重組人胰島素的研究歷史與生產(chǎn)工藝

關(guān)于重組人胰島素的研究歷史與生產(chǎn)工藝胰島素是由胰島β細(xì)胞受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)刺激而分泌的一種蛋白質(zhì)激素。胰島素是機(jī)體內(nèi)唯一降低血糖的激素，同時(shí)促進(jìn)糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成。外源性胰島素主要用來糖尿病治療。作用機(jī)理屬于受體酪氨酸激酶機(jī)制。一、胰島素簡介第2頁,共18頁，星期六，2024年，5月第3頁,共18頁，星期六，2024年，5月3DStructureofInsulin胰島素二聚體（dimer）胰島素六聚體（hexamer

）第4頁,共18頁，星期六，2024年，5月二、胰島素的研究歷史

1921年----由加拿大人F.G.班廷和C.H.貝斯特從動物胰腺中提取出胰島素，開創(chuàng)了人類胰島素治療的歷史。

1926年----重結(jié)晶胰島素

1930s----傳統(tǒng)中、長效動物胰島素

1970s----單峰胰島素和單組分胰島素

70年代末----半合成胰島素

1982年----采用基因重組技術(shù)生產(chǎn)的人胰島素正式上市。90年代至今----重組人胰島素類似物成功研發(fā)上市，包括超短效和長效人胰島素類似物。第5頁,共18頁，星期六，2024年，5月

胰島素的發(fā)展史1920193019401950196019701980199020001923動物胰島素1973單組分胰島素1987人胰島素1996胰島素類似物1946NPH胰島素1953長效胰島素到1987第一支人胰島素問世，并于同年應(yīng)用于人，因?yàn)榕c人的天然胰島素氨基酸序列完全相同，所以抗原性大大降低。從動物胰島素到人胰島素是胰島素歷史的極大進(jìn)步，之后動物胰島素時(shí)代終結(jié)。第6頁,共18頁，星期六，2024年，5月美國的禮來公司已經(jīng)獲準(zhǔn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)胰島素諾和諾德制造的胰島素開始在市場上大量銷售法國賽諾菲安萬特全球第一個(gè)生產(chǎn)甘精胰島素類似物的企業(yè)通化東寶中國最大的重組人胰島素生產(chǎn)廠家此外，還有甘李藥業(yè)、江蘇萬邦、聯(lián)邦制藥等胰島素的生產(chǎn)第7頁,共18頁，星期六，2024年，5月三、胰島素制備工藝

以動物胰臟為原料提取胰島素

----酸醇提取法

※傳統(tǒng)胰島素---豬、牛胰臟提取，只經(jīng)一步重結(jié)晶

※單峰胰島素----凝膠過濾純化

※單組分胰島素---凝膠過濾、離子交換純化從豬和牛的胰腺中提取，兩者藥效相同，但與人胰島素相比，豬胰島素中有1個(gè)氨基酸不同，牛胰島素中有3個(gè)氨基酸不同，因而易產(chǎn)生抗體

半合成胰島素----將豬胰島素第30位丙氨酸，置換成與人胰島素相同的蘇氨酸，即為半合成人胰島素

重組DNA技術(shù)生產(chǎn)人胰島素

※AB鏈合成：分別表達(dá)AB鏈，化學(xué)方法連接

※逆轉(zhuǎn)錄法：表達(dá)胰島素原，酶切得到重組人胰島素（廣泛）第8頁,共18頁，星期六，2024年，5月通過基因工程酵母菌E．coli發(fā)酵生產(chǎn)hPI，經(jīng)后加工形成hI。四、重組人工胰島素第9頁,共18頁，星期六，2024年，5月提取目的基因4.1菌種制備提取質(zhì)?；蛑亟M將質(zhì)粒送回大腸桿菌

胰島素的產(chǎn)生

第10頁,共18頁，星期六，2024年，5月重組人工胰島素的工業(yè)生產(chǎn)制備和深加工技術(shù)在如今已經(jīng)是爐火純青。有近百年的發(fā)酵工程為基礎(chǔ)，結(jié)合現(xiàn)在的基因工程技術(shù)的產(chǎn)物，在菌種制備后的發(fā)酵培養(yǎng)過程更是可靠和安全的。發(fā)酵培養(yǎng)流程見下圖表：4.2胰島素的產(chǎn)生和精制（即菌種的發(fā)酵培養(yǎng)）第11頁,共18頁，星期六，2024年，5月菌種擴(kuò)培種子罐培養(yǎng)發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵液固液分離P1純化P1沉淀、干燥P2純化P2沉淀、干燥脫帽成品粗純化成品精純化過濾凍干發(fā)酵培養(yǎng)流程第12頁,共18頁，星期六，2024年，5月菌種擴(kuò)陪：菌種庫中取出菌種進(jìn)行活化及初步擴(kuò)大培養(yǎng)種子罐培養(yǎng)：在種子罐中進(jìn)一步的擴(kuò)大培養(yǎng)，至菌種到對數(shù)生長期時(shí)轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵罐培養(yǎng)：分兩階段進(jìn)行控制，第一階段主要通過控制溶氧和補(bǔ)加甘油使菌體達(dá)到富集的目的，第二階段通過補(bǔ)加甲醇使菌體進(jìn)行高密度表達(dá)目的產(chǎn)物，HPLC檢測目的產(chǎn)物含量具體步驟第13頁,共18頁，星期六，2024年，5月發(fā)酵液固液分離：目的產(chǎn)物存在于發(fā)酵液上清液中，此步驟主要控制目的產(chǎn)物回收率P1純化：通過兩步柱層析，主要試劑為乙醇與異丙醇，分別去除發(fā)酵上清液中的色素和雜蛋白，利用紫外檢測儀控制目的產(chǎn)物回收率P1沉淀、干燥：調(diào)節(jié)PH值，使P1沉淀，再經(jīng)離心干燥，得中間體I固體控溫進(jìn)行轉(zhuǎn)肽反應(yīng)，主要試劑為DMSO與1,4-丁二醇P2純化：再通過柱層析進(jìn)行提純，主要試劑為異丙醇P2沉淀、干燥：調(diào)節(jié)PH值，使P2沉淀，再經(jīng)離心干燥，得中間體II固體具體步驟第14頁,共18頁，星期六，2024年，5月脫帽：通過控制濕度與溫度進(jìn)行脫帽反應(yīng)，得到終產(chǎn)物胰島素主要試劑為丙酮，產(chǎn)品為半固體成品粗純化：經(jīng)過兩步柱層析對胰島素進(jìn)行提純，試劑為Tris-HCl和異丙醇通過超濾對提純后的胰島素進(jìn)行濃縮，通過管道傳遞到下工序成品精純化：通過制備色譜對胰島素粗品進(jìn)行精制，主要試劑為色譜乙腈然后經(jīng)兩步結(jié)晶后通過管道過濾除菌到百級區(qū)過濾凍干：對胰島素成品進(jìn)行一次結(jié)晶和水洗對水洗后的胰島素進(jìn)行過濾除菌后凍干，即得胰島素成品具體步驟第15頁,共18頁，星期六，2024年，5月這種重組人工胰島素的檢測重點(diǎn)應(yīng)該是①測定生物活性②效價(jià)測定③控制產(chǎn)品中雜質(zhì)潛在有害物質(zhì)④保證產(chǎn)品安全性和有效性4.3藥物檢測第16頁,共18頁，星期六，2024年，5月胰島素在糖尿病治療中具有無可替代的作用和地位，但因注射給藥讓許多患者產(chǎn)生畏懼心理，使其作用發(fā)揮受到限制。研究方向：1.新的給藥方式，例如:口服、吸