響應(yīng)面優(yōu)化微波輔助提取花椒葉山椒素及其生物活性研究

摘要以花椒葉為原料，乙醇作為溶媒，研究花椒葉山椒素微波輔助提取工藝條件，采用響應(yīng)面法對工藝進(jìn)行優(yōu)化。以清除鐵還原力、羥基自由基(?OH)能力及2,2’-聯(lián)氨-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（ABTS）能力來評價(jià)體外抗氧化能力和α-淀粉酶活抑制率來評價(jià)其降血糖能力。結(jié)果表明，花椒葉山椒素最佳提取工藝條件為微波溫度25℃、微波時(shí)間10min、微波功率400W、料液比1：30（g/mL）、乙醇濃度58%、在此條件下花椒葉山椒素最高提取率為5.98mg/g?；ń啡~山椒素具有較強(qiáng)的抗氧化活性和降血糖能力，鐵還原力、清除?OH自由基能力、清除ABTS自由基能力和α-淀粉酶抑制率均表現(xiàn)出一定的質(zhì)量濃度依賴性；花椒葉山椒素鐵還原力、清除清除?OH、清除ABTS自由基能力和α-淀粉酶抑制率半數(shù)有效質(zhì)量濃度(IC50)分別為37.67、56.09、34.49和4.96μg/mL?；ń啡~山椒素可以作為一種天然食源性抗氧化和降血糖劑。引言花椒

(Zanthoxylumbungeanum

Maxim)，是蕓香科、花椒屬的一種藥用小灌木，其主要在四川、安徽、貴州等地生長?；ń肥俏覈赜械囊环N香料，含有揮發(fā)油、多酚、山椒素等生物活性物質(zhì)，具有抗腫瘤、抗氧化、抑菌和消炎等生物活性。山椒素是花椒中最具特征的一類酰胺類，是花椒麻味來源，以羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素和羥基-γ-山椒素為主，其具有麻醉鎮(zhèn)痛、消炎、保護(hù)腸道等功能，但其在高溫環(huán)境中很容易降解。花椒葉是花椒的主要副產(chǎn)物，資源豐富、產(chǎn)量大，為增加花椒產(chǎn)業(yè)的效益，迫切需要對副產(chǎn)物花椒葉的利用進(jìn)行深入的研究。但目前，對于花椒葉的報(bào)道主要集中在其多糖、揮發(fā)油及黃酮的提取及研究，還未見對花椒葉山椒素的報(bào)道。微波是一種非離子的電磁輻射，細(xì)胞壁在電磁波作用下容易發(fā)生裂解，使胞內(nèi)物質(zhì)更被提取出來。為了防止高溫對花椒葉山椒素的破壞，本實(shí)驗(yàn)建立室溫微波提取花椒葉山椒素方法，以抗氧化及降血糖為模型研究其生物活性，旨在為花椒葉的深加工提供參考。正文部分1

實(shí)驗(yàn)部分1.1

主要儀器與試劑1.2

實(shí)驗(yàn)方法1.2.1

花椒葉山椒素的提取1.2.2

花椒葉山椒素的提取率1.3

單因素試驗(yàn)1.3.1

乙醇濃度對花椒葉山椒素提取率的影響精確稱取20g花椒葉粉，分別加入400mL0%、20%、40%、60%、80%、100%

乙醇溶液（料液比1:20（g/mL），在25℃下，300W微波提取10min。1.3.2

微波時(shí)間對花椒葉山椒素提取率的影響精確稱取20g花椒葉粉，加入400mL40%乙醇溶液（料液比1:20（g/mL）），在25℃下，300W微波分別提取5、10、15、20、25、30min。1.3.3

微波功率對花椒葉山椒素提取率的影響精確稱取20g花椒葉粉，加入400mL40%乙醇溶液（料液比1:20（g/mL）），在25℃下，分別在0、100、200、300、400和500W微波提取10min。1.3.4

料液比對花椒葉山椒素提取率的影響精確稱取20g花椒葉粉，分別以料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30（g/mL）的比例加入40%乙醇溶液，在50℃下，300W微波分別提取10min。1.4

響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)，采用Box-Behnken響應(yīng)面法，將乙醇濃度、微波時(shí)間和微波功率設(shè)為自變量，花椒葉山椒素提取率設(shè)響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)因素和水平實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。優(yōu)化實(shí)驗(yàn)因素水平見表1。1.5

花椒葉山椒素抗氧化能力測定以鐵還原力、?OH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力模型來評價(jià)花椒葉山椒素抗氧化能力，以同等質(zhì)量濃度的VC溶液作為對照品。1.6

花椒葉山椒素降血糖能力測定評價(jià)花椒葉山椒素降血糖能力，以同等質(zhì)量濃度的二甲雙胍溶液作為對照品。

2

結(jié)果與討論2.1

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1.1

乙醇濃度對花椒葉山椒素提取率的影響如圖1所示，花椒葉山椒素提取率隨著乙醇濃度的升高呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。2.1.2

微波時(shí)間對花椒葉山椒素提取率的影響如圖2所示，隨著微波時(shí)間的升高，花椒葉山椒素提取率呈先升高后降低的趨勢。2.1.3

微波功率對花椒葉山椒素提取率的影響微波可以產(chǎn)生很高的輻照能量，促進(jìn)溶媒對植物細(xì)胞的穿透能力。此外，微波還能形成磁場可促進(jìn)物質(zhì)與溶媒之間的相互作用，微波可以使細(xì)胞壁破裂和增加物質(zhì)的溶解度，也可顯著提高提取物的擴(kuò)散速率。如圖3所示，隨著微波功率升高，花椒葉山椒素提取率也逐漸升高，當(dāng)微波功率達(dá)到400W時(shí)，山椒素提取率最高。2.1.4

料液比對花椒葉山椒素提取率的影響由圖4可知，花椒葉山椒素提取率隨著料液比的增大呈現(xiàn)出先增大后降低的趨勢，當(dāng)料液比為1∶20（g/mL）時(shí)，山椒素提取率達(dá)到最大。2.2

響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.2.1

響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及方差分析利用DesignExpert8.0軟件對表2中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合分析和方差分析2.2.2

各因素之間的交互作用微波功率、微波時(shí)間和乙醇濃度三者之間交互作用可依據(jù)等高線曲面的陡度及等高線的形狀來判定交互作用是否顯著，如圖5所示。2.2.3

響應(yīng)面模型驗(yàn)證由上述回歸擬合方程可以得到最佳花椒葉山椒素提取工藝參數(shù)結(jié)果為：微波功率402.57W、微波時(shí)間10.01min、乙醇濃度58.40%，在此條件下花椒葉山椒素提取率為6.04mg/g。2.3

花椒葉山椒素抗氧化能力測定2.3.1

鐵還原力測定鐵還原力是最常用的抗氧化活性的方法，可以直接反應(yīng)總抗氧化能力的大小。由圖6可知，相同濃度下花椒葉山椒素的抗氧化能力不及VC。2.3.2

?OH自由基清除力測定由圖7可知，當(dāng)濃度低于100μg/mL時(shí)，相同濃度下花椒葉山椒素的抗氧化能力不及VC?；ń啡~山椒素濃度達(dá)到100μg/mL時(shí)，鐵還原力達(dá)到最大，為86.11%，此濃度與80μg/mL的VC抗氧化能力相當(dāng)，表明花椒葉山椒素具有較強(qiáng)的抗氧化能力。2.3.3

ABTS自由基清除力測定ABTS自由基清除力基于抗氧化劑可提供電子或氫原子滅活自由基，導(dǎo)致ABTS溶液顏色發(fā)生變化的一種方法，常用于抗氧化能力的測定。由圖8可知，相同濃度下花椒葉山椒素的抗氧化能力不及VC。2.4

花椒葉山椒素降血糖能力測定α-淀粉酶是人體中消化淀粉等糖類化合物的關(guān)鍵酶，抑制酶活可以減少分解淀粉等糖類化合物成單糖，從而達(dá)到飯后血糖的降低。由圖9可知，相同濃度下花椒葉山椒素的α-淀粉酶抑制率均低于二甲雙胍。3

結(jié)論結(jié)論本實(shí)驗(yàn)以花椒葉為原料，乙醇作為溶媒，通過單因素實(shí)驗(yàn)考察了微波時(shí)間、微波功率、料液比和乙醇濃度對花椒葉山椒素的微波提取的影響，選擇乙醇濃度、微波時(shí)間和微波功率3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化花椒葉山椒素微波輔助提取工藝條件，最終得到最佳的花椒葉山椒素微波輔助提取工藝條件為微波溫度25℃、微波時(shí)間10min、微波功率400W、料液比1：30（g/mL）、乙醇濃度58%，在此條件下花椒葉山椒素最高提取率為5.98mg/g。采用了3種體外抗氧化模型（鐵還原力模型、?OH自由基清除力模型及ABTS清除力模型）和體外α-淀粉酶抑制率來評價(jià)花椒葉山椒素的抗氧化能力和抗糖化能力。表明花椒葉山椒素具有較強(qiáng)的抗氧化活性和降血糖能力，鐵還原力、清除?OH自由基能力、清除ABTS自由基能力及α-淀粉酶抑制