通過技術研究基因在小麥與葉銹菌互作過程中的反應

畢業(yè)論文題目:通過VIGS技術研究ATG8基因在小麥與葉銹菌互作過程中的HR反映學院:專業(yè)班級:學號:學生姓名:指導教師姓名:指導教師職稱: 二O一二年六月十四日通過VIGS技術研究ATG8基因在小麥與葉銹菌互作過程中的HR反映摘要:由小麥葉銹菌(Pucciniatriticina)引起的小麥葉銹病在世界各地產(chǎn)麥區(qū)均有發(fā)生。植物抵抗病原體侵入所誘發(fā)的超敏反映在小麥抵抗葉銹菌侵染的過程中占有重要地位。ATG8基因參與了小麥抵抗葉銹菌侵染過程中的自噬發(fā)生,ATG8蛋白家族作為一種已被鑒定的膜結(jié)合蛋白,在自噬功能中具有重要作用。本實驗通過VIGS技術沉默掉小麥中自噬相關基因ATG8,進而運用HR熒光染色技術研究分析在小麥與葉銹菌互作過程中ATG8基因?qū)R反映的影響,為進一步探討ATG8基因和自噬功能的研究奠定了基礎。關鍵詞:小麥;葉銹菌;自噬;HR;VIGSThehypersensitiveresponseofATG8geneinWheat-leafRustInteractionresearchingbyVIGStechnologyAbstract:WheatleafrustcausedbyPucciniatriticinaisaseriousandwidelydistributeddiseaseofwheat.TheHypersensitiveReaction(HR)inducedbytheinvasionofpathogensintheplantsplaysaveryimportantpartintheprocessofthewheatresistanttothepathogen.ATG8genesinvolvedintheprocessofautophagyduringwheatresistancetoleafrustinfection.Asaconfirmedmembrane-bindingproteinfamily,ATG8playsanimportantroleintheautophagyfunction.InthisarticleweSilentoutATG8genes,theautophagy-relatedgenesinwheat,viaVGIStechnologyandthenusetheHRfluorescentstainingtechniquetostudytheimpactofATG8genesontheHRresponseinthewheatleafrustinteraction.AndallofthislaidthefoundationforfurtherstudyoftheATG8genesandautophagyfunctions.Keywords:Wheat;leafRust;Autophagy;HR;VIGS1引言 11.1小麥與葉銹菌 11.2PCD 11.2.1PCD與HR 11.2.2自噬 11.3VIGS技術 21.4本實驗的研究目的 22材料與方法 32.1材料 32.1.1小麥、供試菌與病毒 32.1.2重要試劑及儀器 32.2方法 42.2.1幼苗的培養(yǎng) 42.2.2搖菌提質(zhì)粒 42.2.3酶切線性化 52.2.3接菌 62.2.4取樣 62.2.5HR熒光染色 63結(jié)果 63.1體外轉(zhuǎn)錄結(jié)果檢測圖 63.2病毒侵染小麥結(jié)果 73.3HR熒光染色結(jié)果 74討論與分析 84.1病毒侵染小麥結(jié)果的分析 84.2HR熒光染色結(jié)果分析 84.3本實驗問題分析 95結(jié)論 91引言1.1小麥與葉銹菌小麥（Triticumaestivum）是世界上分布范圍最廣、栽培面積最大、總產(chǎn)量最高的糧食作物。小麥葉銹菌是一種嚴格的活體寄生性真菌,同寄主之間存在著高度的小種一品種?；?并在小麥上形成夏孢子和冬孢子,冬孢子萌發(fā)產(chǎn)生擔孢子。該菌在華北、西北、西南、中南等廣大麥區(qū)的自生麥和晚熟春麥上以夏孢子連續(xù)侵染的方式越夏,秋季就近侵染秋苗,并向鄰近地區(qū)傳播,其越冬形式和越冬條件與條銹病類似。該菌夏孢子萌發(fā)后產(chǎn)生芽管從葉片氣孔侵入,氣溫20—25℃經(jīng)6天潛育,在葉面上產(chǎn)生夏孢子堆和夏孢子,進行多次反復侵染[1,2]。1.2PCD1.2.1PCD與HR程序性細胞死亡（ProgrammedCellDeath,PCD）是有機體在漫長的進化過程中發(fā)展起來的細胞自殺機制,在生物體生長發(fā)育、清除無用、多余或癌變的細胞,維持機體內(nèi)物質(zhì)循環(huán)及環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用。PCD最早在動物中研究發(fā)現(xiàn),是生物體生長發(fā)育到一定階段,在特定組織器官中出現(xiàn)的一種積極的、由特定基因控制的生理性細胞死亡[3,4]。由于植物生長發(fā)育和細胞結(jié)構(gòu)的特殊性,植物細胞PCD的研究起步較晚。1994年Greenberg等初次提出在植物抵抗病原體侵入所誘發(fā)的超敏反映(HypersensitiveReaction,HR)中也存在著類似動物細胞程序性死亡的現(xiàn)象[5,6]。HR即過敏性壞死反映是植物基本的抗病反映,特點是當寄主植物受到病原物侵染時,在侵人點周邊的少數(shù)細胞迅速死亡,產(chǎn)生枯斑,從而限制病原物擴展、蔓延的一種積極防衛(wèi)反映[7]?，F(xiàn)在人們習慣上都把HR歸為PCD的重要表現(xiàn)形式之一,并以HR-PCD表達。雖然HR的形態(tài)特性已經(jīng)被詳盡描述了,但PCD的誘發(fā)和終止機制目前還不清楚。在侵染部位形成的HR-PCD必須通過專門的機制被精細的控制,從而使寄主的損傷控制到最小。而對于HR-PCD誘發(fā)和控制的理解,絕大部分來自枯斑模擬突變體的研究[8]。PCD分為兩種類型:I型細胞死亡即是指細胞凋亡；II型細胞死亡則是自噬性細胞死亡（Autophagiccelldeath）[9]。1.2.2自噬自噬（Autophagy）,指細胞在營養(yǎng)缺少或應激條件下,通過降解細胞內(nèi)衰老的長壽命蛋白質(zhì)、受損傷的細胞結(jié)構(gòu)和細胞器,為細胞的重建、再生和修復提供必需原料,實現(xiàn)細胞的再循環(huán)和再運用,是生物體一種重要的防御和保護機制[10]。自噬重要分為三種類型:巨型自體吞噬(Macroautophagy),微型自體吞噬(Microautophagy)和分子伴侶介導自噬(Chaperonmediatedautophagy)。而在植物中目前擬定的自噬機制涉及巨自噬（Macroautophagy）和微自噬（Microautophagy）兩種。目前,研究最廣泛最重要的自噬形式是巨自噬[11]。自噬的形成過程可劃分為4個重要階段,即誘導、自噬小泡的形成、自噬小泡辨認并與液泡(溶酶體)融合,以及自噬小體的降解。一方面,細胞接受到自噬誘導信號后(饑餓條件或營養(yǎng)因子缺少),在細胞漿中產(chǎn)成相稱量的游離扁平的雙層膜結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)類似“脂質(zhì)體”,被稱作隔離膜,圍繞在被降解物的周邊。另一方面,隔離膜不斷延伸,將胞漿完全包繞起來,涉及細胞器等,形成密閉的球狀的自噬體。然后,自噬體形成后,可與細胞內(nèi)吞的內(nèi)吞泡、吞飲泡在體內(nèi)融合。最后,自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體,在此期間自噬體的內(nèi)膜被溶酶體酶降解,兩者的內(nèi)容物合為一體,同時自噬體中的降解物被降解,產(chǎn)物（氨基酸、脂肪酸等）被輸送到胞漿中供細胞重新運用,而殘渣或被排出體外或滯留在胞漿中。1.3VIGS技術病毒誘導的基因沉默(VirusInducedGeneSilencing,VIGS)屬于轉(zhuǎn)錄后的基因沉默,指攜帶植物功能基因cDNA片段的重組病毒,在侵染植物體后誘導植物發(fā)生基因沉默而出現(xiàn)表型突變,可以通過植物表型或生理指標上的變化來反映該基因的功能[12]。VIGS技術現(xiàn)已被開發(fā)為快速鑒定植物基因功能的一種反向遺傳學新技術。BSMV是最早成功應用于單子葉植物(大麥和小麥)基因沉默的VIGS載體。八氫番茄紅素脫氫酶(Phytoenedesacturase,PDS)是類胡蘿卜素合成所必需的酶,其相應的基因常作為VIGS體系的指示基因[13]。VIGS與動物RNAi機理上有許多相似之處。VIGS啟動時一般先形成雙鏈RNA(doublestrandedRNA,dsRNA),dsRNA被類似動物Dicer、稱為Dicerlike(DCL)的RNaseIII酶切割約為21224nt的siRNA(shortinterferingRNA),siRNA作為VIGS促發(fā)因子以單鏈形式與Argonaute(AGO)RNA結(jié)合蛋白以及其他RNase結(jié)合形成RNA誘導的沉默復合體(RNAInducedSilencingComplex,RISC),這一RISC復合體可以特異地與同源的靶標mRNA結(jié)合,并降解這些靶標mRNA[14,15]。VIGS誘導基因沉默的機制非常復雜。它因所使用的病毒載體的類型和宿主,甚至特定的靶基因片斷不同而產(chǎn)生不同的效果。沉默過程中病毒對靶基因沉默效率的影響也因具體的體系不同而有明顯差異[16]?；谒查g表達的VIGS技術,為植物功能基因組的研究提供了一個高通量分析的技術平臺。隨著越來越多的基因組序列的測定,與傳統(tǒng)的研究基因功能的方法相結(jié)合,VIGS將在植物基因功能研究中廣泛的應用[17,18]。1.4本實驗的研究目的本實驗室長期以來從事小麥抗葉銹菌侵染生理機制的研究工作,前期工作基礎條件優(yōu)越,研究技術有保證,跟蹤國內(nèi)外研究前沿,至今已積累了大量的文獻資料,并在前期實驗中純熟運用VIGS、HR熒光染色等技術,得到了很多關鍵的結(jié)果。并已知ATG8基因是自噬過程中的重要功能基因。而本實驗重要研究小麥與葉銹菌互作過程中自噬與HR-PCD的關系。通過采用VIGS技術沉默掉自噬相關基因ATG8,然后運用HR熒光染色技術將樣品染色,并將供試組樣品的HR-PCD面積和數(shù)量與對照進行比較,觀測基因沉默前后變化情況來擬定自噬對HR-PCD中的影響。2材料與方法2.1材料2.1.1小麥、供試菌與病毒本實驗本實驗采用小麥（TriticumaesetrumL.）品種洛夫林10（Lovrin10）。供試菌種為小麥葉銹菌（Pucciniatriticina）生理小種260（單孢菌系繁殖）。洛夫林10與葉銹菌小種組成不親和組合。大腸桿菌DH5α。2.1.2重要試劑及儀器重要試劑:甲醇、氯仿、乳酚油（苯酚20g、20﹪甘油40mL、乳酸20mL、水20mL）、95%乙醇、50%乙醇、0.5M氫氧化鈉（NaOH2g水100mL）、Tris-Hcl緩沖液（PH8.5）、0.1﹪FlorensentBnghthener（FB）、25﹪甘油、北京TransGenBiotech有限公司的EasyPureTMPlasmidMiniPrepKit、TaKaRaBiotechnology公司的SpeⅠ酶和MulⅠ酶、Ambion公司的mMESSAGEmMACHINE

T7轉(zhuǎn)錄試劑盒10×GD.FES根據(jù)下表配制VIGS藥品,如下：表110×GD的配制Tab.1Protocolof10×GD組分加入量Glycine18.77gK2HPO426.13gddH2O用于定容總體積500mL用ddH2O將配制的藥品定容止500mL,然后高壓滅菌20分鐘。表2FES的配制Tab.2ProtocolofFBS組分加入量10×GD50mLSodiumPyrophate（焦磷酸）2.5gBentonite（皂粘土）2.5gGelite545AWCourse（硅藻土）2.5gddH2O用于定容總體積250mL用ddH2O將配制的藥品定容止250mL,高壓滅菌20分鐘。用品與儀器:離心機、水浴鍋、安瓿瓶、電子天平、磁力加熱攪拌器、熒光顯微鏡、小型離心機、861旋渦混合器、DYY-2穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、pH計、全套微量移液器、超低溫冰箱、制冰機2.2方法2.2.1幼苗的培養(yǎng)先將小麥種子在一定的溫度與濕度下催芽一夜,然后選取飽滿健碩且萌發(fā)一致的種子播于直徑15cm的花盆中,每盆種12-16粒種子,覆蓋薄薄一層細土,將花盆放于人工氣候培養(yǎng)室中進行培養(yǎng),晝夜溫度25/20攝氏度,光照周期14h/d,日光型鏑燈照射,光照強度400W/m2,培養(yǎng)至一葉一心時期,進行病毒感染。2.2.2搖菌提質(zhì)粒將具有目的基因載體的大腸桿菌在培養(yǎng)基中搖菌過夜,按照TransGenBiotech公司的EasyPureTMPlasmidMiniPrepKit的操作環(huán)節(jié)提取質(zhì)粒。環(huán)節(jié)如下:取1.5mL過夜培養(yǎng)的細菌10000×g離心1min,盡量吸盡上清。加入250μL無色溶液RB（含RNaseA）,震蕩懸浮細菌沉淀,不應留有小的菌塊。加入250μL藍色溶液LB,溫和的上下翻轉(zhuǎn)混合4-6次,使菌體充足裂解,（形成藍色的透亮的溶液,顏色有半透亮變?yōu)橥噶了{色,指示完全裂解,不宜超過5min）。加入350μL黃色溶液NB,輕輕地混合5-6次（顏色由藍色完全變?yōu)辄S色,指示完全混合均勻,中和完全）,直至形成緊實的黃色凝集塊,室溫靜置2min。15000×g離心6min,小心吸取上清加入吸附柱中。15000×g離心1min,棄去流出液。加入650μL溶液WB,15000×g離心1min,棄去流出液。15000×g離心1-2min,徹底去除殘余的WB。將吸附柱放于干凈的離心管中,在柱的中央加入30-50μLEB或去離子水（pH>7.0）室溫靜置1min。10000×g離心1min,洗脫DNA于-20℃保存。2.2.3酶切線性化將上一步提出的質(zhì)粒中BSMV-α,BSMV-γ0,BSMV:PDS和BSMV:ATG8用MluⅠ進行酶切線性化,BSMV-β用SpeⅠ進行酶切線性化。酶切體系如下:表3酶切體系的配制Tab.3Protocolofdigestionsystem組分加入體積SpeⅠ/MulⅠ2.5μL質(zhì)粒提取液9μL10×MBuffer5μL滅菌水33.5μL總體積50μL離心混勻,37℃水浴2h。2.2.4體外轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)染參照試劑盒說明書進行體外轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄體系如下:表4體外轉(zhuǎn)錄體系的配制Tab.4Protocolofinvitrotranscriptionsystem組分加入體積NTP10μL10×MBuffer2μLDNA6μL酶2μL總體積20μL離心混勻,37℃水浴2h。取5μL的轉(zhuǎn)錄后的體系進行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,剩余溶液分裝,用于后續(xù)轉(zhuǎn)染。在幼苗生長7d后（第一片真葉完全展開時）,各取2μL的BSMV-α、BSMV-β和BSMV:ATG8等量混合于19.5μL的FES,用手將混合后的溶液均勻涂抹于幼苗的第2和第1葉片上,再向葉面均勻噴霧,然后將幼苗置于保濕箱中黑暗保濕12-14h后,移入培養(yǎng)室內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。同理,各取2μL的BSMV-α、BSMV-β和BSMV:PDS等量混合于19.5μL的FES,和各取2μL的BSMV-α、BSMV-β和BSMV:γ0等量混合于19.5μL的FES,用手分別將混合后的溶液均勻涂抹于兩組幼苗的第2和第1葉片上,再向葉面均勻噴霧,然后將幼苗置于保濕箱中黑暗保濕12-14h后,移入培養(yǎng)室內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。2.2.5接菌在幼苗接病毒10d后,用毛筆蘸取葉銹菌夏孢子粉,均勻涂于葉表,再向葉面均勻噴霧,然后將幼苗置于保濕箱中黑暗保濕16-18h后,移入培養(yǎng)室內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。2.2.6取樣分別在抹菌后的72h,96h,120h的幼苗上取樣,取幼苗的第一片葉子中間部分,取1.5cm長的樣品3-5片,放于安瓿瓶中,標清時間與植株抹病毒情況。染色備用。2.2.7HR熒光染色熒光染色壞死細胞所有環(huán)節(jié)在27℃-29℃下進行:將裝有樣品的安瓿瓶中加入1mL的甲醇和2mL的氯仿（視情況而定,體積比1:2）,透明解決6h。轉(zhuǎn)入1mL乳酚油和2mL乙醇（視情況而定,體積比1:2）中煮沸1.5min,為防止暴沸可放入牙簽,放置過夜,整個過程在通風櫥中進行。50﹪乙醇沖洗兩次,每次15min,用蒸餾水迅速沖洗2-3次,每次10min。放入0.5M的氫氧化鈉中漂白透明兩次,每次15min,用蒸餾水沖洗2-3次,每次10min。將樣品浸入Tris-Hcl緩沖液中浸泡30min,然后將緩沖液去除干凈。用0.1﹪FlorensentBnghthener（FB）染色5min,（FB可回收再運用）,迅速轉(zhuǎn)入蒸餾水中,清洗4次,每次清洗10min。轉(zhuǎn)入25﹪甘油中,浸泡30min后,用品有少量乳酚油的甘油作浮載劑制片。在熒光顯微鏡下觀測樣品。3結(jié)果3.1體外轉(zhuǎn)錄結(jié)果檢測圖取5μL的轉(zhuǎn)錄后的體系進行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果,如圖1所示:M12345M12345目的條帶目的條帶圖SEQ圖表\*ARABIC1轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物電泳分析（1～5表達α、β、γ0、PDS、ATG8相應的條帶）結(jié)果表白體外轉(zhuǎn)錄獲得了目的條帶,可以用于后續(xù)實驗。3.2病毒侵染小麥結(jié)果接種葉銹菌生理小種260后120h小麥葉片結(jié)構(gòu)顯示,如圖2所示:ATG8120hγ0120h圖圖2ATG8120h與γ0120h的葉片結(jié)構(gòu)對比圖（紅框中白斑代表壞死斑）沉默ATG8基因后的小麥經(jīng)葉銹菌生理小種260侵染120h后葉片上出現(xiàn)壞死斑,而γ0病毒轉(zhuǎn)染后的小麥經(jīng)葉銹菌生理小種260侵染120h后葉片上未出現(xiàn)壞死斑。說明帶有目的基因的病毒已轉(zhuǎn)入小麥體內(nèi),可進行后續(xù)實驗。3.3HR熒光染色結(jié)果圖3ATG8圖3ATG8與γ0轉(zhuǎn)染的葉片經(jīng)病毒侵染不同時間段的HR熒光染色結(jié)果圖（A~C表達ATG8轉(zhuǎn)染的葉片經(jīng)病毒侵染72h、96h、120h；a~c表達γ0轉(zhuǎn)染的葉片經(jīng)病毒侵染72h、96h、120h）ＡａＢｃｂＣ4討論與分析4.1病毒侵染小麥結(jié)果的分析由于ATG8基因是重要的自噬功能基因,它的沉默會限制小麥自噬過程的正常發(fā)生,而由圖可知沉默ATG8基因后的小麥經(jīng)葉銹菌生理小種260侵染120h后葉片上出現(xiàn)壞死斑,而γ0病毒轉(zhuǎn)染后的小麥經(jīng)葉銹菌生理小種260侵染120h后葉片上未出現(xiàn)壞死斑。說明自噬對HR-PCD有負調(diào)控作用。因此當ATG8基因被沉默后便表現(xiàn)為HR-PCD失控,蔓延到未受感染的正常組織,而由空載病毒轉(zhuǎn)染后小麥自噬過程正常進行,因此出現(xiàn)了沉默ATG8基因后的小麥葉片出現(xiàn)的壞死斑而γ0病毒轉(zhuǎn)染后的小麥葉片未出現(xiàn)壞死斑。4.2HR熒光染色結(jié)果分析在72～120h內(nèi),隨著時間的變化,ATG8被沉默后,葉片上壞死斑數(shù)量逐漸增多,且單個壞死面積逐漸增大。而γ0病毒轉(zhuǎn)染后的小麥葉片出現(xiàn)的壞死斑數(shù)量少于沉默ATG8基因后的小麥葉片出現(xiàn)的壞死斑數(shù)量,且面積小于沉默ATG8基因后的小麥葉片出現(xiàn)的壞死斑。4.3本實驗問題分析在HR熒光染色結(jié)果中A圖與B圖對比中,A圖中的壞死斑比B圖中數(shù)量多與理論結(jié)論矛盾,但單個壞死斑的面積比B圖中小,也許的因素是由于接菌不均勻?qū)е戮慷嘤冢聵悠贰?結(jié)論由于基因ATG8是自噬過程中重要的功能基因,它影響自噬過程的正常進行。通過采用VIGS技術沉默掉自噬相關基因ATG8,然后將樣品中發(fā)生HR-PCD的面積和數(shù)量與對照進行比較,比較得出結(jié)果為沉默掉自噬相關基因ATG8后HR-PCD的面積增大且數(shù)量增多,由此表白自噬對HR-PCD具有負調(diào)控作用,即當ATG8基因被沉默后便表現(xiàn)為HR-PCD失控,從而蔓延到未受感染的正常組織,而由空載病毒轉(zhuǎn)染后小麥自噬過程正常進行,HR-PCD被有效控制在侵染點附近。參考文獻[1]楊文香,田平素,黃燕等.小麥葉銹菌離體培養(yǎng)研究[J].河北農(nóng)業(yè)大學學報,2023,24(4):58-61.[2]王智折.小麥葉銹菌侵染對不同抗病性小麥品種的生理生化差異[J].趙可夫,植物抗性生理研究.山東:科技出版社,1992:173-178.[3]張占全,宋水山,張春英等.異三聚體G蛋白參與小麥抗葉銹病反映的研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學,2023,42(1):117-123.[4]Greenberg,JT,GuoA,etal.Programmedcelldeathinplants:Apathogen-triggeredresponseactivatedcoordinatelywithmultipledefensefunctions[J].Cell,1994,77:551-564.[5]Greenberg,JT.Programmedcelldeathinplants-pathogeninteraction[J].AnnualReviewofPlantPhysiologyandPlantMolecularBiology,1997,47:525-545.[6]KuriyamaH,FukudaH.Developmentalprogrammedcelldeathinplants[J].CurrentOpinioninPlantBiology,2023,5(6):568-573.[7]YoungTE,GallieDR.Programmedcelldeathduringendospermdevelopment[J].PlantMolecularBiology,2023,44(3):283-30