內(nèi)毒素光度測定法檢查技術

光度測定法BET檢查技術湛江安度斯生物有限公司2009年3月1、光度測定法方法學分類2、光度測定法原理3、動態(tài)比濁法BET4、終點比色法BET2024/7/16Page2Http://1、光度測定法方法學分類2024/7/16Http://Page3光度測定法（定量法檢測）濁度法顯色法動態(tài)濁度法終點濁度法動態(tài)顯色法終點顯色法(比濁法)(比色法)2、光度測定法原理光電轉換原理光度測定法是利用鱟試劑與內(nèi)毒素的混合物在反應過程的透光度變化與內(nèi)毒素濃度的關系來定量檢測內(nèi)毒素的一種方法。當一束光線進入如下光電轉換裝置時，該裝置將產(chǎn)生電流I，我們稱I為透光強度。2024/7/16Http://Page4入射光反應混合物透射光光電池I透光容器設：初始時的透光強度為Is，某時刻的透光強度為It

定義1：透光度（Rt）：

Rt=It/Is(%)

初始時It=Is，Rt=100%，Rt曲線變化趨勢是由高至低。定義2：吸光度(OD)：

OD=-lg(It/Is)

初始時It=Is，OD=0，OD曲線變化趨勢是由低至升高。選擇不同的參數(shù)(Rt或OD)將得到不同變化趨勢的動態(tài)曲線。2024/7/16Http://Page5T(分)IsItIeITAL與內(nèi)毒素反應的動態(tài)曲線(Rt-T曲線)以透光度（Rt）為縱座標，時間（T）為橫座標，把TAL與內(nèi)毒素反應引起反應混合液透光度的變化連續(xù)地描繪在座標系中，便得到該反應的動態(tài)曲線如圖：2024/7/16Http://Page6Rt（%）T（分）動態(tài)曲線100孕育期反應期結束TAL與內(nèi)毒素反應的動態(tài)曲線(OD-T曲線)以吸光度（OD）為縱座標，時間（T）為橫座標，把TAL與內(nèi)毒素反應引起反應混合液吸光度的變化連續(xù)地描繪在座標系中，便得到該反應的動態(tài)曲線如圖：2024/7/16Http://Page7ODT（分）動態(tài)曲線0孕育期反應期結束動態(tài)曲線的特點把標準內(nèi)毒素制備成三個濃度C1、C2、C3（C1>C2>C3），分別與TAL反應，描繪出反應的動態(tài)曲線如下圖：2024/7/16Http://Page8C3Rt（%）T（分）C2C1分析動態(tài)曲線可看出：內(nèi)毒素濃度越高，孕育期越短；內(nèi)毒素濃度越高，反應期曲線越陡；內(nèi)毒素濃度越高，進入結束期越快。光度測定法BET試驗的相關變量2024/7/16Http://Page9C3100Rt（%）T（分）C2C1相關變量：

內(nèi)毒素濃度(C)

透光度(Rt或OD)

反應時間(T)1）動態(tài)法原理固定透光度(Rt)，建立內(nèi)毒素濃度與反應時間關系的標準曲線（C-T曲線），用供試品的反應時間比對標準曲線，得出供試品的內(nèi)毒素濃度。這里的反應時間是指反應混合液的透光度到達預設透光度值（Rt）的時間。2024/7/16Http://Page10回歸分析Rt%預設透光度值R0T1T2T392100T(分)C1C2C3LgT=b-kLgCLgTT3T2T1C3C2C1LgC（1）建立標準曲線（2）測定樣品內(nèi)毒素濃度（Cs）用鱟試劑與未知內(nèi)毒素含量的供試品(S)反應，得到反應時間Ts，比對C-T關系的標準曲線，可得出供試品的內(nèi)毒素含量Cs。2024/7/16Http://Page11比對標準曲線TsT(分)Rt(%)R0CsLgT=b-kLgCLgCCsTsLgT922）終點法原理固定反應時間（T），建立內(nèi)毒素濃度與透光度關系的標準曲線（C-Rt曲線），用供試品的透光度比對標準曲線，得出供試品的內(nèi)毒素濃度。2024/7/16Http://Page12Rt(%)T(分)C1C2C3100R1R2R3預設反應終止時間T0RtR3R2R1C3C2C1Rt=b-K·C回歸分析（1）建立標準曲線（2）測定樣品內(nèi)毒素濃度（Cx）用鱟試劑與未知內(nèi)毒素含量的供試品（X）反應，得到透光度值Rx，比對C-Rt關系的標準曲線，可得出供試品的內(nèi)毒素含量Cx。2024/7/16Http://Page13CxToT(分)Rx100Rt(%)Rt(%)Rt=b-K·CRxCx比對標準曲線3、動態(tài)比濁法試驗儀器及器具動態(tài)微孔平板儀或試管儀BET軟件微孔平板、反應試管等2024/7/16Http://Page142024/7/16Http://Page15英國LabKinetics公司ATi動態(tài)試管儀,96孔湛江安度斯公司開發(fā)的BET專用軟件“生物探針-2002”

2024/7/16Http://Page16美國CharlesRiverEndosafe便攜式檢測系統(tǒng)（PTS）美國BioTek公司超級酶標儀，ELx808IU,使用96孔微孔板LKM細菌內(nèi)毒素動態(tài)試管儀制造商：英國萊伯金耐特公司（LabKineticsLtd.）世界上第一臺動態(tài)試管儀的生產(chǎn)商目前世界上銷量最大的動態(tài)試管儀已經(jīng)取得醫(yī)療器械許可證完善的售后服務2024/7/16Http://Page17儀器特點：

1、體積小巧，占用空間??；2、恒溫性能、光學性能精密，各孔溫度均在37±0.2℃，這是國內(nèi)同類儀器無法達到的。3、配有專業(yè)的、操作簡單的軟件系統(tǒng)。ELx808IU型動態(tài)酶標儀制造商：美國伯騰公司（BioTek）功能強大的細菌內(nèi)毒素檢測儀器豐富的面板操作及數(shù)據(jù)分析，無需電腦可獨立操作可使用多個波長同時分析2024/7/16Http://Page18動態(tài)比濁法試驗程序1、器具的準備2、驗證試驗標準曲線的可靠性試驗干擾試驗3、檢查法2024/7/16Http://Page191）試驗器具的準備器具分類器具名稱反應試管玻璃試管（外徑8×75mm或10×75mm）稀釋容器大口徑玻璃試管移液器具刻度吸管及洗耳球，或移液器及無熱原吸頭等其他試管架、酒精燈、異丙醇浸泡的無紡布、鑷子、剪刀、砂輪、封口膜或醫(yī)用膠布、標記紙等2024/7/16Http://Page20凡是與供試品或反應試劑接觸的器具，必須經(jīng)除熱原處理。通常玻璃器具需經(jīng)250℃、60分鐘的干烤處理2）標準曲線的可靠性試驗試驗目的驗證實驗室的條件是否滿足BET試驗的要求驗證實驗人員的實驗技能是否滿足BET試驗的要求驗證實驗所用試劑（包括鱟試劑、內(nèi)毒素標準品、BET水等）是否滿足BET試驗要求2024/7/16Http://Page211、試劑2024/7/16Http://Page22試劑名稱廠家裝量規(guī)格動態(tài)濁度法TAL安度斯1.25ml/支10EU/ml~0.03EU/ml內(nèi)毒素標準品（CSE）安度斯10ng/支10EU/ng（CoA）BET水（W）安度斯25ml/瓶內(nèi)毒素<0.003EU/ml2、反應項目將標準內(nèi)毒素制備成至少3個濃度的稀釋液，相鄰濃度間稀釋倍數(shù)不得大于10，最低濃度不得低于所用鱟試劑的標示檢測限實驗前，先預熱動態(tài)儀，使其達到反應溫度2024/7/16Http://Page23項目平行管陰性對照溶液(D)OOOOOOOOOOO內(nèi)毒素標準溶液（C）(EU/mL)0.030.252.03、溶液C的制備2024/7/16Http://Page24E1003.6mlWE100.4ml3.2mlWE20.8ml2.8mlWE0.250.4ml2.8mlWE0.030.4ml30s0.4ml30s0.4ml30s0.8ml30s0.4mlBET水1.0ml2.8ml2.8ml3.6ml3.2mlCSE混合5分鐘E10E2E0.25E0.03CSE/E1004、鱟試劑的準備①取TAL1支，用砂輪在安瓿頸劃痕，擦拭后從安瓿頸處折斷（避免玻璃屑落入安瓿內(nèi)）；

②用刻度吸管或移液器準確吸取BET水1.25ml沿瓶壁加入安瓿內(nèi)，輕輕搖勻，使內(nèi)容物全部溶解（避免產(chǎn)生氣泡）；2024/7/16Http://Page25③取反應試管11支，按2.0EU/ml、0.25EU/ml、0.03EU/ml各濃度平行3管，NC平行2管標記；

5、軟件系統(tǒng)的設置進入動態(tài)儀系統(tǒng)軟件，根據(jù)試驗要求，設置相關參數(shù)，如反應時間、預設透光度值等。填寫相關的實驗參數(shù)，使軟件進入待采集狀態(tài)2024/7/16Page26Http://6、加樣反應先將復溶好的鱟試劑分裝至各反應試管中，0.1ml/管；分別將反應溶液加入各相應反應管中，一般按照從低濃度到高濃度的順序加樣，首先加陰性對照溶液；加樣完成后，將每支反應管內(nèi)的混合液輕輕混勻后，插入動態(tài)儀中反應TAL2.0EU/ml0.1ml0.1ml0.1ml0.25EU/mlCSE0.1ml0.03EU/ml0.1mlNCBET水0.1ml0.1ml0.1ml加樣順序從低濃度到高濃度2024/7/16Page27Http://在動態(tài)儀中插入反應試管后，開始數(shù)據(jù)采集。

2024/7/16Page28Http://7、結果判斷藥典要求1、陰性對照的反應時間應大于標準曲線最低濃度的反應時間2、標準曲線的相關系數(shù)|r|≥0.980廠家建議值3、變異系數(shù)CV%<10%關于相關系數(shù)當對一組數(shù)據(jù)作線性回歸分析時，以相關系數(shù)r表示其標準曲線的線性狀況，即該組數(shù)據(jù)的相關狀況。當r值為正時，表示該組數(shù)據(jù)呈正相關關系；r值為負時，該組數(shù)據(jù)為負相關關系。當r值的絕對值|r|=1時，其標準曲線的線性最好。2024/7/16Page29Http://2024/7/16Http://Page30試驗完成后進行數(shù)據(jù)分析2024/7/16Page31Http://試驗完成后進行數(shù)據(jù)分析2024/7/16Page32Http://試驗完成后進行數(shù)據(jù)分析E0.3125E0.25E23）干擾初篩試驗目的及原理只有在無干擾情況下，樣品的內(nèi)毒素檢測結果才是有效的。通過檢測從供試品原液到其MVD或MVC之間的稀釋液，計算內(nèi)毒素回收率，判斷供試品濃度對BET的干擾情況。2024/7/16Page33Http://試驗步驟1、供試品限值的確定2、試劑的選擇3、供試品最大有效稀釋的計算4、反應溶液的制備5、加樣及反應6、結果判斷2024/7/16Page34Http://干擾初篩試驗舉例供試品限值硫酸慶大霉素，100ml/瓶，5000U/ml；藥典要求，硫酸慶大霉素限值L=0.5EU/1000U2024/7/16Page35Http://試劑本試驗使用鱟試劑的檢測范圍為10~0.03EU/ml，選擇標準曲線濃度為2、0.25、0.03EU/ml2024/7/16Page36Http://試劑名稱廠家裝量規(guī)格動態(tài)濁度法TAL安度斯1.25ml/支10~0.03EU/ml內(nèi)毒素標準品（CSE）安度斯10ng/支10EU/ng（CoA）BET水（W）安度斯25ml/瓶內(nèi)毒素<0.003EU/ml最大有效稀釋倍數(shù)的計算光度測定法中，供試品最大有效稀釋倍數(shù)計算公式： MVD=cL/λ，其中λ為標準曲線最低點濃度本試驗，2024/7/16Page37Http://MVD=5000U/mlx0.5EU/1000U0.03EU/ml=80（倍）各反應溶液的制備溶液C的制備E1000.4ml3.6mlWE100.8ml3.2mlWE20.4ml2.8mlWE0.25S原液0.4ml3.6mlWS101.4ml1.4mlWS201.4ml1.4mlWS401.4ml1.4mlWS80備用液0.4ml2.8mlWE0.03溶液A的制備E0.50.8ml2.4mlW備用液2024/7/16Page38Http://溶液B的制備E0.5S100.5ml0.5mlS20E0.25E0.5S400.5ml0.5mlS80E0.25E0.5S200.5ml0.5mlS40E0.252024/7/16Page39Http://加樣及反應取TAL兩支，參照標準曲線可靠性試驗中的方法將其復溶；復溶鱟試劑后，運行軟件，使其進入待采集狀態(tài)；將兩支復溶好的鱟試劑溶液合并在一起，輕輕混勻避免產(chǎn)生氣泡；將鱟試劑液分裝至20支反應試管中，0.1ml/管；將相應的溶液A、B、C、D加至反應管中，0.1mL/管，每濃度平行2管E0.03E0.25E2溶液C溶液DWS20S40S80S20E0.25S40E0.25S80E0.25溶液A溶液A溶液A溶液B溶液B溶液B2024/7/16Page40Http://結果判斷藥典要求1、陰性對照的反應時間（TD）大于標準曲線最低濃度的反應時間（Tλ）2、標準曲線的相關系數(shù)|r|≥0.9803、回收率R滿足：50%≤R≤200%廠家建議值4、變異系數(shù)CV%<10%2024/7/16Page41Http://回收率的計算光度測定法試驗中，在供試品檢查濃度的溶液中,添加標準曲線中點或靠近中點的內(nèi)毒素濃度,根據(jù)回收的內(nèi)毒素濃度與添加的內(nèi)毒素濃度的比值(回收率R)，判斷供試品溶液對試驗的干擾程度。R的計算公式如下：2024/7/16Http://Page42Ct：試驗測出的供試品溶液的內(nèi)毒素含量Cs

：試驗測出的加入

m標準內(nèi)毒素的供試品溶液的內(nèi)毒素含量

m：標準曲線的中點或靠近中點的已知濃度內(nèi)毒素光度測定法規(guī)定：當R在50~200%之間時，認為在此試驗條件下該供試品溶液對試驗無干擾。Cs-Ct

mR=本試驗結果2024/7/16Page43Http://相關系數(shù)絕對值|r|=0.9949>0.980TD（>3600s）>Tλ20倍回收率40倍回收率80倍回收率試驗有效試驗有效有干擾有干擾無干擾4）干擾試驗根據(jù)干擾初篩試驗結果，確定選擇供試品的無干擾濃度選擇3批供試品進行干擾驗證試驗溶液的制備方法與干擾初篩試驗相同2024/7/16Page44Http://有干擾不理想無干擾溶液的制備A為稀釋倍數(shù)不超過MVD的供試品溶液

B為加入

m內(nèi)毒素且與A溶液有相同稀釋倍數(shù)的供試品溶液

C為用于制備標準曲線的內(nèi)毒素標準溶液

D為陰性對照編號內(nèi)毒素濃度配制內(nèi)毒素的溶液平行管數(shù)A無供試品溶液不少于2個B標準曲線的中點（或附近點）的濃度（設為λm）供試品溶液不少于2個C至少3個濃度（最低點設定為λ）檢查用水每一濃度不少于2個D無檢查用水不少于2個2024/7/16Page45Http://反應項目設置3批樣品都在同一濃度做干擾驗證試驗每濃度平行2管溶液編號項目平行管D陰性對照OOC內(nèi)毒素標準(EU/mL)E0.031OOE0.25OOE2OOA1S80OOB1S80E0.25OOA2S80OOB2S80E0.25OOA3S80OOB3S80E0.25OO2024/7/16Page46Http://接受標準藥典要求1、陰性對照的反應時間（TD）大于標準曲線最低濃度的反應時間（Tλ）2、標準曲線的相關系數(shù)|r|≥0.9803、各批樣品的回收率R滿足：50%≤R≤200%廠家建議值4、變異系數(shù)CV%<10%2024/7/16Page47Http://5）檢查法（日常檢查）根據(jù)干擾試驗結果，選擇無干擾的供試品濃度進行BET日常檢查各反應溶液的制備及反應項目設置與干擾試驗相同2024/7/16Page48Http://溶液編號項目平行管D陰性對照OOC內(nèi)毒素標準(EU/mL)E0.031OOE0.25OOE2OOAS80OOBS80E0.25OO結果判斷藥典要求1、陰性對照的反應時間(TD)大于標準曲線最低濃度的反應時間(Tλ)2、標準曲線的相關系數(shù)|r|≥0.9803、各批樣品的回收率R滿足：50%≤R≤200%廠家建議值4、變異系數(shù)CV%<10%若供試品溶液A所有平行管的內(nèi)毒素濃度平均值乘以稀釋倍數(shù)后，小于規(guī)定的內(nèi)毒素限值，判供試品符合規(guī)定，否則判供試品不符合規(guī)定無復測要求2024/7/16Page49Http://4、終點比色法BET原理當鱟試驗的顯色反應到達預設的反應終止時間（T0)時，反應混合液的吸光度值（OD）與內(nèi)毒素濃度（C）成正比，利用標準內(nèi)毒素建立OD-C的標準曲線，利用標準曲線定量測定供試品的內(nèi)毒素含量。儀器分光光度計酶標儀37℃恒溫儀2024/7/16Page50Http://試驗程序1.試驗準備：儀器及用具等2.確定藥品的細菌內(nèi)毒素限值（L）3.選擇終點比色法試劑盒終點比色法鱟試劑顯色基質(zhì)（底物）工作標準內(nèi)毒素（CSE）4.計算供試品的最大有效稀釋（MVD）或最低有效濃度（MVC）5.標準曲線的可靠性試驗6.干擾試驗（驗證）7.檢查法（日常檢查）2024/7/16Page51Http://終點比色法日常檢查舉例試劑及器具終點比色法試劑盒終點比色法試劑

顯色基質(zhì)（底物）

工作標準內(nèi)毒素（CSE