蘆丁與彈性蛋白酶相互作用的研究

摘要天然產(chǎn)物蘆丁（Rutin）可以抑制彈性蛋白酶的活性，采用多光譜法與分子對(duì)接技術(shù)研究蘆丁與彈性蛋白酶（PPE）的相互作用。研究結(jié)果表明，Rutin對(duì)PPE存在熒光猝滅效應(yīng)，且為靜態(tài)猝滅。Rutin與PPE能形成1∶1復(fù)合物，在298

K下其結(jié)合常數(shù)為4.90×104

L/mol，主要結(jié)合力為氫鍵和范德華力。根據(jù)F?rster's非輻射能量轉(zhuǎn)移理論，計(jì)算得到Rutin與PPE的結(jié)合距離r為4.55

nm。紫外光譜與同步熒光光譜結(jié)果表明，Rutin可使PPE周圍微環(huán)境發(fā)生改變，極性增加、親水性增加和疏水性減弱。傅里葉變換紅外光譜與圓二色光譜分析表明，Rutin使PPE的α-螺旋、β-折疊含量降低，酶結(jié)構(gòu)變得松散，改變了PPE的二級(jí)結(jié)構(gòu)。分子對(duì)接模擬表明，Rutin與PPE距離在0.4nm之內(nèi)的氨基酸殘基共有11個(gè)，共形成5條氫鍵，同時(shí)還有強(qiáng)大的范德華力與π-陽(yáng)離子相互作用，多種作用力使Rutin與PPE形成穩(wěn)定的復(fù)合物，抑制了彈性蛋白酶的活性。引言目前，心腦血管疾病嚴(yán)重威脅著人類生命健康，已成為世界大多數(shù)國(guó)家三大死亡原因之一[1]，研究表明，炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等因素的持續(xù)性存在可導(dǎo)致患者引發(fā)心腦血管疾病，彈性蛋白酶（Elastase，PPE）是一種蛋白水解酶，其水解作用為持續(xù)性、破壞性的，該酶已成為抗炎藥物篩選的較佳酶靶。炎癥刺激會(huì)導(dǎo)致白細(xì)胞釋放彈性蛋白酶，彈性蛋白酶過(guò)度表達(dá)時(shí)會(huì)對(duì)機(jī)體組織、基質(zhì)造成嚴(yán)重危害，表現(xiàn)為破壞血管中彈性蛋白，從而破壞血管，使組織液更容易滲出，繼而導(dǎo)致心腦血管疾病。早年常以天然產(chǎn)物蘆丁作為主要原料，制成藥物后應(yīng)用于心腦血管類疾病的治療，蘆丁是一種天然黃酮類化合物，來(lái)源廣泛，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗血小板凝集、增加毛細(xì)血管韌性，保護(hù)心腦血管等多種藥理活性。蘆丁具有多個(gè)苯環(huán)、雜環(huán)結(jié)構(gòu)和較長(zhǎng)的共軛體系，以及多羥基結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)如下圖。煙臺(tái)大學(xué)陳立平等[7]研究表明蘆丁對(duì)彈性蛋白酶有很好的抑制效果，按其實(shí)驗(yàn)方法，天然產(chǎn)物蘆丁對(duì)彈性蛋白酶的抑制率可達(dá)50.68%。即可以抑制彈性蛋白酶活性，減少?gòu)椥缘鞍酌笇?duì)心腦血管的危害，從而保護(hù)心腦血管。對(duì)于在分子層面上解釋蛋白質(zhì)與小分子的相互作用的研究，常采用光譜學(xué)手段與分子對(duì)接技術(shù)，如蘆丁與人血清白蛋白相互作用機(jī)制的研究，但蘆丁與彈性蛋白酶間的相互作用研究暫未見(jiàn)報(bào)道。為探究蘆丁與彈性蛋白酶的相互作用機(jī)制以及構(gòu)效關(guān)系，本文通過(guò)光譜法分析蘆丁與彈性蛋白酶的相互作用的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)、猝滅類型、作用力、作用距離、構(gòu)象變化以及彈性蛋白酶與蘆丁之間的能量轉(zhuǎn)移。通過(guò)分子對(duì)接模擬了蘆丁與PPE的相互作用，對(duì)蘆丁與彈性蛋白酶的相互作用機(jī)理作了初步探討，并為抗炎活性藥物——彈性蛋白酶抑制劑的研究提供參考。正文部分1

實(shí)驗(yàn)部分1.1

主要儀器與試劑1.2

實(shí)驗(yàn)方法1.2.1

熒光光譜與同步熒光光譜的測(cè)定1.2.2

紫外可見(jiàn)吸收光譜的測(cè)定1.2.3

傅里葉變換紅外光譜的測(cè)定1.2.4

圓二色光譜的測(cè)定1.2.5

分子對(duì)接模擬2

結(jié)果與討論2.1

Rutin與PPE的熒光猝滅光譜及機(jī)制圖1為298

K溫度下不同濃度的Rutin與一定濃度的PPE作用熒光發(fā)射光譜圖，PPE在激發(fā)波長(zhǎng)280

nm處，發(fā)射波長(zhǎng)336

nm處產(chǎn)生最大熒光發(fā)射峰。隨著Rutin濃度的逐漸增加，PPE的熒光強(qiáng)度逐漸下降，但發(fā)射峰的位置僅發(fā)生極微小變化，說(shuō)明Rutin對(duì)PPE的熒光具有猝滅作用。2.2

Rutin與PPE作用的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的計(jì)算2.3

Rutin與PPE熱力學(xué)參數(shù)與作用力類型判斷2.4

Rutin與PPE體系的能量轉(zhuǎn)移及結(jié)合距離的測(cè)定2.5

Rutin對(duì)PPE二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響2.5.1

Rutin對(duì)PPE作用的紫外光譜的分析在298K溫度下，測(cè)量在PPE中加入Rutin反應(yīng)前后的紫外吸收光譜，如圖3所示。2.5.2

Rutin對(duì)PPE作用的同步熒光光譜的分析2.5.3

Rutin對(duì)PPE作用的紅外光譜的分析2.5.4

Rutin對(duì)PPE作用的圓二色光譜的分析2.5.5

PPE與Rutin的分子對(duì)接模擬3

結(jié)論結(jié)論本文研究了蘆丁與彈性蛋白酶的相互作用，由光譜研究結(jié)果得出結(jié)論，Rutin對(duì)PPE的熒光猝滅類型為靜態(tài)猝滅，結(jié)合比例為1∶1，結(jié)合距離為4.55nm，且發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移。根據(jù)熱力學(xué)方程計(jì)算，證明二者間發(fā)生作用，作用類型為自發(fā)、放熱過(guò)程，且主要為氫鍵及范德華力。通過(guò)紫外光譜、紅外光譜、同步熒光光譜分析，Rutin與PPE發(fā)生了相互作用，影響了PPE的周圍微環(huán)境，使極性增加、親水性增加和疏水性減弱，改變了PPE的二級(jí)結(jié)構(gòu)。同時(shí)，圓二色光譜數(shù)據(jù)也表明，Rutin使PPE的α-螺旋及β-折疊降低，PPE結(jié)構(gòu)更加松散。分子對(duì)接模擬中Rutin與PPE之間存在氫鍵作用、范德華力，這與光譜分析所得結(jié)論一致。氫鍵與Rutin的多羥基結(jié)構(gòu)有關(guān)，Rutin較長(zhǎng)的π-π共軛結(jié)構(gòu)使得范德華作用力更加廣泛，此外