 4 58.6準(zhǔn)備對照實(shí)驗 58.6.1對照實(shí)驗說明 5 58.6.3納米顆粒對照懸浮液的制備 5 6 6 6 6 7 9 99.6測量甲瓚的吸光度 9 9 附錄A(規(guī)范性)可供選擇的細(xì)胞系和檢測方法 Ⅱ 24Ⅲ米材料對人類健康和環(huán)境可能造成潛在風(fēng)險的疑慮也在不斷上升。目前國際上正在開展大量的相關(guān)研化學(xué)品也可能影響納米顆粒與細(xì)胞之間的相互作用。特別是考慮到納米顆粒比表面積大的特點(diǎn)，這一細(xì)胞是生命的基本單元。監(jiān)測納米顆粒暴露后模式細(xì)胞的生物響應(yīng)有望加深我們對納米顆?！白靼冈谌魏螌?shí)驗室均可重復(fù)。IANH通過幾種常見米材料與細(xì)胞的體外相互作用進(jìn)行了比對實(shí)驗(附錄A)。該聯(lián)盟明確了一些會增加數(shù)據(jù)波動的因素，并發(fā)展了降低數(shù)據(jù)波動性的技術(shù)。美國國立衛(wèi)生研究院國家環(huán)境衛(wèi)生科學(xué)研究所(NIEHSNanoGo)資助的研究進(jìn)一步評價了部分測試方案，尤其苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑(MTS)的檢測方案。第三個團(tuán)隊擴(kuò)展了IANH的方法并采用統(tǒng)一設(shè)計的多孔板進(jìn)行實(shí)驗，提高了分析結(jié)果的一致性(附錄B)[5]。尤其重要的是上述項目都是采用多個實(shí)本文件采用MTS法評估體外細(xì)胞的活力6]。該方法利用孔板中胞漿還原酶催化生成的甲膜(吸收峰位于490nm)產(chǎn)生顯色反應(yīng)。通常情況下，吸光度的變化與細(xì)胞數(shù)成正比關(guān)系。但檢測過程中改變了還原酶活性或者反應(yīng)試劑不足量也可能導(dǎo)致顯色反應(yīng)，導(dǎo)致吸光度與細(xì)胞活力(如細(xì)胞數(shù))不成正比關(guān)系。將MTS試劑直接添加到細(xì)胞培養(yǎng)板中，可以快速評估納米顆粒的潛在內(nèi)毒性。由于納米顆常重要。在顯微鏡下直接觀察處理后的細(xì)胞是一個驗證MTS檢測結(jié)果的正交方法。本文件提出的規(guī)本方法中納米顆粒對單獨(dú)細(xì)胞系影響的毒性檢測為初級檢測。本文件提出的標(biāo)準(zhǔn)方法基于上述3種MTS分析方案。實(shí)驗體系的區(qū)別見表1。表1用于制定標(biāo)準(zhǔn)化MTS分析方案的研究總結(jié)發(fā)起機(jī)構(gòu)細(xì)胞系陽性和陰性對照材料是否離心十PS-NP,CeO?CdSO?,無顆粒暴露否BEAS-2B、RLE-6TN和THP-1是十PS-NPCdCl?,無顆粒暴露否·+PS-NP為帶正電PS納米顆粒，CeO?為二氧化鈰，ZnO為氧化鋅，TiO?為二氧化鈦，MWCNT為多壁碳納V需要進(jìn)行對照實(shí)驗，以確定未經(jīng)處理細(xì)胞的細(xì)胞值得注意的是，這里描述的MTS法是用于評估納米材料細(xì)胞毒性的諸多商業(yè)方法之一。雖然本1GB/T41915—2022/IS本文件描述了用于評價納米物體及其聚集體和團(tuán)聚體(NOAA)對細(xì)胞活力影響的MTS方法。此本文件適用于96孔板。下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文ISO/TS80004-2納米科技術(shù)語第2部分：納米物體(Nanotechnologies—Vocabulary—本文件使用的是96孔組織培養(yǎng)級孔板。2按照GB/T16886.5試驗時可再現(xiàn)細(xì)胞毒性反應(yīng)的材料。沉降sedimentation分散相因其中分散顆粒的密度高于連續(xù)相發(fā)生的下試驗樣品testsamplecells/mL:單位毫升體積中的細(xì)胞數(shù)(cellspermillilitre)ylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetraPS:聚苯乙烯(polystyrene)5材料首選已建立的細(xì)胞系，使用時應(yīng)從有資質(zhì)的細(xì)胞庫中獲取。用MTS法測定納米顆粒的細(xì)胞毒性如果需要對細(xì)胞系進(jìn)行儲存，應(yīng)在-80℃或更低溫度下使用相應(yīng)的培養(yǎng)基儲存，且培養(yǎng)基中應(yīng)含有冷凍保護(hù)劑，如二甲基亞砜或甘油。只能在-130℃或更低溫度下長期儲存(幾個月甚至長達(dá)幾年)。35.2.1MTS\PMS[CAS#138169-4試劑在細(xì)胞酶的作用下被還原成可溶于培養(yǎng)基的顯色產(chǎn)物。在沒有人為污染的情況下，培養(yǎng)基的光密度值與培養(yǎng)容器中的細(xì)胞數(shù)量相關(guān)。如果培養(yǎng)條件影響細(xì)胞內(nèi)的還原酶活性，或納米顆粒在檢測5.3對照基亞砜等非金屬化學(xué)品和吐溫80等洗滌劑可作為化學(xué)陽性對照，但其作為陽性5.3.2帶正電的PS納米顆粒，(直徑60nm分散于水中)應(yīng)作為納米顆粒陽性對照材料。該顆粒已在實(shí)驗室間比對證實(shí)可用作A549和Raw264.7細(xì)胞的陽性對照(見表1)。6儀器6.1培養(yǎng)箱，37℃±1℃,加濕，5%CO?/空氣。6.2平底96孔板。6.3U形底96多孔板(作為加樣板使用)。6.4平底24孔板(僅用于細(xì)胞培養(yǎng)和增殖)。6.596孔板酶標(biāo)儀。6.6加速度至少2000g的離心機(jī)。6.7200μL的多通道移液器(至少8個通道)。樣品制備的基本原則是使用可重復(fù)的操作步驟，將納米顆粒分散在生物相容的液體中。這些操作4白蛋白，再進(jìn)行分散，或直接將其分散于含血清的培養(yǎng)基中。有關(guān)分散性的詳細(xì)信息，參見注釋和如果納米顆粒是分散在水等液體介質(zhì)中，所加介質(zhì)的體積在細(xì)胞培養(yǎng)基中的體積分?jǐn)?shù)應(yīng)低于其產(chǎn)納米顆粒懸浮液的液體介質(zhì)可能對細(xì)胞產(chǎn)生毒性并引起假陽性毒性結(jié)果。應(yīng)使用液體介質(zhì)進(jìn)行對a)抗聚集的穩(wěn)定性(反映在平均顆粒尺寸上);b)膠體懸浮液的穩(wěn)定性(反映在沉淀和沉8準(zhǔn)備培養(yǎng)基中無論有無血清都應(yīng)滿足所選細(xì)胞的生長要求。如果抗生素對檢測沒有影響，可在培養(yǎng)基信息見附錄A.56)用體視顯微鏡記錄細(xì)胞的狀態(tài)和形貌。1)輕吸除去孔中的培養(yǎng)液；2)按照廠家說明書收集細(xì)胞；3)將含有細(xì)胞的培養(yǎng)基加入離心管中；5)棄去上清液；6)在100pL培養(yǎng)基中，加入25μL含0.4%臺盼藍(lán)的PBS溶液；8)將細(xì)胞懸液滴在細(xì)胞計數(shù)器上；的細(xì)胞活力應(yīng)大于5%。b)將10mmol/L的CdSO?保存在4℃,無需無菌過濾。6應(yīng)使用經(jīng)過校準(zhǔn)的移液器在96孔板上移取試劑。如果可能，宜用校準(zhǔn)過的多通道移液器進(jìn)行實(shí)驗，如至少帶有6個槍頭的移液器。之前的研究表明用多通道移液器進(jìn)行細(xì)胞接種引起的差異比用單9表征納米顆粒對細(xì)胞活力的影響由于納米顆粒懸浮液可能產(chǎn)生變化，不同時間的3次重復(fù)實(shí)驗應(yīng)用新配的納米顆粒懸液。實(shí)驗流程如圖1所示。潛在干擾形態(tài)7——一個培養(yǎng)板需要準(zhǔn)備1000000個細(xì)胞(約30%過量)。9.2.2將含細(xì)胞的完全培養(yǎng)基(200μL)轉(zhuǎn)移到第3列～第6列和第8列~第10列的每個孔內(nèi)，如圖29.2.3將不含細(xì)胞的完全培養(yǎng)基(200μL)轉(zhuǎn)移到第2列、第7列、第11列的每個孔內(nèi)(斜杠區(qū)),如圖2所示。每個清亮的孔中接種細(xì)胞的密度為1.5×10?個細(xì)胞/孔。第2列、第7列、第11列中只有培養(yǎng)a)孵育24h±2h;9.3.1圖3是加樣板的基本設(shè)置。第6列和第7列為細(xì)胞培養(yǎng)基+1%H?O。第2列～第5列和第8列～第11列分別為陽性對照材料和不同劑量的納米顆粒測試樣品。第2列和第11列則為陽性化學(xué)品和納米顆粒測試樣品的干擾列。樣品體積見表2。用8通道移液器將每孔中對應(yīng)的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)8不含細(xì)胞不含細(xì)胞不處理不處理重復(fù)測試1重復(fù)測試2重復(fù)測試3不含細(xì)胞AHBCDEFG26注：圖3中納米顆粒質(zhì)量分?jǐn)?shù)指第7章的帶正電的PS納米顆粒的懸浮液。當(dāng)其他納米顆粒需要配制成更高質(zhì)量分?jǐn)?shù)時，可參照第7章中的建議，以確定納米顆粒懸浮液在每個劑量組的加入量及分散溶劑的最高質(zhì)量分?jǐn)?shù)。a)參照表2中給出的配制劑量將CdSO?加入到第2列～第5列中；b)參照表2中給出的配制劑量將帶正電的PS納米顆?；蚣{米顆粒測試樣品加入到第8列～第11列中；c)第6列和第7列各加入含1%H?O的培養(yǎng)基200μL。注1:培養(yǎng)基中1%的H?O含量取決于納米顆粒儲備液的濃度，參見第7章的建議。注2:在將細(xì)胞培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱取出前約3h,制備納米顆粒加樣板。這樣可以保證將細(xì)胞上的培養(yǎng)基去除后即可加入含不同劑量的納米顆粒細(xì)胞懸液到培養(yǎng)板中，減小了納米顆粒長時間懸浮在培養(yǎng)基中發(fā)生沉淀帶來的影響。表2加樣板中培養(yǎng)基、化學(xué)藥品、納米顆粒的劑量配比行序號第2列～第5列和第2列和第3列中CdSO?(100mmol/L)在完全細(xì)胞第4列帶正電的PS(1%懸浮濃度)在完全B000C222DEFG099.4.2用200μL移液器(如多通道移液器)將加樣板中樣品轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)板上。9.4.3將細(xì)胞培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱孵育24h。9.6.2用酶標(biāo)儀測定在490nm處的吸光度。a)將培養(yǎng)液中納米顆粒的平均背景水平吸光度(第11列)從每個孔中減去。b)將每個加樣復(fù)孔測得的吸光度對未處理孔(B行)的吸光度進(jìn)行歸一化。這些去掉背景和歸一c)歸一化后，算出同一加樣組(第3列～第5列和第8列～第10列)中該劑量細(xì)胞活力的平均值d)如果測到細(xì)胞毒性，用Graph(資料性)本草案是附錄C中未經(jīng)同行審閱的IANH草案的擴(kuò)展。本草案包括加樣板制備和更多細(xì)胞處理的具體細(xì)節(jié)。A549細(xì)胞被用于評估帶正電的PS納米顆粒和二氧化鈰納米顆粒的細(xì)胞毒性效應(yīng)。使用該方案在5個國際測量實(shí)驗室進(jìn)行了實(shí)驗室間比對。具體實(shí)驗設(shè)計見參考文獻(xiàn)6]。比對結(jié)果匯總在附錄B最后。與NanoGo草案區(qū)別之處是本草案未使用離心步驟來降低納米顆粒可能產(chǎn)生的干擾。B.2實(shí)驗步驟用本草案的修訂版評估納米顆粒對A549細(xì)胞的毒性效應(yīng)。B.2.2材料B.2.2.2檢測B.洛斯維帕克紀(jì)念研究所培養(yǎng)B.青霉素。B.鏈霉素。B.無酚紅的DMEM。B.2蒸餾水或任何適合細(xì)胞培養(yǎng)B.3兩性霉素B(抗真菌劑)。見第6章。B.3.1概述B.3.2培養(yǎng)基B.3.2.1完全培養(yǎng)基B.10%胎牛血清(FBS)。B.2.5μg/mL兩性霉素B。由于L-谷氨酰胺可能會降解，培養(yǎng)基的儲存時間不應(yīng)超過3周。標(biāo)記清楚收到培養(yǎng)基的時間和進(jìn)B.洛斯維帕克紀(jì)念研究所培養(yǎng)基(RPMI-1640)。B.3.3細(xì)胞培養(yǎng)B.3.3.1細(xì)胞復(fù)蘇一旦復(fù)蘇，在實(shí)驗之前細(xì)胞要傳代至少兩次。細(xì)胞傳代培養(yǎng)不應(yīng)超過3個月。用20mL完全培養(yǎng)基將細(xì)胞培養(yǎng)在一個75cm2培養(yǎng)瓶中放置在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下(37℃,5%GB/T41915—2022/ISO19B.加入2mL0.05%胰蛋白酶-EDTA且在37℃,5%CO?的條件下孵育3min。B.晃動培養(yǎng)瓶使細(xì)胞從壁上脫落下來并轉(zhuǎn)移細(xì)胞。B.往培養(yǎng)瓶中加入20mL完全培養(yǎng)基，并吹洗培養(yǎng)瓶3次～5次，轉(zhuǎn)移細(xì)胞。B.3.3.4計數(shù)細(xì)胞確定細(xì)胞的健康狀態(tài)B.用吸管將約20mL的細(xì)胞懸液(2mL胰蛋白酶-EDTA+18mL的完全細(xì)胞培養(yǎng)基)加入到50mL的錐形管中。B.在200g,5min離心細(xì)胞懸浮液，以沉淀細(xì)胞。B.去除上清，添加約1mL培養(yǎng)基并重懸細(xì)胞。用200μL的移液器將溶液混勻。計數(shù)板的一端加入。盡量避免血球計數(shù)板和蓋玻片間產(chǎn)生氣泡，見圖B.1。AB用圖B.1血球計數(shù)板示意圖(細(xì)胞計數(shù)室)B.血球計數(shù)儀板共有8個正方形計數(shù)室，數(shù)角上(圖B.1中的A1、A3、A7、A9、B1、B3、B7和B9)4個1mm2正方形上的所有細(xì)胞數(shù)(染上藍(lán)色代表死細(xì)胞，活細(xì)胞沒有顏色)。如果超過25%的細(xì)胞死亡，細(xì)胞狀態(tài)不好。應(yīng)丟棄當(dāng)前的細(xì)胞懸液，重新養(yǎng)細(xì)胞。B.用以下公式計算每單位體積中細(xì)胞的數(shù)目(cells/mL):細(xì)胞數(shù)=平均細(xì)胞數(shù)×稀釋倍數(shù)×10?/mL。B.4.1接種細(xì)胞B.4.1.1對于1個96孔板需將7.5×105個細(xì)胞(7.5×104cells/mL)重懸于10mL完全培養(yǎng)基中。B.4.1.2在第3列～第6列和第8列～第10列的藍(lán)色孔中(見圖2),每孔接種細(xì)胞1.5×10?c/w每個藍(lán)色孔中加入含細(xì)胞的200μL完全培養(yǎng)基，細(xì)胞接種密度為每B.4.1.3接種好細(xì)胞的96孔板需在37℃、5%CO?的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。將240μL無菌水(雙蒸水)與23.76mL無血清培養(yǎng)基混合。得到的混合物(1)將用于制備下列不同a)40μL10mmol/mLCdSO?與3960μL的混合物(1b)2000μL100μmol/mLCdSO?與2000μL的混合物(1)混合=>50μmol/mLCdSO?;c)2000μL50μmol/mLCdSO?與2000μL的混d)2000μL25μmol/mLCdSO?與3000μL的混合物(1)混合=>10μmol/mLCdSO?;a)4μL10%PS-NH?與3996μL的(2)混合=>100μg/mLPS-NH?;f)培養(yǎng)基(2)被作為0(g/mLPS-NH?。B.4.3.1將裝有10%PS-NH?和溶劑的試管放到渦旋振蕩器渦旋。B.4.3.2得到的含納米顆粒的混合物在進(jìn)一步稀釋前或細(xì)胞前處理前也需渦旋混勻?！?×4pL10%PS-NH?與2×3996μL的(2)混合=>100μg/mLPS-NH?;B.4.4分別用對照藥品和納米顆粒處理A549細(xì)胞B.4.4.1去除第2列～第5列和第8列～第11列孔中的培養(yǎng)基上清液。B.4.4.2用PBS清洗：往第2列~第5列和第8列～第11列的每孔中加入200μLPBS,再吸出，重復(fù)3次。B.4.4.3第8列～第11列按圖B.3所示的培養(yǎng)板布局加入不同濃度的納米顆粒。B.4.4.4第2列～第5列按圖B.3所示的培養(yǎng)板布局加入不同濃度的對照藥品。B.4.4.5處理后的96孔板需在37℃、5%CO?的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。的移液器(200μL)按列給第8列～第11列和第2列～第5列加對應(yīng)藥品。a)2.5mLMTS試劑與12.5mL的RPMI-1640(無酚紅)混合。得到的混合物稱為(3).RPMI-對照范圍藥品對照組背景'(B2-G2孔)CdSO,對照組(ECs。值，B3-G5孔)移液器自身造成的差異(B6-G6孔)無細(xì)胞對照和無處理對照(B7-G7孔)納米顆粒背景(B11-G11孔)移液管之間的差異(B3-B5孔，B8-B10孔)化學(xué)試劑對照沒有引入額外背景。未給出相關(guān)數(shù)值，因為有一些實(shí)驗室觀測了背景信號而有些沒有觀測。X00◆實(shí)驗室1器實(shí)驗室2X實(shí)驗室4+PS-NP的劑量濃度(μg/mL)圖B.45個實(shí)驗室在含血清培養(yǎng)基中將A549細(xì)胞暴露于+PS-NP后得到的劑量-效應(yīng)曲線(資料性)案例：基于Raw264.7細(xì)胞系的MTS法C.1概述輪比對。該草案使用Raw264.7細(xì)胞系驗證細(xì)胞的生長率和活力，進(jìn)而評估帶正電的PS納米顆粒和C.2實(shí)驗步驟C.2.1基本步驟C.2.1.1概述Raw264.7細(xì)胞的健康和生長率按本文件中的8.4驗證。納米顆粒對Raw264.7細(xì)胞的毒性效應(yīng)按本文件中第9章和第10章進(jìn)行確定。C.檢測C..8磷酸鹽緩沖液(PBS)(不含Ca2+和Mg2+)。C..9無酚紅的DMEM。C..12帶正電的PS納米顆粒(直徑小于100nm)(陽性對照)[13]。C..13蒸餾水或任何適合細(xì)胞培養(yǎng)的純化水。見第6章。C.3準(zhǔn)備工作C.3.1概述C.3.2培養(yǎng)基—10%胎牛血清(FBS);——100μg/mL鏈霉素；——2.5pg/mL兩性霉素B。C.3.3細(xì)胞培養(yǎng)C.將培養(yǎng)基(含10%FBS)加入離心管中，并放在冰上，使其冷卻C.將吸出的細(xì)胞加入含有培養(yǎng)基的15mL離心管中。C.在15mL離心管中用培養(yǎng)基(含10%FBS)重懸細(xì)胞。C.7400g離心5min,再去除培養(yǎng)基。C.每2天～3天用培養(yǎng)基洗一次細(xì)胞并換液。75cm2的培養(yǎng)瓶用15mL培養(yǎng)基(含10%FBS)或25cm2的培養(yǎng)瓶加5mL培養(yǎng)基。C.在傳代前，細(xì)胞要在37℃、5%CO?的條件下生長2天～3天。Raw264.7細(xì)胞會貼壁生長到培養(yǎng)瓶上。將細(xì)胞按2×10?cells/mL的密度分散在無酚紅培養(yǎng)基中(含10%FBS)?！鲅芯啃〗M6■研究小組1■研究小組2■研究小組3GB/T41915—2022/ISO190070研究小組3沒有測量24h的細(xì)胞活力。大多數(shù)研究小組報道，24h和48h的細(xì)胞活力均在90%C.4.1帶正電的PS納米顆粒和二氧化鈰納米顆粒及Raw264.7細(xì)胞按第9章操作。C.4.2按第10章中的程序進(jìn)行細(xì)胞毒性分析。C.5納米顆粒暴露對Raw264.7細(xì)胞活力的影響和C.4所示。但Raw264.7細(xì)胞暴露于二氧化鈰納米顆粒(200nm)不引起細(xì)胞活力下降，而導(dǎo)致吸光細(xì)胞活力/%GB/T41915—2022/ISO19細(xì)胞活力/%一實(shí)驗室4一實(shí)驗室5一實(shí)驗室6實(shí)驗室7實(shí)驗室8“實(shí)驗室9實(shí)驗室10實(shí)驗室1一實(shí)驗室2→實(shí)驗室3暴露劑量(μg/mL)0圖C.4帶正電的PS納米顆粒作用Raw264.7細(xì)胞24h后的細(xì)胞活力10個研究小組均發(fā)現(xiàn)作用24h后隨著暴露劑量的增加細(xì)胞活力下降，但實(shí)驗數(shù)據(jù)的離散度很大。0暴露劑量(μg/mL)實(shí)驗室1實(shí)驗室2實(shí)驗室3一一實(shí)驗室4一實(shí)驗室6一實(shí)驗室7一實(shí)驗室8一實(shí)驗室9實(shí)驗室10圖C.5200nm的二氧化鈰納米顆粒作用Raw264.7細(xì)胞24h后的細(xì)胞活力10個實(shí)驗室均發(fā)現(xiàn)作用24h后隨著暴露劑量的增加細(xì)胞活力沒有下降，但實(shí)驗數(shù)據(jù)的離散度很大。[1]GB/T16886.5—2017醫(yī)療器械生物學(xué)評價第5部分：體外細(xì)胞毒性試驗[2]GB/T41309—2022納米技術(shù)納米材料的內(nèi)毒素體外測試鯊試劑法[3]ISO/TS19337Nanotechnologies—Characteristicsofworkingsuspen[4]XIAT.,HAMILTONR.F.JR,BONNERJ.C.,CRANDALLE.D.,ELDERLAHIF.InterlaboratoryEvaluationofinVitroCytotoxicityandInflammatoryResponsestoEngi-neeredNanomaterials:TheNIEHSNanoGoConsortium.Environ.HealthPerspect.2013,121pp.683—690[5]ELLIOTTJ.T.,R?SSLEINM.,SONGN.W.,TOMANB.,KINSNER-OVASKAINENA.,MANIRATANACHOTER.,SALITM.L.,PETERSENE.J.,SEQUEIRAF.,LEEJ.,KIMF.ROSSI,S.J.,HIRSCH,C.,KRUG,H.F.,SUCHAOIN,W.,ANDWICK,P.TowardAchievingHarmonizationinaNano-cytotoxicityAssayMeasurementthroughanInterlaboratoryComparisStudy.ALTEX.2016S[6]CORYA.H.,OWENT.C.,BARLTROPJ.A.,CORYJ.G.Useofanaqueourazolium/formazanassayforcellgrowthassaysinculture.CancerComm[7]MOSSMANT.Rapidcolorimetricassayproliferationandcytotoxicityassays.J.Immunol.Methods.1983,65pp.55—63[8]ROEHMN.W.,RODGERSG.H.,HATFIELDS.M.,GLASEBRcolorimetricassayforcellproliferationandviabilmunological.Methods.1991,142pp.257—265[9]CHOKSAKULNIMITRS.,MASUDAM.Invitrocytotoxicityofmacromoleculesindifferentcellculturesystems.J.Control.Rele[10]STROBERW.TrypanBlueExclusionTestofCellViability.CurrentProtocnology.A.3B.1—A.3B.2.(2001):Altman,S.A.,Randers,L.andRao,G.ComparisonoftrypanbluedyeexclusionandfluorometBiotechnol.Prog.1993,9pp.671—674turesforcytotoxicityassays(HTD/NR-90).J.TissueCult.Methods.1985,9pp.7—9[12]XIAT.,KOVOCHICHM.,LIONGM.,M?DLERsonoftheMechanismofToxicityofZincOxideandCeriumOxideNanoparticlesBasedonDissolutionandOxidativeStressProperties.ACSNano.2008,10pp.2121—2134[13]XIAT.,KOVOCHICHM.,LIONGM.,ZINKJ.I,NELnanospheretoxicitydependsoncelspecificendocyticandmitochondriNano.2008,2pp.85—96[14]GUADAGNINIR,HALAMODAKENZAOUIB,WALKERL,PLENOVAZ,BILANICOVAD,SAUNDERSM,JUILLERAT-JEANNERETL,MARCOMIBOLM,MARANOF,BOLANDS.Toxicityfnanomaterials:challengesduetointerfeonGoodCellCulturePractice,ATLA,33,pp.261—287,2005;Freshney,R.I.(1AnimalCells,AManualofBasicTechnique,3rded.,NewYork:Wiley-Liss[16]VALLEEB.L.,&ULMERD.D.BiochemicaleffectsofMercury,Cadmium,aLead.AnnualReviewsofBiochemistry,41,pp.91—128,1972;Stohs,S.J..Bagchi,D.,Hassoun,E.andBagchi,M.OxidativeMechanismsintheToxicityofChromiumandCadmiumIons.JournalofEnvironmentalPathology,ToxicologyandOncology,20,Issue212pages,2001[17]XIAT.,KOVOCHICHM.,BRANTparisonoftheabilitiesofambientandmanufacturednanoparticlestoanoxidativestress