產(chǎn)品微生物檢測(cè)方法

9（規(guī)范性）產(chǎn)品微生物檢測(cè)方法B.1產(chǎn)品采集與樣品處理于同一批號(hào)的3個(gè)運(yùn)輸包裝中至少抽取6件最小銷售包裝樣品（若樣品數(shù)量不能滿足試驗(yàn)所需，則應(yīng)相應(yīng)增加采樣數(shù)量其中1/3樣品用于檢測(cè)，2/3樣品用于留樣。抽樣的最小銷售包裝不應(yīng)有破裂，檢驗(yàn)前不得開啟。在空氣潔凈度5級(jí)凈化條件下用無菌方法打開至少2個(gè)包裝用于檢測(cè)，從每個(gè)包裝中取樣，準(zhǔn)確稱取10.0g±1.0g樣品。剪碎后加入到200mL滅菌生理鹽水中，充分混勻，得到一個(gè)生理鹽水樣液（若產(chǎn)品太輕，可稱取2.5g±0.2g樣品，加入50mL滅菌生理鹽水中）。液體產(chǎn)品吸取10.0mL原液直接作樣液。如被檢樣品具有抑菌或抗菌作用，應(yīng)選擇適宜的中和劑中和，稀釋梯度最高不超過1∶100。無相應(yīng)中和劑則選用薄膜過濾法去除樣品中對(duì)微生物生長(zhǎng)有影響的抑菌或抗菌成分，再按上述方法制備樣液。如被檢樣品含有大量吸水樹脂材料而導(dǎo)致不能吸出足夠樣液時(shí)，稀釋液量可按每次50mL遞增，直至能吸出足夠測(cè)試用樣液。在計(jì)算細(xì)菌菌落總數(shù)與真菌菌落總數(shù)時(shí)相應(yīng)調(diào)整稀釋度。B.2初始污染菌與細(xì)菌菌落總數(shù)檢測(cè)方法B.2.1操作步驟按B.1得到的生理鹽水或中和劑樣液自然沉降后取上清液，如需要可進(jìn)行10倍系列稀釋。選擇適宜的稀釋度進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。共接種2個(gè)平皿，每個(gè)平皿中加入2.0mL樣液，然后用冷卻至40℃~45℃左右熔化的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15mL～20mL倒入每個(gè)平皿內(nèi)混合均勻。待瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平皿置36℃±1℃培養(yǎng)48h，計(jì)算平皿上的菌落數(shù)。B.2.2菌落計(jì)數(shù)菌落呈片狀生長(zhǎng)的平皿不宜采用，確保2塊平皿符合計(jì)數(shù)要求并進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，按公式(B.1)計(jì)算結(jié)果：At=…………（B.1）式中：At─細(xì)菌菌落總數(shù)，單位為每克菌落形成單位（CFU/g）或每毫升菌落形成單位（CFU/mL）；A0─2塊營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平皿上的細(xì)菌菌落總數(shù)；K─稀釋倍數(shù)；2×2─2塊平皿，每塊平皿接種2.0mL樣液。首先選取平均菌落數(shù)在30CFU～300CFU之間的平皿。當(dāng)菌落數(shù)小于或等于100CFU/g或CFU/mL，按實(shí)有數(shù)報(bào)告，大于100CFU/g或CFU/mL時(shí)采用二位有效數(shù)字；當(dāng)2塊營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平皿上的細(xì)菌菌落總數(shù)為0CFU時(shí)，如為固體應(yīng)當(dāng)報(bào)告細(xì)菌菌落總數(shù)小于5CFU/g，如為液體按稀釋倍數(shù)報(bào)告。B.2.3結(jié)果報(bào)告B.2.3.1如經(jīng)首次檢測(cè)，樣品細(xì)菌菌落總數(shù)符合本文件的規(guī)定，直接按檢測(cè)結(jié)果報(bào)告。B.2.3.2如經(jīng)首次檢測(cè)，樣品細(xì)菌菌落總數(shù)超過本文件的規(guī)定，應(yīng)用留存的樣品依前法復(fù)測(cè)2次，然后才能報(bào)告結(jié)果。當(dāng)2次復(fù)測(cè)結(jié)果都達(dá)到本文件的規(guī)定，則判定被檢樣品合格，以2次合格結(jié)果的均值報(bào)告；其中有任何1次復(fù)測(cè)結(jié)果超過本文件規(guī)定，則判定被檢樣品不合格，以所有不合格結(jié)果的均值報(bào)告。B.3大腸菌群檢測(cè)方法B.3.1操作步驟不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣，則報(bào)告為大腸菌群陰性。B.3.1.2分離培養(yǎng)：如產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則劃線接種伊紅美藍(lán)瓊脂平皿，置36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h，觀察平皿上菌落形態(tài)。典型的大腸菌落為黑紫色或紅紫色，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤(rùn)，常具有金屬光澤，也有的呈紫黑色，不帶或略帶金屬光澤，或粉紅色，中心較深的菌落。B.3.1.3染色鏡檢與鑒定：取疑似菌落1個(gè)～2個(gè)作革蘭染色鏡檢，同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管，置36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h，觀察產(chǎn)酸產(chǎn)氣情況。B.3.2結(jié)果報(bào)告凡乳糖膽鹽發(fā)酵管產(chǎn)酸產(chǎn)氣，乳糖發(fā)酵管產(chǎn)酸產(chǎn)氣，在伊紅美藍(lán)平皿上有典型大腸菌群菌落，革蘭染色為陰性無芽孢桿菌，可報(bào)告被檢樣品檢出大腸菌群。B.4銅綠假單胞菌檢測(cè)方法B.4.1操作步驟養(yǎng)液中，充分混勻，置36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。如有銅養(yǎng)液常呈黃綠色或藍(lán)綠色。B.4.1.2分離培養(yǎng)：從培養(yǎng)液的薄菌膜處挑取培養(yǎng)物，劃線接種十六烷基三甲基溴化銨瓊脂平皿，置36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h，觀察菌落特征。銅綠假單胞菌在此培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落扁平無定型，向周邊擴(kuò)散，或蔓延，表面濕潤(rùn)，菌落呈灰白色，菌落周圍培養(yǎng)基常擴(kuò)散有水溶性色素。在缺乏十六烷基三甲基溴化銨瓊脂時(shí)也可用乙酰胺培養(yǎng)基進(jìn)行分離，將菌懸液劃線接種于平皿上，放36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h，觀察菌落特征。銅綠假單胞菌在此培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落扁平，邊緣不整，菌落周圍培養(yǎng)基略帶粉紅色。B.4.1.3染色鏡檢：取鑒定培養(yǎng)基上可疑菌落涂片作革蘭染色，鏡檢為革蘭陰性菌者還需進(jìn)行下列試驗(yàn)。B.4.1.4氧化酶試驗(yàn)：取一小塊潔凈的白色濾紙片放在滅菌平皿內(nèi)，用無菌玻棒挑取鑒定培養(yǎng)基上可疑菌落涂在濾紙片上，然后在其上滴加一滴新配制的1％二甲基對(duì)苯二胺試液，30s內(nèi)出現(xiàn)粉紅色或紫紅色，為氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性，不變色者為陰性。亦可使用商品化的氧化酶試紙或試劑進(jìn)行檢測(cè)。B.4.1.5綠膿菌素試驗(yàn)：取鑒定培養(yǎng)基上2個(gè)～3個(gè)可疑菌落，分別接種在綠膿菌素測(cè)定用培養(yǎng)基斜面，36℃±1℃培養(yǎng)24h，加入三氯甲烷3mL～5mL，充分振蕩使培養(yǎng)物中可能存在的綠膿菌素溶解，待三氯甲烷呈藍(lán)色時(shí)，用吸管移到另一試管中并加入1.0mol/L的鹽酸1mL，振蕩后靜置片刻。如上層出現(xiàn)粉紅色或紫紅色即為陽(yáng)性，表示有綠膿菌素存在。B.4.1.6硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)：取鑒定培養(yǎng)基上可疑菌落接種在硝酸鹽胨水培養(yǎng)基中，置36℃±1℃培養(yǎng)24h，培養(yǎng)基小倒管中有氣者即為陽(yáng)性。B.4.1.7明膠液化試驗(yàn)：取鑒定培養(yǎng)基上可疑菌落純培養(yǎng)物，穿刺接種在明膠培養(yǎng)基內(nèi)，置36℃±1℃培養(yǎng)24h，取出放于4℃~10℃,如仍呈液態(tài)為陽(yáng)性，凝固者為陰性。B.4.1.842℃生長(zhǎng)試驗(yàn)：取鑒定培養(yǎng)基上可疑培養(yǎng)物，接種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上，置42℃培養(yǎng)24h～48h，有銅綠假單胞菌生長(zhǎng)為陽(yáng)性。B.4.1.9其他檢驗(yàn)：使用生化鑒定試劑或生化鑒定卡的，依據(jù)商品試劑說明書對(duì)可疑菌落進(jìn)行鑒定。B.4.2結(jié)果報(bào)告被檢樣品經(jīng)增菌分離培養(yǎng)后，證實(shí)為革蘭陰性桿菌，氧化酶及綠膿菌素試驗(yàn)均為陽(yáng)性者，即可報(bào)告被檢樣品中檢出銅綠假單胞菌。如綠膿菌素試驗(yàn)陰性而液化明膠、硝酸鹽還原產(chǎn)氣和42℃生長(zhǎng)試驗(yàn)三者皆為陽(yáng)性時(shí)，仍可報(bào)告被檢樣品中檢出銅綠假單胞菌。B.5金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法B.5.1操作步驟B.5.1.1增菌培養(yǎng)：取樣液5.0mL，加入到50mLSCDLP培養(yǎng)液中，充分混勻，置36℃±1℃培養(yǎng)B.5.1.2分離培養(yǎng)：自上述增菌懸液中取1～2接種環(huán)，劃線接種BairdParker培養(yǎng)基（首選）或血瓊脂培養(yǎng)基，置36℃±1℃培養(yǎng)24h～48h。在BairdParker培養(yǎng)基上為圓形，光滑，凸起，濕潤(rùn)，直徑為2.0mm～3.0mm,顏色呈灰色到黑色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明帶，用接種針接觸菌落似有奶油樹膠的軟度。偶爾會(huì)遇到非脂肪溶解的類似菌落，但無混濁帶及透明帶。在血瓊脂平皿上典型菌落呈金黃色，大而突起，圓形，不透明，表面光滑，周圍有溶血圈。B.5.1.3染色鏡檢：挑取典型菌落，涂片作革蘭染色鏡檢，金黃色葡萄球菌為革蘭陽(yáng)性球菌，排列成葡萄狀，無芽孢與莢膜。鏡檢符合上列情況，還需進(jìn)行甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)和血漿凝固酶試驗(yàn)。B.5.1.4甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)：取血瓊脂平皿上典型菌落接種甘露醇培養(yǎng)液，置36℃±1℃培養(yǎng)24h，發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸者為陽(yáng)性。B.5.1.5血漿凝固酶試驗(yàn)（試管法）：吸取1:4新鮮血漿或凍干血漿生理鹽水溶液0.5mL，放滅菌小試管中，加入等量待檢菌24h肉湯培養(yǎng)物0.5mL，混勻，放36℃±1℃溫箱或水浴中，每30min觀察一次，24h之內(nèi)呈現(xiàn)凝塊即為陽(yáng)性。同時(shí)以已知血漿凝固酶陽(yáng)性和陰性菌株肉湯培養(yǎng)物各0.5mL作為陽(yáng)性與陰性對(duì)照。B.5.1.6其他檢驗(yàn)：使用生化鑒定試劑或生化鑒定卡的，依據(jù)商品試劑說明書對(duì)可疑菌落進(jìn)行鑒定。B.5.2結(jié)果報(bào)告凡在瓊脂平皿上有可疑菌落生長(zhǎng)，鏡檢為革蘭陽(yáng)性呈葡萄狀排列的球菌，并能發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸，血漿凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性者，可報(bào)告被檢樣品檢出金黃色葡萄球菌。B.6溶血性鏈球菌檢測(cè)方法B.6.1操作步驟B.6.1.2分離培養(yǎng)：將培養(yǎng)物劃線接種血瓊脂平皿，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h觀察菌落特征。溶血性鏈球菌在血瓊脂平皿上為灰白色，半透明或不透明，表面突起，圓形，表面光滑，邊緣整齊，周圍有無色透明β型溶血。B.6.1.3染色鏡檢：挑取典型菌落作涂片革蘭染色鏡檢，應(yīng)為革蘭陽(yáng)性，呈鏈狀排列的球菌。鏡檢符合上述情況，還需進(jìn)行鏈激酶試驗(yàn)和桿菌肽敏感試驗(yàn)。B.6.1.4鏈激酶試驗(yàn)：吸取草酸鉀血漿0.2mL（0.01g草酸鉀加5.0mL兔血漿混勻，經(jīng)離心沉淀，吸取上清液加入0.8mL滅菌生理鹽水，混勻后再加入待檢菌24h肉湯培養(yǎng)物0.5mL和0.25％氯化鈣0.25mL，混勻，放36℃±1℃水浴中，2min觀察一次（一般10min內(nèi)可凝固），待血察并記錄熔化時(shí)間。如2h內(nèi)不熔化，繼續(xù)放置24h觀察，如凝塊全部熔化為陽(yáng)性，24h仍不熔化為陰性(依據(jù)商品試劑說明書)。B.6.1.5桿菌肽敏感試驗(yàn)：將被檢菌懸液涂于血瓊脂平皿上，用滅菌鑷子取每片含0.04單位桿菌肽的紙片放在平皿表面上，同時(shí)以已知陽(yáng)性菌株作對(duì)照，在36℃±1℃下放置24h～48h，有抑菌帶者為陽(yáng)性。B.6.1.6其他檢驗(yàn)：使用生化鑒定試劑或生化鑒定卡的，依據(jù)商品試劑說明書對(duì)可疑菌落進(jìn)行鑒定。B.6.2結(jié)果報(bào)告鏡檢革蘭陽(yáng)性鏈狀排列球菌，血瓊脂平皿上呈現(xiàn)溶血圈，鏈激酶和桿菌肽試驗(yàn)陽(yáng)性，可報(bào)告被檢樣品檢出溶血性鏈球菌。B.7真菌菌落總數(shù)檢測(cè)方法B.7.1操作步驟按B.1得到的生理鹽水或中和劑樣液自然沉降后取上清液，如需要可進(jìn)行10倍系列稀釋。選擇適宜的稀釋度進(jìn)行真菌菌落計(jì)數(shù)。共接種2個(gè)平皿，每個(gè)平皿中加入2.0mL樣液，然后用冷卻至40℃~45℃熔化的沙堡弱瓊脂培養(yǎng)基或改良沙堡弱瓊脂培養(yǎng)基15mL～20mL倒入每個(gè)平皿內(nèi)混合均勻，瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平皿置25℃±1℃（沙堡弱瓊脂培養(yǎng)基）或28℃±1℃（改良沙堡弱瓊脂培養(yǎng)基）培養(yǎng)72h，分別于第24h、第48h、第72h觀察，計(jì)算平皿上的菌落數(shù)，如果發(fā)現(xiàn)菌落蔓延，以前一次的菌落計(jì)數(shù)為準(zhǔn)。B.7.2菌落計(jì)數(shù)菌落呈片狀生長(zhǎng)的平皿不應(yīng)采用；確保2塊平皿符合計(jì)數(shù)要求并進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，按公式(B.2)計(jì)算結(jié)果：Bt=…………（B.2）式中：Bt─真菌菌落總數(shù)，單位為每克菌落形成單位（CFU/g）或每毫升菌落形成單位（CFU/mL）；B0─2塊沙堡弱瓊脂培養(yǎng)基或改良沙堡弱瓊脂培養(yǎng)基平皿上的真菌菌落總數(shù)；K─稀釋倍數(shù)；2×2─2塊平皿，每塊平皿接種2.0mL樣液。當(dāng)菌落數(shù)小于或等于100CFUCFU/g或CFU/mL時(shí)，按實(shí)有數(shù)報(bào)告；當(dāng)大于100CFU/g或CFU/mL時(shí)采用二位有效數(shù)字；當(dāng)2塊沙堡弱瓊脂培養(yǎng)基或改良沙堡弱瓊脂培養(yǎng)基平皿上真菌菌落總數(shù)為0CFU時(shí)，如為固體應(yīng)報(bào)告真菌菌落總數(shù)小于5CFU/g，如為液體按稀釋倍數(shù)報(bào)告。B.7.3結(jié)果報(bào)告B.7.3.1如經(jīng)首次檢測(cè)，樣品菌落總數(shù)符合本文件的規(guī)定，直接按檢測(cè)結(jié)果報(bào)告。B.7.3.2如經(jīng)首次檢測(cè)，樣品菌落總數(shù)超過本文件的規(guī)定，應(yīng)用留存的備檢樣品依前法復(fù)測(cè)2次，然后才能報(bào)