無病毒植物的培養(yǎng)

教學(xué)目標和要求

(1）了解植物病毒危害和培養(yǎng)無病毒植物意義。（2）了解和掌握脫除植物病毒原理及方法。（3）了解分離莖尖培養(yǎng)情況。（4）普通掌握無毒苗木判定方法。（5）普通掌握脫毒苗木保留和利用方法。無病毒植物的培養(yǎng)第1頁

第一節(jié)植物病毒危害和培養(yǎng)無病毒植物意義

病毒之所以致病不是因為消耗細胞養(yǎng)分或經(jīng)過毒素殺死細胞，而是利用細胞內(nèi)物質(zhì)占領(lǐng)空間，干擾細胞代謝過程，促使細胞產(chǎn)生一些對細胞或生物生命和正常功效有害異常物質(zhì)和條件，這使得植物病毒病防治較其它植物病害防治更為困難，常給生產(chǎn)帶來災(zāi)難損失，被稱為“植物癌癥”。無病毒植物的培養(yǎng)第2頁一、植物病毒危害植物病毒已超出600種，嚴重危害著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。在果樹、蔬菜、花卉、林木以及農(nóng)作物上皆有發(fā)覺。伴隨生產(chǎn)栽培時間推移，危害越來越嚴重，發(fā)覺病毒種類也越來越多。無病毒植物的培養(yǎng)第3頁病毒調(diào)查無病毒植物的培養(yǎng)第4頁無病毒植物的培養(yǎng)第5頁危害園藝植物病毒數(shù)目無病毒植物的培養(yǎng)第6頁如侵染菊花病毒和類病毒有19種之多如無子病毒(CAV)潛隱病毒(CLV)B病毒(CVB)輕斑駁病毒(CMMV)矮化病毒(CSV)脈斑駁病毒(CVMV)退綠斑駁類病毒(CCMV)等無病毒植物的培養(yǎng)第7頁4種對草莓生產(chǎn)造成重大影響:

斑駁病毒（SMoV）草莓黃邊病毒（SMYEV）草莓鑲脈病毒（SVBV）草莓皺縮病毒（SCrV）、無病毒植物的培養(yǎng)第8頁甘薯根腐病.甘薯葉點病甘薯枯萎病甘薯黑痣病無病毒植物的培養(yǎng)第9頁2.病毒特征及其侵染

多植物病毒不經(jīng)種子傳輸，多數(shù)以種子繁殖后代植物，能夠從輕度罹病植株上采集種子，播種繁殖，不會將病毒傳至下一代。（?；詮姴《境?，如豆類病毒——由一個?；詮娧料x傳輸)可伴隨種子傳輸。）對于有性生殖退化，僅能用無性繁殖方法繁殖植物，一旦罹病則毫無方法。母株一旦染病，病毒在其細胞內(nèi)增殖，并經(jīng)過插條、接穗、種薯、球根、鱗片傳至下一代。經(jīng)過昆蟲作為媒介加速傳輸。無病毒植物的培養(yǎng)第10頁３.植株脫病毒意義植物組織培養(yǎng)脫病毒技術(shù)是植物細胞工程主要組成部分，脫毒種苗生產(chǎn)在提升作物質(zhì)量和產(chǎn)量方面已顯示出極大潛力，良種、新品種脫毒組培苗大面積推廣和應(yīng)用，有效地處理了因病毒引發(fā)品種退化問題。所以，植物組培脫毒技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)科學(xué)化、當代化中含有巨大應(yīng)用價值和經(jīng)濟效益，還可降低農(nóng)藥施用，改進生態(tài)環(huán)境條件，預(yù)防病害蔓延與擴散，該方法已成為農(nóng)業(yè)中應(yīng)用最廣泛生物技術(shù)。無病毒植物的培養(yǎng)第11頁甘薯脫毒苗無病毒植物的培養(yǎng)第12頁脫毒區(qū)無病毒植物的培養(yǎng)第13頁

第二節(jié)脫除植物病毒原理及方法

一、物理學(xué)方法：

X射線紫外線超短波高溫

都能使病素鈍化，其中以熱處理最慣用。無病毒植物的培養(yǎng)第14頁1.熱處理脫除植物病毒原理①病毒是DNA大分子，病毒進入植物細胞后；隨植物細胞DNA一起復(fù)制。熱處理并不能殺死病毒，只能鈍化病毒活性，使病毒在植物體內(nèi)增殖減緩或增殖停頓，而失去侵染能力。②熱處理是一個物理效應(yīng)，與冷處理一樣，它能夠加速植物細胞分裂，使植物細胞在與病毒繁殖競爭中取勝。無病毒植物的培養(yǎng)第15頁（1）溫湯浸漬處理法：將剪下接穗或種植材料，在50℃左右溫水中，浸漬3-15分鐘至數(shù)小時。（2）熱風處理法：讓盆載植物在35-40℃高溫下生長發(fā)育，熱處理空氣溫度應(yīng)逐步升高，然后到達所需溫度，同時必須保持一定濕度和光照，以后可切取處理后新長出枝條作接穗和砧木，或?qū)崽幚砼c組織培養(yǎng)結(jié)合效果更加好。熱處理脫毒無病毒植物的培養(yǎng)第16頁2、愈傷組織熱處理脫毒法

方法：從患病植株上取葉片(莖片、鱗片、花器亦可)進行離體培養(yǎng)，誘導(dǎo)形成愈傷組織，然后將愈傷組織重復(fù)繼代培養(yǎng)同時兼用熱處理。

慣用處理溫度及處理時間：溫度：37-38℃時間：處理2周、4周或8周溫度：50℃時間：3-15min。重復(fù)繼代兼熱處理，經(jīng)歷一定時間(繼代次數(shù)需試驗)后，將熱處理過愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)器官分化。無病毒植物的培養(yǎng)第17頁果樹作物：桃(無黃萎病)、蘋果(花葉病)、葡萄(扇葉病毒)、甜橙、香蕉、李子、醋栗、梨、樹莓、紅莓苔子、草莓等。蔬菜作物：馬鈴薯、番茄、菠菜?；ɑ苤参铮郝L春花、康乃馨、菊花等。其它植物：曼陀羅等。無病毒植物的培養(yǎng)第18頁

例：煙草愈傷組織兼熱處理鈍化煙草花葉病毒(TMV)和黃瓜花葉病毒(CMV)取得無病毒株效果做法：

A：從患病煙草植株上取5mm葉片培養(yǎng)，在MS附加IAA2+KT0.2培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織。B：將其中一部分愈傷組織重復(fù)繼代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)中分別兼用25℃、30℃和37℃溫度熱處理8周。C：將熱處理后愈傷組織，轉(zhuǎn)到MS附加IAA2+KT2分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)芽分化。D：將1cm長芽轉(zhuǎn)移到MS附加IAA2+KT0.02生根培養(yǎng)基，誘導(dǎo)根分化。E：完整植株取得后，移植到無毒土壤栽培并進行判定。結(jié)果表明：重復(fù)繼代培養(yǎng)可取得無病毒株。無病毒植物的培養(yǎng)第19頁3.低溫處理脫出病毒菊花植株----5℃,4-7.5個月處理后進行莖尖培養(yǎng),能夠除去矮化病毒(CSV)和褪綠班駁病毒(CCMV),而單獨莖尖培養(yǎng)無此效果。無病毒植物的培養(yǎng)第20頁

二、化學(xué)方法

使用農(nóng)藥是防治植物真細菌病害主要方法，理論上講，也應(yīng)該是防治病毒有效路徑。有不少化學(xué)物質(zhì)能抑制病毒復(fù)制，比如孔雀綠、硫尿嘧啶、8-氮鳥嘌呤、以及一些病毒抑制劑。如Viraz01e(病毒唑)和一些蛋白質(zhì)、核酸合成抑制劑等。因為病毒復(fù)制和寄主代謝過程關(guān)系非常親密，所以，要找出既干擾病毒復(fù)制，又不影響寄主細胞正常代謝藥劑十分困難。無病毒植物的培養(yǎng)第21頁利用這些化合物處理整株植物去病毒效果雖不理想，但培養(yǎng)離體組織、細胞和原生質(zhì)體等卻可能有良好效果。如在培養(yǎng)基中加入2—硫尿嘧啶能夠除去煙草愈傷組織中PVY病毒，加入放線菌素D能夠抑制原生質(zhì)體中病毒復(fù)制等。

無病毒植物的培養(yǎng)第22頁鈍化、抑制和去除植物病毒一些化合物無病毒植物的培養(yǎng)第23頁

三、生物學(xué)方法

1.莖尖培養(yǎng)脫毒（1）莖尖培養(yǎng)脫毒理論基礎(chǔ)a、病毒在植物體內(nèi)轉(zhuǎn)移是經(jīng)過維營束系統(tǒng)完成，在分生組織區(qū)域內(nèi)沒有維管束組織，病毒只能經(jīng)過胞間連絲傳遞趕不上細胞不停分裂和活躍生長速度；b、在分裂旺盛分生組織內(nèi)，病毒復(fù)制受到旺盛代謝活動限制；c、在植物分生區(qū)域內(nèi)，“病毒鈍化體系”活性較其它部位活性高；d、莖尖分生組織內(nèi)高濃度植物內(nèi)源激素可能會抑制病毒增殖。無病毒植物的培養(yǎng)第24頁（2）莖尖培養(yǎng)脫毒苗方法在解剖鏡下剝?nèi)∏o尖?？紤]到脫毒效果及提升成活率，普通切取0.2—0.5mm莖尖為組織材料進行培養(yǎng)，不一樣植物莖尖對外源激素反應(yīng)不一樣。莖尖大小:過大時接種易成活，但脫毒效果差，過小時難成活，但脫毒效果好。普通以帶有1-2片葉原基為好，大小為0.2-0.3mm為宜，超出0.5mm時，脫毒效果差。培養(yǎng)基:只要能使莖尖快速生長，分化快培養(yǎng)基均適于脫毒。普通以MS很好，添加一定百分比細胞分裂素就行。無病毒植物的培養(yǎng)第25頁馬鈴薯芽無病毒植物的培養(yǎng)第26頁莖尖結(jié)構(gòu)無病毒植物的培養(yǎng)第27頁微莖尖普通莖尖無病毒植物的培養(yǎng)第28頁馬鈴薯脫毒苗無病毒植物的培養(yǎng)第29頁無病毒植物的培養(yǎng)第30頁康乃馨不一樣莖尖培養(yǎng)與康乃馨斑駁病毒脫除情況無病毒植物的培養(yǎng)第31頁(3)莖尖培養(yǎng)法脫除植物病毒技術(shù)關(guān)鍵①同一個病毒在不一樣植物體內(nèi)分布部位不一樣。例：煙草花葉病毒(TMV)在以下植物中熒光反應(yīng)。煙草：l-4片葉原基中未見TMY特異熒光撞羽矮牽牛：一兩片葉原基未見TMV特異熒光，而在三四片葉原莖中可見TMV熒光。番茄：1片葉原莖中未見TMV特異熒光。

所以在用莖尖培養(yǎng)脫毒時，必須認真確定病毒在植物莖尖中分布部位，然后確定培養(yǎng)莖尖大小.無病毒植物的培養(yǎng)第32頁如：番茄：只能取生長錐或僅帶一片葉原基莖尖進行培養(yǎng)；撞羽矮牽牛：可取生長錐或帶一兩片葉原基莖尖進行培養(yǎng)；煙草：可取帶4片葉原基莖尖進行培養(yǎng)。

利用莖尖堵養(yǎng)法脫除植物病毒時，最好找出莖原基所帶葉原基數(shù)目與生長點(莖尖)大小相關(guān)性，這么在取材時就方便多了。無病毒植物的培養(yǎng)第33頁莖原基0.05~0.08mm莖原基帶2片葉原基0.1~0.2mm莖原基帶4片葉原基0.3~0.4mm莖原基帶6片葉原基0.6~0.8mm無病毒植物的培養(yǎng)第34頁②不一樣病毒種類在同一個植物中分布部位不一樣。無病毒植物的培養(yǎng)第35頁甘薯斑紋花葉病毒、縮葉花葉病毒：分布于1.0-2.0mm以內(nèi)莖尖中羽毛狀花葉病毒：

分布于0.3-1.0mm以內(nèi)莖尖中馬鈴薯馬鈴薯卷葉病毒、Y病毒：分布于1.0-3.0mm以內(nèi)莖尖中；X病毒：分布于0.2-0.5mm以內(nèi)莖尖

G病毒：分布于0.2-0.3mm以內(nèi)莖尖S病毒：0.2mm以下

無病毒植物的培養(yǎng)第36頁2.愈傷組織培養(yǎng)脫毒植物各部位器官和組織培養(yǎng)去分化誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，然后從愈傷組織再分化產(chǎn)生芽，長成小植株，能夠得到無病毒苗。說明病毒顆粒會在愈傷組織培養(yǎng)過程中逐步消失。無病毒植物的培養(yǎng)第37頁愈傷組織脫病毒機理可能原因有：①病毒在植物體內(nèi)不一樣器官或同一器官不一樣組織中分布不均勻，由那些無病毒細胞增殖產(chǎn)生愈傷組織就是取得無病毒苗基礎(chǔ)。②有些愈傷組織細胞中病毒濃度較低，在愈傷組織細胞快速分裂過程中，病毒復(fù)制能力衰退或丟失。③繼代培養(yǎng)愈傷組織輕易產(chǎn)生抗性變異細胞，因而可能出現(xiàn)不帶病毒愈傷組織。但經(jīng)愈傷組織產(chǎn)生無病毒苗脫毒路徑輕易產(chǎn)生變異，可能造成植株喪失其原有優(yōu)良性狀，當然也有可能產(chǎn)生有益變異，但頻率極低。無病毒植物的培養(yǎng)第38頁3.莖尖微體嫁接脫毒先將砧木種子進行表面消毒，以后再接到1%瓊脂以MS無機鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)發(fā)芽，用苗齡約2周幼嫩實生苗作砧木。把實生苗從試管中取出，在無菌條件下切去頂部，留下1-1.5cm上胚軸部分，將子葉和液芽除去，把根切短至4—6cm長。從田間或溫室旺盛生長成年樹剪取一小段新梢，經(jīng)消毒后在超凈臺上用顯微操作法取出僅帶1-3個葉原基莖尖約1mm大小作穗用。采取倒T字形水平切口。嫁接苗用液體濾低橋培養(yǎng)基培養(yǎng)。成活率30%—50%，嫁接成功植株移植到土壤之前最少要有兩片展開真葉。無病毒植物的培養(yǎng)第39頁蘋果微體嫁接莖尖大小與脫毒成功率無病毒植物的培養(yǎng)第40頁蘋果不一樣取材時期對微體嫁接成功率影響無病毒植物的培養(yǎng)第41頁蘋果微體嫁接莖尖大小與脫毒成功率無病毒植物的培養(yǎng)第42頁試管微體嫁接在果樹方面發(fā)展最快

(1)嫁接植物不受與珠心及有性實生苗相關(guān)幼年階段影響。(2)許多栽培品種經(jīng)過嫁接繁殖了許多世代，所以果樹研究者和種植者關(guān)于這些品種自根苗根冠大小、病蟲害情況以及耐寒性等了解得極少。無病毒植物的培養(yǎng)第43頁(3)莖尖組織培養(yǎng)繁殖結(jié)合熱處理可產(chǎn)生無病毒植物，所以，許多研究者認為對通常采取嫁接繁殖果樹進行試管嫁接是很適宜。(4)試管微體嫁接除了可培育無病毒植株外，還可處理難以生根園藝植物生根問題和進行嫁接親和力研究。無病毒植物的培養(yǎng)第44頁

4.珠心胚培養(yǎng)脫毒

柑桔類80%以上種類含有多胚性,而單胚占百分比很小。柑橘類植物中有不少多胚品種，一顆種子內(nèi)除一個合子胚外，還有數(shù)個至數(shù)十個由珠心細胞形成無性胚，稱做珠心胚。因為病毒通常是經(jīng)維管束韌皮組織傳輸，而珠心與維管束系統(tǒng)無直接聯(lián)絡(luò)。由珠心組織誘導(dǎo)產(chǎn)生植株就可免去病素毒危害。無病毒植物的培養(yǎng)第45頁①它與合子胚不一樣，不是受精產(chǎn)物，而是由體細胞產(chǎn)生，所以含有和母體相同遺傳組成；②與合子胚一樣，在珠心胚和植株之間無維管組織連系，所以即使母體植株感染了病毒，珠心胚也是無毒；③在自然條件下，珠心胚普通都不能發(fā)育成熟，只有適時從種子中剝離出來，接種在人工培養(yǎng)基上，珠心胚才能長成植株，而這些植株應(yīng)該是不帶病毒母體無性系。珠心胚含有3個特征無病毒植物的培養(yǎng)第46頁5.花藥培養(yǎng)脫毒花藥培養(yǎng)最初目標，是培育起源于花藥內(nèi)部花粉粒單倍體植株，并使單倍體加倍，作為育種材料起源。但經(jīng)大量試驗表明花藥培養(yǎng)所得植株有95%以上是能開花結(jié)果多倍體，而且生長發(fā)育都優(yōu)于母株。已證實，經(jīng)愈傷組織培養(yǎng)出來花藥植株是不帶病毒，借此方法，不但可快速培育出大量無毒植株，并可省去病毒判定工作，對基層生產(chǎn)應(yīng)用實為一舉兩得事情。無病毒植物的培養(yǎng)第47頁三、分離莖尖培養(yǎng)情況第一個：是生長停頓，接種組織并有擴大，顏色逐步變褐而枯死，這種情況大多是生長點在分離接種過程中受傷而造成；第二種：是生長太慢，莖尖接種后顏色逐步變綠，但不見增大，最終成綠色小點。這是因為生長素濃度偏低，或培養(yǎng)溫度過低所造成，假如馬上轉(zhuǎn)入較高濃度生長素培養(yǎng)基中，或提升培養(yǎng)溫度，即能促進莖尖生長；無病毒植物的培養(yǎng)第48頁第三種：是生長過旺，接種后莖尖顯著增大，約培養(yǎng)一同后即在莖尖基部產(chǎn)生愈傷組織，但不易見到莖尖伸長，組織顏色也較澆。這是因為培養(yǎng)莖生長素濃度偏高，或光照弱，溫度高而造成。為此應(yīng)將培養(yǎng)材料轉(zhuǎn)入生長素濃度較低培養(yǎng)基中，或降低溫度，提升光照強度來處理。不然時間長了愈傷組織會表換生長分化能力；第四種：是生長正常、在營養(yǎng)、激素、溫度、光照等各方面條件正常情況下，接種莖尖顏色逐步變綠，基部逐步增大，有時形成少許愈傷組織，莖尖也逐步伸長，培養(yǎng)一個月左右轉(zhuǎn)入無基素基本培養(yǎng)基，莖尖繼續(xù)伸長，并產(chǎn)生根系，最終發(fā)育成完整植株。無病毒植物的培養(yǎng)第49頁第三節(jié)無病毒植株脫毒程序一、材料準備1．決定植物種類及品種。選取生長健壯，遺傳性一致品種為材料，并探明該品種除所脫除病毒在寄主中位置。2．了解該植物體內(nèi)所含有病毒種類及危害程度。依據(jù)植物所帶病毒種類，選擇指示植物(敏感植物)。3．決定脫除病毒方法：“莖尖培養(yǎng)”還是“熱處理”還是“微體嫁接”。無病毒植物的培養(yǎng)第50頁二、生長點分離和培養(yǎng)(莖尖培養(yǎng)為例)

1．從罹病植株上切取頂芽或腋芽。2．材料表面滅菌、決定滅菌藥劑、濃度、時間。3．依據(jù)病毒在寄主內(nèi)分布位置決定切取莖尖大小。假如熱處理，那么決定熱處理溫度、時間。4．接種成功率與莖形狀結(jié)構(gòu)相關(guān)。例馬鈴薯、百合生長點呈半圓形較大、好分離。番薯、矮牽牛、香石竹呈半圓形，也比很好分離。大麗花、菊花生長點扁平、并被對生葉原基夾住難分離。草莓，葉原基上生有密集茸毛，生長點埋在肉質(zhì)凹形槽內(nèi)，不但難分離且輕易污染。無病毒植物的培養(yǎng)第51頁三、無病毒植物判定

經(jīng)過莖尖分生組織培養(yǎng)、熱處理脫毒法、微體嫁接法而培養(yǎng)成植株，不一定都是無病毒植株。當前用于病毒檢測方法有以下3種：①血清判定法；②生物判定法(敏感植物或指示植物)；③電子顯微鏡判定法。采取單一判定法并不十分可靠。尤其是對一些特異性病毒，單一判定方法可靠性更差。最好三種方法同時判定，能夠取得理想結(jié)果。無病毒植物的培養(yǎng)第52頁(一)指示植物判定法1、原理

指示植物法是利用病毒在其它植物上產(chǎn)生枯斑作為病毒種類判別標準，也即枯斑和空斑測定法。無病毒植物的培養(yǎng)第53頁2、指示植物兩種類型一個是接種后產(chǎn)生系統(tǒng)性癥狀，出現(xiàn)在病毒擴展到植物非接合部位，通常沒有局部顯著病斑；另一個是只產(chǎn)生局部病斑，常由壞死、褪綠或環(huán)斑組成。慣用指示植物：千日紅、曼陀羅、豇豆、心葉煙、辣椒、莨菪等。

無病毒植物的培養(yǎng)第54頁每種病毒都有自己敏感植物如：馬鈴薯病毒敏感植物：千日紅、黃花煙、心葉煙、毛葉曼陀羅；大蒜病毒敏感植物：藜、千日紅；草莓病毒敏感植物：威州草莓(從八倍體野生種選出)、野草莓、野紅草莓等。桃紅葉病毒敏感植物：旱金蓮。大麗花病毒敏感植物：昆落阿藜、莧色藜、心葉煙、克里芙蘭煙、矮牽牛、黃瓜。香石竹病毒敏感植物：昆落阿藜、莧色藜。菊花病毒敏感植物：矮牽牛、豇豆。無病毒植物的培養(yǎng)第55頁3、敏感植物判定病毒方法：

A、摩擦接種法：取培養(yǎng)植株葉片榨汁，將其汁用摩擦法接種到各自敏感植物上，然后視其病斑有沒有，來判斷是否脫除了病毒。接種后如若敏感植物葉片表現(xiàn)病斑，可依據(jù)病斑類型判斷，還有哪種病毒沒有脫除。

無病毒植物的培養(yǎng)第56頁例：馬鈴薯體內(nèi)各種病毒在其敏感植物上表現(xiàn)癥狀：X病毒侵染千日紅(葉片呈枯斑)；M、S病毒侵染千日紅(葉片呈突起枯斑)；X病毒侵染黃花煙(葉片呈花葉)；Y病毒侵染黃花煙(葉片花葉或條斑或呈顯著脈綠帶)；X病毒侵染心葉煙(葉片呈花葉)；Y病毒侵染心葉煙(葉片呈條斑)；P／G帶毒體侵染心葉煙(葉片呈花葉)；M、Y病毒侵染毛葉曼陀羅(葉片呈枯斑)。植物汁液摩擦接種后，如使千日紅葉片呈枯斑，使黃花煙、心葉煙葉片呈花葉證實，該植物體內(nèi)含有馬鈴薯X病毒。無病毒植物的培養(yǎng)第57頁B．嫁接法：有些病毒不是經(jīng)過汁液傳輸，而是經(jīng)過專門介體傳輸。如草莓黃化病毒、草莓叢枝病毒是經(jīng)過一個特殊蚜蟲為介體進行傳輸。這種病毒判定，需將培養(yǎng)植株芽嫁接在敏感植物上，依據(jù)敏感植物病癥表現(xiàn)來判斷是否脫除了病毒。無病毒植物的培養(yǎng)第58頁木本多年生植物及草莓等無性繁殖草本植物通常采取嫁接接種方法以指示植物作砧木，被判定植物作接穗，可采取劈接、靠接、芽接等方法嫁接，其中以劈接法為多。如草莓以對病毒敏感歐洲草莓（野草莓）和深紅莓作指示植物，從經(jīng)脫毒得到植株上僅取成齡葉片頂端一小葉作接穗，葉柄用刀片削成楔形，削面長8~10mm，然后快速將接穗小葉葉柄插入切口，用塑料綁縛接合部，嫁接后4周，若帶有病毒，則在新展開葉片、匍匐莖或老葉上會出現(xiàn)病征無病毒植物的培養(yǎng)第59頁

（二）抗血清判定法1、基本原理：當動物被病毒感染或人工注射異體蛋白質(zhì)時，在動物體內(nèi)會產(chǎn)生一個特異性丙種球蛋白稱為免疫球蛋白，即所謂“抗體”。引發(fā)形成抗體物質(zhì)(病毒或異體蛋白)稱為“抗原”。無病毒植物的培養(yǎng)第60頁抗原和抗體結(jié)合，表現(xiàn)為很強特異性。即由一個病毒產(chǎn)生抗體，只能結(jié)合該種病毒。抗體在特殊細胞內(nèi)形成，進入血液存在于血清和體液內(nèi)。這種含有特異性“抗體”血清稱為“抗血清”?？乖涂贵w相結(jié)合反應(yīng)稱為“血清反應(yīng)”。無病毒植物的培養(yǎng)第61頁2.病毒抗血清在診療上價值。

A.病毒抗血清含有高度?；?。即由一個病毒產(chǎn)生“抗體”，只能結(jié)合該種病毒(抗原)。如由注射(感染)TMV而產(chǎn)生抗體(免疫球蛋白)，只能檢測TMV病毒(才可能發(fā)生血清反應(yīng))。B．因為“抗血清”法含有高度?；裕詫τ谀切┦芨腥径鴽]有癥狀帶毒植物，也能診療，故在實用上含有很高價值。C．因為病毒與“抗血清”“反應(yīng)量”與病毒濃度成正比。只要知道其中一個濃度，可依據(jù)反應(yīng)量來測定另一個濃度。故此能夠用來作病毒定量分析。無病毒植物的培養(yǎng)第62頁3.病毒抗血清在診療上不足：A.不是全部病毒都能制成抗血清，普通“黃化型”病毒，或嚴格由專化性昆蟲傳輸病毒。如馬鈴薯卷葉病毒極難或不能取得“抗血清”。B．病毒在寄主體內(nèi)含量太少，而提純過程中喪失又太多。或者提純過程中，病毒質(zhì)粒喪失了必備抗原結(jié)構(gòu)。C．植物體內(nèi)含有單寧物質(zhì)，單寧與病毒結(jié)合，使病毒喪失了抗原性質(zhì)。無病毒植物的培養(yǎng)第63頁4.方法抗血清判定首先要進行抗原制備，包含病毒繁殖、病葉研磨、汁液澄清、病毒懸浮液提純、病毒沉淀等過程。只有取得高純度抗原，才有可能取得高度純凈抗血清。普通采取家兔制備抗植物病毒抗血清，以9~24個月大小家兔為好，注射病毒懸浮液，在家兔饑餓12h后采血，再進行抗血清分離和吸收等過程。血清可分裝在小玻璃瓶中，貯存在－15~－20℃冰凍條件下，也能夠分裝在安瓶中，冷凍干燥，然后密封，有效保留。無病毒植物的培養(yǎng)第64頁詳細測定可采取沉淀反應(yīng)、凝集反應(yīng)、免疫擴散、免疫電泳、熒光抗體技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附試驗等各種方法。無病毒植物的培養(yǎng)第65頁酶聯(lián)免疫吸附法

(enzyme1inkedimmunOsOrbentassay，EL工SA)酶聯(lián)免疫吸附法是把抗原—抗體免疫反應(yīng)與酶催化反應(yīng)相互結(jié)合而發(fā)展起來一個綜合性技術(shù)，它靈敏度高，特異性強，尤其是當寄主體內(nèi)病毒濃度很低或同時存在病毒鈍化物或抑制劑時，它優(yōu)勢尤為顯著，因而是近年來病毒檢測方法中發(fā)展最快、應(yīng)用最廣一個方法。無病毒植物的培養(yǎng)第66頁酶聯(lián)免疫吸附法原理利用以酶標識特異抗體來指示抗原—抗體結(jié)合，從而檢出樣品中抗原。詳細操作程序是：將待檢植物汁液(抗原)注入酶聯(lián)板(聚苯乙烯多孔微量反應(yīng)板)中，使抗原吸附于它孔壁，然后加入以酶標識特異抗體，待抗原與抗體充分反應(yīng)后，洗去未與抗原結(jié)合多出酶標識抗體，于是在固相載體酶聯(lián)板表面就只留下以酶標識抗原—抗體復(fù)合物。這時加入酶無色底物，復(fù)合物上酶催化底物降解，生成有色產(chǎn)物。這一結(jié)果可用肉眼識別，也可用分光光度計對底物降解量進行測定。無病毒植物的培養(yǎng)第67頁血清判定法無病毒植物的培養(yǎng)第68頁血清判定基本方法A.玻璃片凝集法在清潔玻璃片一端，用毛細管滴加5滴稀“抗血清”，另一端滴加等量對照血清。然后各加滴被檢植物壓榨出原汁液兩滴。用玻璃棒攪勻，在常溫下靜置20-50min，然后在40-60倍顯微鏡下觀察。帶病毒葉綠體發(fā)生經(jīng)典凝集現(xiàn)象。無病毒植物的培養(yǎng)第69頁玻璃片凝集法無病毒植物的培養(yǎng)第70頁B．微量凝集試驗(MAT)在培養(yǎng)皿底部，鋪上一層火棉膠或聚乙烯醇縮甲醛薄膜，然后將抗血清滴入薄膜上，再在血清液滴上方覆蓋一層石蠟油。在20—25℃下保溫，20-50min后觀察。此法優(yōu)點：判定時能夠完全防止蒸發(fā)，抗血清用量少，每毫升抗血清可滴加150次，每培養(yǎng)皿能夠判定幾十個樣品。對一些病毒(馬鈴薯M病毒)引發(fā)細微病毒凝聚現(xiàn)象均可識別。無病毒植物的培養(yǎng)第71頁（三）電子顯微鏡檢驗法采取電子顯微鏡，能夠經(jīng)過直接觀察，檢驗出有沒有病毒存在，并能夠得知相關(guān)病毒顆粒大小、形狀和結(jié)構(gòu),又能夠判定病毒種類。這是一個較為先進方法，但需一定設(shè)備和技術(shù)。。病毒

形態(tài)長(nm)寬（nm）X線狀51513Y線狀73011A線狀73011S線狀65012~13M線狀65012~13無病毒植物的培養(yǎng)第72頁靈敏度高和能在植物粗提取液中定量測定病毒。當前利用負染和超薄切片電鏡觀察能夠診療和判別病毒到屬水平。1973年，Derrick把電鏡與免疫學(xué)技術(shù)相結(jié)合，建立了更為靈敏免疫吸附電鏡技術(shù)，該技術(shù)已成為植物病毒研究一個主要伎倆。方法優(yōu)點無病毒植物的培養(yǎng)第73頁(四)分子生物學(xué)方法在植物病毒判定中采取分子生物學(xué)方法主要是檢測病毒核酸。普通都含有快速、簡便、靈敏度高、特異性強等特點。核酸雜交技術(shù)原理:采取帶有放射性或非放射性物質(zhì)標識已知序列核酸單鏈作為探針，在一定條件下與靶病毒核酸單鏈退火形成雜交雙鏈。經(jīng)過雜交信號檢測，判定樣本中有沒有對應(yīng)病毒基因。無病毒植物的培養(yǎng)第74頁19世紀末以來，許多國家開始用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù)檢測果樹病毒，并取得很好效果。慣用有聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerasechainreaction，PCR)技術(shù)，即利用已知病毒核苷酸序列或同組病毒相同序列區(qū)域來設(shè)計引物，將待測樣品用PCR技術(shù)體外擴增DNA，擴增后產(chǎn)物可進行限制性片段長度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)、隨機擴增多態(tài)性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNARAPD)、擴增片段長度多態(tài)性(amplifiedfragmentlengthpolymorphism，AFLP)、變性梯度凝膠電泳(denaturinggradegelelectrophoresis，DGGE)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single-strandconformationpolymorphism，SSCP)、探針交叉雜交等技術(shù)分析檢測病毒是否存在。無病毒植物的培養(yǎng)第75頁因為多數(shù)植物病毒核酸是RNA，在進行PCR檢測前，需以RNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA后，再利用病毒核酸特有序列設(shè)計引物進行PCR反應(yīng)，即可知道在寄主中是否有病毒存在。RNA病毒和類病毒等在寄主體內(nèi)可形成雙鏈RNA(dsRNA)，而普通情況下植物體內(nèi)不存在dsRNA，所以dsRNA分析也可用于植物病毒判定。無病毒植物的培養(yǎng)第76頁利用DNA雜交和熒光標識技術(shù)相結(jié)合基因芯片技術(shù)也是植物病毒快速檢測主要發(fā)展方向。在實際應(yīng)用中，為了提升檢測可靠性，往往用幾個方法同時判定。最終選擇出無毒苗即可進行擴增繁殖，用于生產(chǎn)。但在無毒種苗擴增繁殖和應(yīng)用過程中應(yīng)注