LC-MS方法分析皮膚表面鞘脂的組成

背景介紹鞘脂（Sphingolipids）以鞘氨醇骨架為基本結(jié)構(gòu)，是表皮中功能最豐富的一類脂質(zhì)，在表皮屏障的形成和結(jié)構(gòu)中起基礎(chǔ)性作用。其中，神經(jīng)酰胺是皮膚屏障的重要組成成分，約占角質(zhì)層脂質(zhì)含量的50%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），能防止表皮失水和環(huán)境中有害物質(zhì)的滲透。因此，對(duì)皮膚表面鞘脂進(jìn)行全面分析對(duì)于評(píng)估皮膚狀態(tài)和屏障功能具有重要意義。目前，已經(jīng)建立了皮膚表面神經(jīng)酰胺等特定鞘脂類物質(zhì)的高通量分析方法，但對(duì)皮膚鞘脂的全面分析尚未見報(bào)道。

文章亮點(diǎn)采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)建立女性皮膚表面鞘脂全面分析的新方法，并應(yīng)用于青、中年女性皮膚鞘脂的相對(duì)含量比較；探究鞘脂在皮膚衰老過程中的可能生理機(jī)制；為皮膚鞘脂的全面分析提供新方法，也對(duì)皮膚衰老機(jī)制的探索及相關(guān)抗衰老護(hù)膚品的研發(fā)提供理論依據(jù)。內(nèi)容介紹1樣品前處理方法的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)中前處理方法對(duì)皮膚樣品中的鞘脂前處理方法進(jìn)行優(yōu)化。考察了不同提取溶劑體積（取文獻(xiàn)方法提取溶劑體積的1/4、1/2、1、2、4倍）以及不同取樣次數(shù)（2、3、4、5次）的影響。2皮膚表面鞘脂成分的鑒定根據(jù)鞘脂的結(jié)構(gòu)特征，通過一級(jí)分子式匹配和二級(jí)質(zhì)譜結(jié)構(gòu)解析，在女性前臂皮膚上一共鑒定得到108個(gè)鞘脂。其中包括16個(gè)鞘氨醇（Sa）、18個(gè)雙氫鞘氨醇（So）、65個(gè)神經(jīng)酰胺（Cer）、8個(gè)1-磷酸神經(jīng)酰胺（CerP）和1個(gè)磷酰鞘脂（PN-Cer）。對(duì)不同表皮層數(shù)的脂質(zhì)進(jìn)行檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)，鞘磷脂和葡萄糖神經(jīng)酰胺在皮膚表面的含量極低、甚至為零，而本實(shí)驗(yàn)在皮膚表面鞘脂的鑒定時(shí)，也未發(fā)現(xiàn)這兩類物質(zhì)。鞘氨醇?jí)A的鑒定以Sa(d25:0)為例（圖1a），其[M+H]+通過依次丟失H2O得到m/z

382.4038和m/z

364.3934兩個(gè)特征碎片，在此基礎(chǔ)上丟失HCHO產(chǎn)生的m/z

352.3943碎片離子也可輔助證明該鞘氨醇結(jié)構(gòu)中含有兩個(gè)羥基。神經(jīng)酰胺的鑒定主要基于其鞘氨醇骨架產(chǎn)生的特征碎片，以Cer(t17:0/26:0)為例（圖1b）。圖1

代表性皮膚表面鞘脂的MS/MS圖譜Fig.1

MS/MSspectraofrepresentativeskinsurfacesphingolipids3多元變量統(tǒng)計(jì)分析在青、中年組女性前臂鞘脂的比較研究中，通過OPLS-DA分析（圖2a）得到各個(gè)特征離子的VIP值，再由Student’s的t檢驗(yàn)計(jì)算各特征離子豐度在兩組間的顯著性差異。篩選VIP值＞1、且p值＜0.01的特征離子作為差異性代謝物，并繪制了差異性鞘脂在兩組中相對(duì)含量的熱圖。由圖3可知，青、中年組之間共找出了43種差異性鞘脂。與青年組相比，中年組中So、Cer、CerP和部分Sa的含量升高，而部分Sa含量呈下降趨勢。隨后，采用PCA方法來驗(yàn)證所篩選的差異性鞘脂對(duì)兩組區(qū)分的效果。圖2b中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣本，可發(fā)現(xiàn)所有樣本均處于置信區(qū)域內(nèi)，青、中年組之間顯示出明顯的分離情形，PC1和PC2的貢獻(xiàn)率分別占79.1%和8.0%，對(duì)于組間分離具有較高的貢獻(xiàn)率。圖2

多元變量統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果Fig.2

Resultsofmultivariatestatisticalanalysis圖3

青年組（Y）與中年組（M）的差異性鞘脂相對(duì)含量熱圖Fig.3

Heatmapbasedonthenormalizedrawabundanceofdifferentialsphingolipidsofyoung(Y)and

middle-aged

group(M)4結(jié)論本文建立了一種基于UPLC-Q-TOF-MS的鞘脂全面分析方法，對(duì)不同年齡女性前臂皮膚表面的108個(gè)鞘脂進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，并對(duì)不同種類代表性鞘脂的碎裂機(jī)理進(jìn)行了細(xì)致討論。將該方法應(yīng)用于青、中年組女性皮膚鞘脂的檢測，結(jié)合多元變量統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)兩組鞘脂變化呈明