《飼料及飼料原料中玉米赤霉烯酮的快速篩查 膠體金快速定量法-江西省地方標(biāo)準(zhǔn)編制說(shuō)明》

一、標(biāo)準(zhǔn)制定意義

（一）介紹

玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)為一種白色結(jié)晶，又稱F-2毒素，是由禾谷鐮刀菌等

菌種產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物。1962年Stob等首先從發(fā)霉的玉米中分離得到了該毒素，命名為

玉米赤霉烯酮；1966年Urry首次闡明了該毒素的結(jié)構(gòu)，并將此結(jié)構(gòu)命名為F-2毒素，后又

被改稱為ZEN。ZEN為白色晶體，分子式C18H22O5，化學(xué)名為6-(10-羥基-6氧基-1-碳烯基)β-

雷瑣酸-μ-內(nèi)酯[6-(10-hydroxy-6-OXO-trans-1-undeceny)β-resorcylicacidlactone]，熔點(diǎn)

164~165℃，紫外線光譜最大吸收為236nm、274nm和316nm。紅外線光譜最大吸收為970nm，

其甲醇溶液在254nm短紫外光照射下呈明亮的綠-藍(lán)色熒光。ZEN不溶于水，溶于堿性水溶

液、乙醚、苯、氯仿、乙酸乙酯、甲醇及乙醇等。在植物體內(nèi)，ZEN主要代謝產(chǎn)生α-玉米赤

霉烯醇(α-Zearalenol，a-ZOL)。在動(dòng)物及人體內(nèi)，除了可以代謝產(chǎn)生α-ZOL外，ZEN還可代

謝產(chǎn)生β-玉米赤霉烯醇(β-zearalenol，β-ZOL)，α-ZOL和β-ZOL又可以相互轉(zhuǎn)化并進(jìn)一步代

謝產(chǎn)生α-玉米赤霉醇(zeranol，α-zearalanol，ZAL)及β-玉米赤霉醇(Taleranol，β-Zearalanol，

TAL)，而ZAL、TAL以及玉米赤霉醇(zearalanone，ZAN)又可相互轉(zhuǎn)化。

ZEN主要污染玉米、高粱、小麥、大麥等糧谷類(lèi)作物及其制品。Toshitsugu對(duì)19個(gè)國(guó)

家和地區(qū)的谷物、食品及飼料中所含的ZEN進(jìn)行了調(diào)查發(fā)現(xiàn)，包括中國(guó)、阿根廷、加拿大、

波蘭及也門(mén)等眾多國(guó)家和地區(qū)的樣品均有不同程度的污染。借助被污染的乳制品、肉制品等

動(dòng)物源性食品，ZEN及其代謝產(chǎn)物可以進(jìn)入人體，給人類(lèi)的健康造成威脅。ZEN對(duì)動(dòng)物及

人類(lèi)危害主要表現(xiàn)在影響和破壞生長(zhǎng)發(fā)育及生殖系統(tǒng)方面，人畜誤食含有該毒素的食物后，

會(huì)引起雌性激素中毒癥，造成生殖系統(tǒng)的嚴(yán)重?fù)p傷。此外，ZEN及其衍生物對(duì)肝臟系統(tǒng)、

免疫系統(tǒng)均有很大的危害，并且有引發(fā)腫瘤的可能性。SchoentalR在進(jìn)行致癌試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，

試驗(yàn)組大鼠出現(xiàn)由致癌劑處理而誘發(fā)的腫瘤；此外，試驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠還發(fā)生了乳腺纖維

瘤、腺瘤、腺癌、垂體腺癌、睪丸間質(zhì)腫瘤以及子宮纖維瘤等。在其他致癌試驗(yàn)中也有類(lèi)似

情況發(fā)生，這些腫瘤所涉及的器官表明，它們可能與動(dòng)物飼料中的雌激素物質(zhì)有關(guān)。因此認(rèn)

為，它們是由污染飼料的ZEN或其代謝產(chǎn)物引起的。

（二）背景

據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）統(tǒng)計(jì)，全世界每年谷物產(chǎn)量的25%受到真菌毒素不同程度的

污染。隨著飼料工業(yè)的快速發(fā)展，近年來(lái)，中國(guó)的飼料也受到霉菌污染的嚴(yán)重挑戰(zhàn)。自2006

年以來(lái)，玉米等飼料原料價(jià)格普遍上漲，致使很多飼料企業(yè)及養(yǎng)殖戶使用低質(zhì)飼料原料，加

上近年來(lái)氣候的變化，華北、東北地區(qū)降雨量增加，進(jìn)一步加重了飼料原料中真菌毒素的污

染。而由于飼料原料和配合飼料中多種真菌毒素同時(shí)存在，在食用油等產(chǎn)品及牛奶中真菌毒

素污染也比較嚴(yán)重。在世界許多地方，目前真菌毒素已構(gòu)成重要的食品安全問(wèn)題。

真菌毒素對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物健康可產(chǎn)生嚴(yán)重的影響，這一認(rèn)識(shí)導(dǎo)致了許多國(guó)家在近幾十年來(lái)

制定了諸多有關(guān)食品和飼料中真菌毒素的法規(guī)，以保護(hù)人類(lèi)的健康，并保障生產(chǎn)者和貿(mào)易商

的經(jīng)濟(jì)利益。隨著全球經(jīng)濟(jì)一體化的進(jìn)程，類(lèi)似真菌毒素等涉及安全衛(wèi)生項(xiàng)目的限量標(biāo)準(zhǔn)，

越來(lái)越多地被利用為貿(mào)易保護(hù)主義中非關(guān)稅壁壘的重要手段。因此，為了保證食品安全，保

障消費(fèi)者的健康，為了打破國(guó)外的技術(shù)壁壘，同時(shí)在合理有利的前提下，更多地樹(shù)立我國(guó)的

技術(shù)性壁壘，開(kāi)展飼料中真菌毒素的檢測(cè)并建立標(biāo)準(zhǔn)方法是有效的方法之一。目前國(guó)內(nèi)應(yīng)用

1

標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法大多為儀器方法，所需儀器設(shè)備昂貴，不利于進(jìn)行廣泛推廣，并且限制了很多

檢測(cè)單位高效、廣泛地開(kāi)展檢測(cè)工作。建立符合中國(guó)國(guó)情的快速檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)，具有檢測(cè)快

速、簡(jiǎn)便、靈敏、成本低等優(yōu)點(diǎn)，為打開(kāi)市場(chǎng)并占領(lǐng)市場(chǎng)提供了先決條件。

（三）限量標(biāo)準(zhǔn)、檢測(cè)方法及研究現(xiàn)狀

1、限量標(biāo)準(zhǔn)

目前大多數(shù)國(guó)家對(duì)食品、谷物、飼料中的玉米赤霉烯酮含量都有十分嚴(yán)格的規(guī)定。例如

澳大利亞規(guī)定谷物中玉米赤霉烯酮的含量不能超過(guò)0.05mg/kg；意大利規(guī)定在谷物和谷類(lèi)產(chǎn)

品中玉米赤霉烯酮的含量不能超過(guò)0.1mg/kg；而在法國(guó)，植物油和谷類(lèi)當(dāng)中玉米赤霉烯酮

的含量必須低于0.2mg/kg。中國(guó)則規(guī)定飼料、玉米中的玉米赤霉烯酮含量不得超過(guò)500μg/kg。

表1我國(guó)飼料中的玉米赤霉烯酮限量標(biāo)準(zhǔn)

產(chǎn)品名稱限量/(μg/kg)

配合飼料、玉米≤500

2、檢測(cè)方法及研究現(xiàn)狀

玉米赤霉烯酮的分析測(cè)定一般采用薄層色譜法(TLC)、酶聯(lián)吸附免疫法(ELISA)和高效

液相色譜法(HPLC)。TLC法繁瑣費(fèi)時(shí)，且靈敏度、特異性較差，提取過(guò)程中所需有機(jī)溶劑

品種多且量大，易污染環(huán)境，對(duì)人體有較大危害。而ELISA法測(cè)定結(jié)果受試劑盒差異、實(shí)

驗(yàn)溫度、儀器靈敏度等條件影響較大，重復(fù)性差，假陽(yáng)性率高，難以達(dá)到相關(guān)技術(shù)要求。常

規(guī)的HPLC法雖然比TLC靈敏度高，但由于樣品前處理手續(xù)繁瑣，操作復(fù)雜，也難以推廣。

以上幾種方法均耗時(shí)較長(zhǎng)，而隨著商品經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們對(duì)時(shí)間概念的加強(qiáng)，無(wú)論是商家還

是政府部門(mén)對(duì)檢測(cè)時(shí)間的要求越來(lái)越高，而膠體金試紙條作為一種快速檢測(cè)技術(shù)，能很好地

解決這個(gè)問(wèn)題，提高檢測(cè)效率，縮減檢測(cè)時(shí)間。

（四）制定標(biāo)準(zhǔn)的必要性和意義

1、提高農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量的需要

玉米赤霉烯酮是由產(chǎn)毒真菌產(chǎn)生的代謝物，廣泛存在于糧油食品和飼料中。這些產(chǎn)毒真

菌分布于各級(jí)食物鏈，即使是在現(xiàn)今擁有先進(jìn)的農(nóng)業(yè)技術(shù)和食品加工工藝的條件下，在作物

種植、收獲、儲(chǔ)藏和加工過(guò)程中，仍然無(wú)法避免和防止產(chǎn)毒真菌的危害。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)快速

發(fā)展，人民群眾物質(zhì)文化生活水平不斷提高，對(duì)食品安全的關(guān)注進(jìn)一步提高，迫切需要相應(yīng)

的檢測(cè)技術(shù)，鑒于傳統(tǒng)檢測(cè)方法的專(zhuān)業(yè)性要求高和成本昂貴的缺點(diǎn)，玉米赤霉烯酮快速檢測(cè)

技術(shù)的研究及制訂相應(yīng)的檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)是非常必要的。

2、實(shí)現(xiàn)以人為本，保證廣大群眾生命健康的需要

玉米赤霉烯酮毒性很高，可通過(guò)污染谷物和那些來(lái)源于被玉米赤霉烯酮污染了的飼料喂

飼的動(dòng)物性食物（如牛奶、肉和蛋）而進(jìn)入食物鏈，危害人類(lèi)健康。其具有致突變、致癌性，

還具有免疫毒性，其作用的靶器官主要為肝臟，可引起人類(lèi)和動(dòng)物的肝臟病變和致癌。為了

對(duì)國(guó)家、人民高度負(fù)責(zé)，保障人民生命安全和農(nóng)村社會(huì)穩(wěn)定，研究玉米赤霉烯酮快速檢測(cè)技

術(shù)并制訂相應(yīng)的檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)是非常必要的。

3、適應(yīng)市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)和加入WTO新形勢(shì)的需要

2

我國(guó)已經(jīng)加入WTO，我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品已面臨國(guó)際和國(guó)內(nèi)兩個(gè)市場(chǎng)，為我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品（勞動(dòng)密

集型）進(jìn)入國(guó)際市場(chǎng)提供了很好的機(jī)遇，但國(guó)際上十分重視農(nóng)產(chǎn)品的安全問(wèn)題，而農(nóng)產(chǎn)品易

于被真菌污染，可能存在玉米赤霉烯酮等真菌毒素殘留問(wèn)題，這已成為影響出口創(chuàng)匯的最大

制約因素。由于毒素殘留超標(biāo)，引起外國(guó)拒收，退貨、扣留、索賠、撤消合同等事件經(jīng)常發(fā)

生，給我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)者造成很大損失，并影響了我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品的形象。為了從源頭保證農(nóng)產(chǎn)

品質(zhì)量，提高我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品的競(jìng)爭(zhēng)力，研究玉米赤霉烯酮快速檢測(cè)技術(shù)并制訂相應(yīng)的檢測(cè)方法

標(biāo)準(zhǔn)是非常必要的。

二、標(biāo)準(zhǔn)制定過(guò)程

《飼料原料中玉米赤霉烯酮的快速篩查膠體金免疫層析法》標(biāo)準(zhǔn)由江西省獸藥飼料監(jiān)

察所、北京勤邦生物技術(shù)有限公司、雙胞胎（集團(tuán)）股份有限公司、江西正邦科技股份有限

公司負(fù)責(zé)起草編寫(xiě)。根據(jù)國(guó)家有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制定和修訂工作的要求，標(biāo)準(zhǔn)起草單位在《飼料原料

中玉米赤霉烯酮的快速篩查膠體金免疫層析法》的起草編制過(guò)程中，主要工作包括以下幾

個(gè)方面：

（1）詳細(xì)查閱了國(guó)內(nèi)、國(guó)外有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)專(zhuān)業(yè)期刊上發(fā)表過(guò)的參考文獻(xiàn)等技術(shù)資料，

并對(duì)這些資料進(jìn)行了詳細(xì)的對(duì)比，從方法的先進(jìn)性、可靠性和實(shí)用性等幾個(gè)方面考慮，選取

了幾個(gè)代表性的參考資料作為標(biāo)準(zhǔn)起草中的主要技術(shù)參考文本。

（2）及時(shí)購(gòu)置相關(guān)的實(shí)驗(yàn)試劑、標(biāo)準(zhǔn)品和其他材料；已將玉米赤霉烯酮與1,3-丙二胺

反應(yīng)得到具有氨基官能團(tuán)的半抗原；將玉米赤霉烯酮半抗原與牛血清白蛋白和卵清蛋白分別

進(jìn)行偶聯(lián)得到免疫原和包被原；已將制備獲得的抗原通過(guò)免疫小鼠獲得玉米赤霉烯酮單克隆

抗體；建立了膠體金免疫層析法的反應(yīng)體系，摸索不同條件對(duì)方法進(jìn)行最優(yōu)化，最終確定了

最佳的檢測(cè)方法。

（3）開(kāi)展多種飼料原料膠體金快速檢測(cè)方法的試驗(yàn)，包括小麥、大米、黃豆、玉米、

豆粕、花生粕、DDGS，這是方法的重要步驟和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。不同樣品用同一種方法進(jìn)行試驗(yàn)

和驗(yàn)證，確保本檢測(cè)方法能夠靈敏、特異、準(zhǔn)確地檢測(cè)出飼料原料中玉米赤霉烯酮的含量。

如：方法的靈敏度，按照空白飼料原料樣品及25μg/kg、50μg/kg、100μg/kg、200μg/kg四種

濃度對(duì)飼料原料進(jìn)行添加，確定檢測(cè)限；方法的準(zhǔn)確率，通過(guò)對(duì)經(jīng)驗(yàn)證的陰陽(yáng)性樣品進(jìn)行檢

測(cè)，得到本檢測(cè)方法的假陰性率和假陽(yáng)性率，盲樣測(cè)定與儀器方法的結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，確保本

方法的檢測(cè)結(jié)果可靠；方法的特異性，運(yùn)用本方法對(duì)飼料原料中常見(jiàn)的其他真菌毒素進(jìn)行檢

測(cè)，確保本方法能特異性地檢測(cè)飼料原料中玉米赤霉烯酮?dú)埩簟?/p>

（4）在技術(shù)指標(biāo)完成試驗(yàn)工作之后，嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)的格式，起草編寫(xiě)標(biāo)準(zhǔn)文本內(nèi)容和

編制說(shuō)明內(nèi)容。

三、標(biāo)準(zhǔn)制定依據(jù)

本標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫(xiě)》、GB/T

20001.4-2015《標(biāo)準(zhǔn)編寫(xiě)規(guī)則第4部分：試驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)》的要求而進(jìn)行編寫(xiě)的。有關(guān)技術(shù)

內(nèi)容是在參考國(guó)外有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上經(jīng)研究、改進(jìn)和驗(yàn)證后制定的。

四、標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)內(nèi)容和技術(shù)指標(biāo)的論證

3

（一）技術(shù)原理

本方法應(yīng)用了競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫層析原理。將氯金酸用還原法制成一定直徑的金溶膠顆粒，

標(biāo)記抗體。硝酸纖維素膜為載體，利用了微孔膜的毛細(xì)管作用，滴加在膜條一端的液體慢慢

向另一端滲移。在移動(dòng)的過(guò)程中，會(huì)發(fā)生相應(yīng)的抗原抗體反應(yīng)，并通過(guò)免疫金的顏色而顯示

出來(lái)。樣本中的玉米赤霉烯酮在流動(dòng)的過(guò)程中與膠體金標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合，抑制了抗體

和硝酸纖維素（NC）膜檢測(cè)線上玉米赤霉烯酮-BSA偶聯(lián)物的結(jié)合，使檢測(cè)線不顯顏色，結(jié)

果為陽(yáng)牲；反之，檢測(cè)線顯紅色，結(jié)果為陰性。

（二）膠體金免疫方法主要材料的制備

1、半抗原的合成及鑒定

玉米赤霉烯酮為小分子物質(zhì)，不具備免疫原性，只有反應(yīng)原性，因此需要與大分子共價(jià)

結(jié)合后才能使動(dòng)物免疫系統(tǒng)識(shí)別，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，本實(shí)驗(yàn)首先需要合成小分子半抗原與蛋

白質(zhì)偶聯(lián)的人工抗原。

玉米赤霉烯酮小分子半抗原的制備既要保留其基本結(jié)構(gòu)特征，同時(shí)又要很好地與大分子

蛋白結(jié)合。本項(xiàng)目通過(guò)玉米赤霉烯酮小分子結(jié)構(gòu)改造獲得具有氨基官能團(tuán)的半抗原，與牛血

清白蛋白（BSA）偶聯(lián)合成免疫原，與卵清蛋白（OVA）偶聯(lián)合成包被原。

將玉米赤霉烯酮與1,3-丙二胺反應(yīng)得到具有氨基官能團(tuán)的半抗原，合成路線如下：

取玉米赤酶烯酮32mg，1,3-丙二胺0.1mL及少量4-二甲氨基吡啶加入5mL干燥的二甲

基甲酰胺中，作為A液；取N,N’-二環(huán)己基碳二亞胺40mg溶解于1mL干燥的二甲基甲酰胺，

作為B液；0℃條件下緩慢滴加B液于A液中，滴加完畢后自然升溫至室溫，繼續(xù)反應(yīng)24h。

蒸除溶劑，柱層析純化后得到羧丙基玉米赤霉烯酮，即為玉米赤霉烯酮半抗原。

2、人工抗原的合成及鑒定

（1）免疫原的合成

將玉米赤霉烯酮半抗原與BSA進(jìn)行偶聯(lián)得到免疫原。

具體操作如下：

取7mg半抗原，溶解于1mL二甲基甲酰胺中；取戊二醛水溶液0.1mL，加入半抗原溶

液中，室溫下攪拌24h，即可得到反應(yīng)液A；稱取BSA30mg，使之充分溶解在2.7mL0.1mol/L

CB（pH9.6）中，將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到BSA溶液中，并于室溫下攪拌24h，用5mol/L

的硼氫化鈉水溶液0.2mL進(jìn)行還原反應(yīng)4h，用0.01mol/LPBS4℃透析3d，每天換透析液3

次，得到玉米赤霉烯酮免疫原。

（2）包被原的合成

將玉米赤霉烯酮半抗原與OVA進(jìn)行偶聯(lián)得到包被原。

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具體操作如下：

取7mg半抗原，溶解于1mL二甲基甲酰胺中；取戊二醛水溶液0.1mL，加入半抗原溶

液中，室溫下攪拌24h，即可得到反應(yīng)液A；稱取OVA30mg，使之充分溶解在2.7mL0.1mol/L

CB（pH9.6）中，將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到OVA溶液中，并于室溫下攪拌24h，用5mol/L

的硼氫化鈉水溶液0.2mL進(jìn)行還原反應(yīng)4h，用0.01mol/LPBS4℃透析3d，每天換透析液3

次，得到玉米赤霉烯酮包被原。

（3）玉米赤霉烯酮免疫原與包被原的鑒定

一般通過(guò)紫外掃描法鑒定半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)是否為有效偶聯(lián)，因?yàn)榘肟乖c蛋白

在紫外下有不同的特征吸收，當(dāng)偶聯(lián)成功時(shí)，偶聯(lián)物的紫外吸收會(huì)有二者的迭加效應(yīng)出現(xiàn)，

因此比著單獨(dú)的蛋白特征吸收會(huì)發(fā)生一定的偏移，可用于檢測(cè)偶聯(lián)是否成功。

偶聯(lián)比的測(cè)定

用pH7.4的PBS溶液稀釋玉米赤霉烯酮半抗原、牛血清白蛋白、卵清蛋白和兩種蛋白

與玉米赤霉烯酮半抗原的結(jié)合物，配制成一定濃度的溶液，然后用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行全波

長(zhǎng)掃描，得到它們的紫外吸收光譜圖。

根據(jù)公式K=A/CL分別計(jì)算出玉米赤霉烯酮半抗原、牛血清白蛋白、卵清蛋白的摩爾

消光系數(shù)。在載體蛋白和玉米赤霉烯酮半抗原的最大波長(zhǎng)處檢測(cè)偶聯(lián)物的光吸收值，按公式

計(jì)算兩種物質(zhì)在偶聯(lián)物中的摩爾濃度比，即偶聯(lián)比：

Ca/Cb=（A偶264×KBSA280-A偶280×KBSA264）/（A偶280×KZEN264-A偶264×KZEN280）

蛋白含量的測(cè)定

將偶聯(lián)物稀釋到適當(dāng)倍數(shù)后，測(cè)定280nm和260nm的分光光度值，按公式計(jì)算蛋白的

濃度即偶聯(lián)物的濃度：

蛋白質(zhì)（mg/mL）=1.45×OD280-0.74×OD260

免疫原和包被原的鑒定結(jié)果

通過(guò)紫外掃描法鑒定半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)是有效偶聯(lián)，根據(jù)玉米赤霉烯酮半抗原、

載體蛋白、偶聯(lián)物在特定波長(zhǎng)的摩爾吸光系數(shù)估算半抗原與載體蛋白的結(jié)合比分別為14:1

和17:1，偶聯(lián)效果較好。

3、抗體的制備

（1）動(dòng)物免疫

用無(wú)菌pH7.0的PBS液將合成的免疫原溶解，然后按免疫原（ZEN半抗原-BSA）與弗

氏佐劑（FCA）1:3的比例充分乳化制成油乳劑疫苗。首次免疫用弗氏完全佐劑疫苗，對(duì)8~10

周齡Balb/c小鼠進(jìn)行免疫，頸背部皮下多點(diǎn)注射，免疫劑量為150μg/只。14天后二免，采

用弗氏不完全佐劑（FICA），免疫劑量同上；28天后三免，采用弗氏不完全佐劑，免疫劑量

同上；31天后加強(qiáng)免，不加佐劑，直接采用玉米赤霉烯酮半抗原-BSA免疫。免疫過(guò)程見(jiàn)表

2。

5

表2動(dòng)物免疫過(guò)程

免疫過(guò)程免疫原免疫劑量/(μg/只)間隔時(shí)間

首免ZEN半抗原-BSA（FCA）150-

二免ZEN半抗原-BSA（FICA）15014天

三免ZEN半抗原-BSA（FICA）15014天

加強(qiáng)免（融合前三天）ZEN半抗原-BSA1003天

（2）單克隆抗體的制備

飼養(yǎng)細(xì)胞制備：斷頸處死8~10周齡Balb/c小鼠，浸泡在75%酒精中5min，隨即放入

超凈工作臺(tái)內(nèi)，腹部朝上放于平皿內(nèi)或固定于解剖板上。用眼科鑷子夾起小鼠腹部皮膚，用

剪刀剪一小口，注意切勿剪破腹膜，以免腹腔液外流和污染。然后用剪刀向上下兩側(cè)做鈍性

分離，充分暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器吸取5mLRPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，

注入小鼠腹腔，輕輕抽回注射器，晃動(dòng)小鼠腿部和尾部幾次。用原注射器抽回腹腔內(nèi)液體，

注入離心管。如此反復(fù)操作3~4次。1000r/min離心10min，棄上清。用20~50mL完全培養(yǎng)

液重懸細(xì)胞，100μL/孔滴加到培養(yǎng)板，置培養(yǎng)箱備用。

脾細(xì)胞制備：加強(qiáng)免疫后3天，取免疫Balb/c小鼠一只，眼眶采血后脫臼處死，在75%

酒精中消毒后取脾臟，去除結(jié)締組織，制備脾細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，加RPMI1640

至30mL，1500~2000r/min離心5min，棄上清，加RPMI1640至30mL，計(jì)數(shù)待用。

骨髓瘤細(xì)胞制備：取3瓶生長(zhǎng)狀態(tài)良好的（活細(xì)胞數(shù)>95%）骨髓瘤細(xì)胞，將之完全吹

下，轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，加RPMI1640至30mL，1500~2000r/min離心5min，棄上清，

加RPMI1640至30mL，計(jì)數(shù)待用。

細(xì)胞混合：脾細(xì)胞:骨髓瘤細(xì)胞=8:1，混合，1500~2000r/min離心5min。

細(xì)胞融合：將混合好的細(xì)胞離心，倒干上清，把沉淀細(xì)胞塊彈成糊狀，置37℃水浴，

在1min內(nèi)加入1mL融合劑，融合劑為聚乙二醇（PEG）4000，作用2min，并輕輕攪拌細(xì)

胞，在隨后4min內(nèi)加入20mL無(wú)血清的PEG營(yíng)養(yǎng)液，1000r/min離心10min，棄上清。用

20~50mL完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，鋪種于含飼養(yǎng)細(xì)胞96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100μL，置培養(yǎng)

箱中。

上清檢測(cè)：待細(xì)胞長(zhǎng)至孔底的1/2~1/3時(shí)，采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定細(xì)胞上清液，篩

選陽(yáng)性孔。將陽(yáng)性細(xì)胞在檢測(cè)后2天內(nèi)采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆。10~14天后，再取細(xì)胞

上清檢測(cè)，最終得到了穩(wěn)定分泌玉米赤霉烯酮的單克隆雜交瘤細(xì)胞株，將此細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大

培養(yǎng)和傳代。

老鼠致敏：液體石蠟致敏Balb/c小鼠，6~8周，注射體積500μL/只。10天后可制備腹

水。

注射細(xì)胞：收集雜交瘤細(xì)胞并用1640洗細(xì)胞兩遍，取100到150萬(wàn)細(xì)胞注射于老鼠腹

腔，一周后可見(jiàn)老鼠狀態(tài)不活躍并且老鼠的腹腔腫大。

腹水采集：注射細(xì)胞一周后對(duì)腹腔腫大的老鼠用無(wú)菌注射器于老鼠腹腔采集腹水，每隔

一到兩天采集一次，這樣多次反復(fù)采集直到老鼠自然死亡。

6

單抗純化：采集到的腹水，用辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行純化，純化后的腹水放入-20℃環(huán)

境保存，腹水在使用前經(jīng)過(guò)0.01mol/LNaCl于4℃環(huán)境下透析48h，中間每隔6~8h換液一

次。

4、膠體金的制備

（1）玻璃器皿的準(zhǔn)備

用于實(shí)驗(yàn)的所有玻璃器皿在實(shí)驗(yàn)之前需要徹底清潔：將玻璃器皿先用自來(lái)水沖洗去除玻

璃器皿表面的灰塵，用酸液浸泡36h后，取出，用自來(lái)水洗凈酸液，再用蒸餾水洗3~4次，

再用去離子水把每個(gè)玻璃器皿洗三次，烤箱烘干后備用。專(zhuān)用的玻璃器皿用第一次生成的膠

體金穩(wěn)定其表面，棄去后以雙蒸水洗凈，可以減少金顆粒的吸附，玻璃器皿的表面污染會(huì)干

擾金顆粒的生成。

（2）檸檬酸三鈉還原法

取0.01%氯金酸水溶液100mL置于錐形瓶中，用恒溫電磁攪拌器加熱至沸騰，在持續(xù)高

溫、持續(xù)攪拌的情況下加入1%檸檬酸三鈉水溶液2mL，繼續(xù)勻速攪拌加熱15min，溶液呈透

亮的紅色。室溫冷卻，用去離子水恢復(fù)到原體積，4℃保存。

（3）膠體金的質(zhì)量鑒定

肉眼觀察：用肉眼觀察制備的膠體金，其顏色為酒紅色、均勻度較好無(wú)雜質(zhì)、透明度較

高，說(shuō)明膠體金質(zhì)量較好，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1肉眼觀察膠體金顏色

紫外掃描鑒定：取冷卻后的膠體金溶液進(jìn)行400~600nm紫外掃描，確定最大吸收峰波長(zhǎng)，

觀察最大吸收峰的峰形、峰寬，結(jié)果見(jiàn)圖2。其圖譜中最大吸收峰的峰寬較小，說(shuō)明膠體金

顆粒分布比較均勻，最大吸收峰波長(zhǎng)為523nm。

7

圖2膠體金的紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)掃描圖

透射電鏡鑒定：透射電鏡下觀察膠體金顆粒的大小是否均勻一致，有無(wú)橢圓形及多角形。

拍片放大后測(cè)量膠體金顆粒直徑大小，取多個(gè)點(diǎn)計(jì)算膠體金顆粒的平均直徑。膠體金顆粒的

透射電鏡掃描圖片見(jiàn)圖3。由圖3可知，在透射電鏡下觀察到膠體金顆粒的大小基本一致，沒(méi)

有橢圓形、多角形的金顆粒。將照片掃描后轉(zhuǎn)換成電子版圖片，放大后測(cè)量膠體金顆粒直徑

大小。隨機(jī)挑選10個(gè)膠體金顆粒通過(guò)計(jì)算得到金顆粒平均直徑為(20±0.5)nm。

圖3膠體金電鏡掃描圖片

（4）膠體金溶液的準(zhǔn)備

用0.1mol/LK2CO3調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值為7.2。由于金顆粒容易吸附于電極上使之堵

塞，故不能用pH計(jì)測(cè)定膠體金溶液的pH值，一般使用精密pH試紙。

5、膠體金標(biāo)記抗體的制備

（1）穩(wěn)定膠體金最適抗體用量的選擇

以目測(cè)法確定穩(wěn)定膠體金的最適抗體用量。用0.1mol/LK2CO3調(diào)節(jié)膠體金溶液pH為7.2，

分裝9管，每管1mL。待標(biāo)記的抗體溶液用0.01mol/L，pH7.6的磷酸鹽緩沖液作系列稀釋為

50~400μg/mL，分別取0.1mL加入2~8管的膠體金溶液中。第1管加0.1mL三蒸水，混勻。靜

置5min后，在上述1~8管中加入0.1mL10%NaCl溶液，第9管加0.1mL三蒸水，混勻后靜置2h，

觀察結(jié)果。稀釋后抗體和其他試劑操作步驟見(jiàn)表3，結(jié)果見(jiàn)表4和圖4。

8

表3最適蛋白用量操作步驟

管數(shù)

試劑

123456789

抗體加樣量（mL）0.10.10.10.10.10.10.10.10.1

抗體濃度（μg/mL）050100150200250300350400

膠體金（mL）1.01.01.01.01.01.01.01.01.0

搖勻，靜置5min

10%NaCl（mL）0.10.10.10.10.10.10.10.10

搖勻，靜置2h后，觀察結(jié)果

備注：第1管為沒(méi)有加入抗體的對(duì)照管，其內(nèi)加入0.1mL三蒸水，第9管為沒(méi)有加入氯化鈉的對(duì)照管，其內(nèi)加

入0.1mL三蒸水。

表4目測(cè)法確定穩(wěn)定膠體金最適蛋白用量

管號(hào)123456789

蛋白添加量（μg）0510152025303540

終顏色藍(lán)灰藍(lán)灰藍(lán)灰紅藍(lán)紅紅紅紅紅

圖4膠體金與抗體比例試驗(yàn)結(jié)果

由表4和圖4可知，未加抗體蛋白（1管）和加入抗體蛋白的量不足以穩(wěn)定膠體金的2~4

管，呈現(xiàn)由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象；未加入氯化鈉的9管顏色不發(fā)生變化；而加入抗體蛋白量達(dá)

到或超過(guò)穩(wěn)定膠體金的最小蛋白用量的5~8管保持紅色不變。其中含抗體蛋白量最低的5號(hào)試

管即含穩(wěn)定1mL膠體金所需的最小蛋白用量。在此基礎(chǔ)上再增加20%即為待標(biāo)記抗體蛋白的

實(shí)際用量，即穩(wěn)定膠體金的實(shí)際蛋白用量為每1mL膠體金溶液中添加24μg抗體蛋白。

（2）膠體金標(biāo)記抗體程序

在磁力攪拌下，用0.1mol/LK2CO3調(diào)節(jié)膠體金的pH至7.2，按每毫升膠體金溶液中加入

抗體24μg的標(biāo)準(zhǔn)向膠體金溶液中加入玉米赤霉烯酮單克隆抗體，攪拌混勻10min，加入10%

BSA使其在膠體金溶液中的終濃度為1%，靜置10min。12000r/min，4℃離心40min，棄上清

液，沉淀物用體積為初始膠體金體積1/10的金標(biāo)抗體稀釋液（含0.5%的牛血清白蛋白、0.3%

的表面活性劑、10%的蔗糖，pH7.2的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液）重懸，置4℃環(huán)境中備用。

9

（3）膠體金標(biāo)記抗體的鑒定

將羊抗鼠二抗點(diǎn)樣于NC膜上，直接與金標(biāo)抗體作用，可見(jiàn)有明顯的粉紅色斑點(diǎn)，表明

金標(biāo)抗體有活性。

（三）膠體金免疫方法的建立

1、固相載體的選擇

（1）吸水墊的選擇

取厚度為2.59nm，質(zhì)地均勻的Cottonlinters300作為吸水墊組裝試紙條，滴加樣品后

5min觀察吸水墊的情況，樣品吸收速度較快，故選擇Cottonlinters300作為吸水墊。

（2）硝酸纖維素膜的選擇

將抗原適當(dāng)稀釋后通過(guò)點(diǎn)樣方式分別包被在milipore135、UnisartCN140和mdi70三種

NC膜上，經(jīng)干燥、組裝試紙條后，置于陰性樣品中測(cè)試觀察樣品層析速度和檢測(cè)線顯色情

況，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5NC膜點(diǎn)樣顯色結(jié)果

NC膜型號(hào)millipore135UnisartCN140mdi70

顯色情況＋＋＋＋＋＋＋

注：＋＋＋，表示著色很深，與背景反差很大；＋＋，表示著色較深或著色很深但與背景反差較?。唬?，

表示著色淡或著色較深但與背景反差很?。唬?，表示沒(méi)有著色，或與背景色沒(méi)有反差，表6-表22同此注釋。

由表5可知，不同孔徑及廠家的NC膜點(diǎn)樣后，均能顯色，但顯色程度略有不同，

UnisartCN140顯色最深，milipore135和mdi70差別不大。

不同NC膜組裝的試紙條加樣后樣品展開(kāi)速度和加樣5min后的檢測(cè)線顯色結(jié)果見(jiàn)表6。

表6NC膜層析顯色結(jié)果

NC膜型號(hào)millipore135UnisartCN140mdi70

試劑展開(kāi)速度較快慢快

5min后檢測(cè)線顯色情況＋＋＋＋＋＋＋

由表6可知，UnisartCN140加入樣品后層析速度較慢，5min內(nèi)檢測(cè)線顯色最深，milipore

135試劑展開(kāi)速度較UnisartCN140快，但不及mdi70。milipore135與mdi70上檢測(cè)線顯色情

況相差不多，但mdi70背景顏色較淺。所以，綜合層析速度與顯色情況，三種NC膜中，mdi

70更符合試紙條設(shè)計(jì)要求。

（3）樣品墊的選擇

分別取BX-SB06、WFB、QXLM三種不同材質(zhì)材料作為樣品墊組裝試紙條，在金標(biāo)墊

處滴加2μL10%的金標(biāo)抗體，滴加100μL的陰性豆粕樣品，觀察樣品墊對(duì)樣品的過(guò)濾、吸收，

以及樣品在NC膜上的層析和檢測(cè)線顯色情況，結(jié)果見(jiàn)表7。

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表7樣品墊選擇結(jié)果1

樣品墊型號(hào)BX-SB06WFBQXLM

樣品吸收情況吸收不完全吸收不完全吸收完全

檢測(cè)線顯色情況－－＋

由表7可知，BX-SB06、WFB對(duì)豆粕中各組分吸收能力非常差，使用這兩種材料作為

樣品墊檢測(cè)豆粕時(shí)檢測(cè)線沒(méi)有顯色。QXLM雖然可以較大程度地吸收、過(guò)濾豆粕的蛋白等

物質(zhì)，但對(duì)于豆粕的層析速度的提高還是有較大局限性，層析速度較慢，且顯色較淺。以上

實(shí)驗(yàn)說(shuō)明采用卡殼形式測(cè)定豆粕等飼料原料時(shí)，使用以上三種樣品墊對(duì)于飼料原料中復(fù)雜組

分的吸收過(guò)濾效果均不顯著，除非采取稀釋的方法，否則很難得到滿意的效果。但將樣品稀

釋后再進(jìn)行檢測(cè)，不但會(huì)降低產(chǎn)品本身的靈敏度，而且增加了操作步驟，使試紙條便捷快速

的優(yōu)勢(shì)大打折扣。所以，考慮其他反應(yīng)模式對(duì)飼料原料進(jìn)行檢測(cè)。

向潔凈的酶標(biāo)板孔中加入10μL10%的金標(biāo)抗體，再將陰性豆粕樣品200μL加入其中，

與孔內(nèi)金標(biāo)抗體混合均勻，分別取BX-SB06、WFB、QXLM三種材質(zhì)材料作為樣品墊組裝

試紙條后，手持吸水紙?zhí)?，將樣品墊端插入盛有樣品-金標(biāo)抗體混合液中豎直放置，靜置5min

后觀察結(jié)果。

表8樣品墊選擇結(jié)果2

樣品墊型號(hào)BX-SB06WFBQXLM

樣品吸收情況吸收不完全吸收不完全吸收完全

檢測(cè)線顯色情況＋＋＋＋＋

由表8可知，采用插條方式進(jìn)行檢測(cè)時(shí)BX-SB06、WFB對(duì)豆粕中各組分吸收效果依然

較差，雖然檢測(cè)線稍有顯色，但顯色很淺。QXLM作為樣品墊在插條模式中顯示出了極大

的優(yōu)勢(shì)，不但對(duì)樣品過(guò)濾效果較好，而且層析速度相對(duì)快速，檢測(cè)線顯色明顯。這種直接向

酶標(biāo)板孔中滴加樣品的模式，操作簡(jiǎn)便。所以，選擇QXLM作為樣品墊，并采用插條模式

進(jìn)行檢測(cè)。

2、層析條件的選擇

（1）包被稀釋液和包被條件的篩選

分別用A、B、C、D四種不同配方的稀釋液將包被原玉米赤霉烯酮半抗原-OVA做一定

梯度稀釋?zhuān)贜C膜上點(diǎn)樣后烘干，組裝試紙條檢測(cè)陰性豆粕樣品，觀察顯色情況，結(jié)果見(jiàn)

表9。

表9包被稀釋液篩選結(jié)果

包被原濃度包被液

（mg/mL）ABCD

0.025－－－＋

0.5＋＋＋＋＋

11

1＋＋＋＋＋＋＋＋＋

2＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

由表9可知，使用不同的包被稀釋液，試紙條顯色結(jié)果有一定差異，其中包被稀釋液D

在稀釋至0.025mg/mL時(shí)，NC膜上點(diǎn)樣著色照樣很深，而其他包被稀釋液在稀釋至

0.025mg/mL時(shí)，顏色很淡或不顯色，故選擇包被稀釋液D作為實(shí)際用包被稀釋液。

用包被稀釋液D將包被原稀釋至1mg/mL，在NC膜上點(diǎn)樣后分別置于37℃烘干和室溫

（18~25℃）下自然干燥，時(shí)間設(shè)置為30min、1h、2h、8h、12h，組裝試紙條檢測(cè)陰性豆粕

樣品，觀察顯色情況，結(jié)果見(jiàn)表10。

表10包被條件篩選結(jié)果

包被時(shí)間

包被條件

30min1h2h8h12h

37℃＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

室溫（18~25℃）＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

由表10可知，點(diǎn)樣后，包被稀釋液在37℃烘干和室溫（18~25℃）自然干燥的不同包被

時(shí)間差異不顯著。為減少外界因素對(duì)試驗(yàn)的影響，包被條件選擇37℃干燥8h。

（2）封閉液和封閉條件的選擇

為減少NC膜對(duì)反應(yīng)的非特異性影響，采用封閉液對(duì)NC膜進(jìn)行封閉，分別用A、B、C、

D四種封閉液封閉，37℃溫育30min后，用PBST洗液清洗2次，自然干燥后組裝試紙條檢測(cè)

陰性豆粕樣品，觀測(cè)膠體金在NC膜上的層析情況及檢測(cè)線的顯色情況，結(jié)果見(jiàn)表11。

表11封閉液篩選結(jié)果

封閉液ABCD

顯色情況＋＋＋＋＋＋＋

由表11可知，封閉液A封閉后得到的斑點(diǎn)顏色很深，作為背景的NC膜呈白色，同斑點(diǎn)

顏色反差非常大，說(shuō)明封閉液A封閉效果很好，將NC膜上的一些結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了封閉，使

金標(biāo)抗體不在NC膜上結(jié)合停留，除抗原點(diǎn)樣處為紅色外，NC膜其他位置都為白色。封閉液

C封閉后得到的斑點(diǎn)顏色也很深，但NC膜上呈深淺不一的粉紅色，降低了斑點(diǎn)同背景的反

差。封閉液B、D封閉后得到的斑點(diǎn)顏色較淺。說(shuō)明封閉液A的封閉效果比其他三種封閉液

封閉效果好。

包被抗原點(diǎn)樣后，用封閉液A以不同的封閉時(shí)間30min、1h、2h、8h、12h分別在室溫

（18~25℃）、37℃條件下進(jìn)行封閉，組裝試紙條檢測(cè)陰性豆粕樣品，觀察膠體金在NC膜上

的層析情況及檢測(cè)線的顯色情況，結(jié)果見(jiàn)表12。

表12封閉條件篩選結(jié)果

封閉時(shí)間30min1h2h8h12h

12

37℃＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

室溫（18~25℃）＋＋＋＋＋＋＋＋＋

由表12可知，抗原點(diǎn)樣后，37℃封閉2~12h和室溫條件下封閉12h均能得到著色較深、背

景較淺的斑點(diǎn)。為縮短試驗(yàn)時(shí)間、減少外界因素對(duì)試驗(yàn)的影響，選擇的封閉條件為37℃封閉

2h。

（3）金標(biāo)抗體稀釋液和干燥條件的篩選

分別用A、B、C、D、E五種不同配方的稀釋液將金標(biāo)抗體做1:1、1:2、1:3、1:4稀釋后，

組裝試紙條檢測(cè)陰性豆粕樣品，觀察顯色情況，結(jié)果見(jiàn)表13。

表13金標(biāo)抗體稀釋液篩選結(jié)果

金標(biāo)抗體稀釋液

稀釋倍數(shù)

ABCDE

1:1＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

1:2＋＋＋＋＋＋＋＋＋

1:3－＋＋＋＋－

1:4－－＋－－

由表13可知，五種金標(biāo)抗體稀釋液顯色結(jié)果差異顯著，分析結(jié)果顯示經(jīng)稀釋液C稀釋1:4

的金標(biāo)抗體滴加到NC膜上時(shí)仍能顯色，而同樣情況下，其他稀釋液不顯色，故選擇金標(biāo)抗

體稀釋液C作為實(shí)際用金標(biāo)抗體稀釋液。

用稀釋液C將金標(biāo)抗體稀釋到1:2，加入酶標(biāo)板孔中，選擇表14中的5種凍干條件進(jìn)行凍

干機(jī)程序方案篩選。對(duì)比5種凍干方式所得結(jié)果如表15所示。

表14金標(biāo)抗體干燥條件篩選程序

程序編號(hào)

凍干條件

12345

預(yù)

凍-4℃30min0030min0

程

序-20℃1h1h01h0

-50℃3h3h3h3h3h

干

燥-20℃3h3h3h3h3h

程

序10℃00010h10h

25℃12h12h12h2h2h

表15金標(biāo)抗體干燥條件篩選結(jié)果

程序編號(hào)

13

12345

顯色情況＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

凍干狀態(tài)×○○×○

注：○，代表凍干狀態(tài)良好，形狀規(guī)則，干燥完全；×，代表凍干狀態(tài)不能滿足生產(chǎn)需求，形狀不規(guī)則，

干燥不完全。

由表15可知，凍干程序4、5顯色均較好，3次之，1、2顯色較淺。凍干狀態(tài)2、3、5較好，

呈規(guī)則形狀，干燥完全，1、4凍干不完全，成“蜂窩”狀，容易吸潮而影響顯色。綜合顯色

與凍干狀態(tài)，選擇5號(hào)程序作為金標(biāo)抗體干燥條件，與金標(biāo)抗體稀釋液C配合使用。

（4）樣品墊展開(kāi)劑的篩選

配制A、B、C、D、E五種不同展開(kāi)劑作為樣品墊處理液，并將液體處理到QXLM上，

組裝試紙條后配合已凍干的金標(biāo)抗體使用，對(duì)比五種展開(kāi)劑對(duì)膠體金層析速度、樣品流動(dòng)性

的作用及顯色情況。結(jié)果見(jiàn)表16。

表16樣品墊展開(kāi)劑篩選結(jié)果

展開(kāi)劑種類(lèi)

ABCDE

顯色情況＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

層析速度

180165150175176

（樣本到達(dá)吸水墊的時(shí)間/s）

由表16可知，不同展開(kāi)劑對(duì)樣品的流動(dòng)速度及顯色差異較大。大體規(guī)律為層析速度越快，

金標(biāo)抗體與C、T線有越充足的時(shí)間結(jié)合則顯色越深，不過(guò)展開(kāi)劑D的層析速度較A快，但顯

色比A淺，這可能是由于D中加入的表面活性劑影響了玉米赤霉烯酮抗原抗體的結(jié)合。綜合

考慮層析速度與顯色情況，選擇展開(kāi)劑C作為樣品墊處理液適宜。

（5）C、T線包被濃度及線寬的確定

利用已確定的包被稀釋液將抗原與二抗分別進(jìn)行不同倍數(shù)稀釋?zhuān)⒅苽涑稍嚰垪l檢測(cè)，

測(cè)試結(jié)果顯示：二抗或抗原濃度太低時(shí)，試紙條上的C、T線顏色偏淺，不利于觀察；抗原

濃度太高則試紙條上T線太深，與C線對(duì)比反差明顯，且對(duì)檢測(cè)靈敏度有顯著影響。通過(guò)不

斷對(duì)比試驗(yàn)，綜合考慮陰性顯色程度與陽(yáng)性樣品添加測(cè)試，確定在層析材料上的抗原濃度為

0.12mg/mL，線寬為0.95μL/cm，二抗?jié)舛葹?.18mg/mL，線寬為1.0μL/cm。

（四）試紙條的組裝

試紙條的結(jié)構(gòu)如下所示：

14

加樣后的樣品流動(dòng)方向

圖5膠體金試紙條結(jié)構(gòu)示意圖

圖6膠體金試紙條剖面結(jié)構(gòu)示意圖

注：1為樣品墊、2為NC膜、3為吸水墊、4為檢測(cè)線、5為質(zhì)控線、6為PVC底板、7為保護(hù)膜

樣品墊、NC膜和吸水墊依次按順序黏貼在PVC底板上，樣品墊的末端與NC膜的始端相

連，NC膜的末端與吸水墊的始端相連，樣品墊的始端與底板的始端對(duì)齊，吸水墊的末端與

底板的末端對(duì)齊；試紙黏貼有保護(hù)膜，保護(hù)膜覆蓋在樣品墊上，為檢測(cè)端，上面印有MAX

字樣。

（五）試紙條檢測(cè)過(guò)程的優(yōu)化

1、樣品提取方法的研究

在研制本方法的過(guò)程中，盡量簡(jiǎn)化樣品前處理的步驟，力求方法更加簡(jiǎn)單、快速。對(duì)于

飼料原料樣品，一般需要簡(jiǎn)單的過(guò)篩、粉碎過(guò)程。試驗(yàn)摸索中發(fā)現(xiàn)，粉碎后的飼料原料樣品，

需加入提取液進(jìn)行提取，將提取后的上清液加入到磷酸鹽緩沖液中，混勻后，點(diǎn)樣。具體試

驗(yàn)過(guò)程如下：

（1）樣品提取液的選擇

取陰性豆粕樣品，及玉米赤霉烯酮添加濃度分別為25μg/kg、50μg/kg、100μg/kg、200μg/kg

的陽(yáng)性豆粕樣品，經(jīng)過(guò)篩和粉碎后，各稱取(5.00±0.01)g到50mL離心管中，分別加入15mL

濃度為80%的甲醇、氯仿、乙醇，渦動(dòng)3min，室溫3000r/min以上離心5min；取100μL上清液

加入300μL0.01mol/L、pH7.2的磷酸鹽緩沖液混勻后，取200L進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表17。

表17樣品提取液的選擇

提取液

添加濃度

甲醇氯仿乙醇

0μg/kg＋＋＋—＋

25μg/kg＋＋—＋

50μg/kg＋——

100μg/kg———

15

200μg/kg———

由表17可知，氯仿作為提取液時(shí)，干擾T線顯色機(jī)制而導(dǎo)致T線不顯色；乙醇作為提取

液時(shí)，T線顯色淺；采用甲醇提取液，T線顯色深淺適中且梯度明顯，為最優(yōu)方案。

（2）樣品提取液體積的選擇

取陰性豆粕樣品，及玉米赤霉烯酮添加濃度分別為25μg/kg、50μg/kg、100μg/kg、200μg/kg

的陽(yáng)性豆粕樣品，經(jīng)過(guò)篩和粉碎后，各稱取(5.00±0.01)g到50mL離心管中，分別加入5mL、

10mL、15mL、20mL80%甲醇，渦動(dòng)3min，室溫3000r/min以上離心5min；取100μL上清液

加入300μL0.01mol/L、pH7.2的磷酸鹽緩沖液混勻后，取200L進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表18。

表18樣品提取液體積的選擇

樣品提取液體積

添加濃度

5mL10mL15mL20mL

0μg/kg＋＋＋＋＋＋＋＋＋

25μg/kg＋＋＋＋＋＋＋

50μg/kg＋＋＋＋

100μg/kg＋＋——

200μg/kg————

由表18可知，樣品提取液體積為5mL、10mL時(shí)，提取不充分，使玉米赤霉烯酮無(wú)法充

分游離出來(lái)，導(dǎo)致T線顯色淺且梯度不明顯；樣品提取液體積為15mL、20mL時(shí)，T線顯色無(wú)

明顯差異，考慮到實(shí)驗(yàn)的經(jīng)濟(jì)性，選擇樣品提取液體積為15mL，T線顯色深淺適中且梯度明

顯，為最優(yōu)方案。

（3）樣本稀釋液的選擇

取陰性豆粕樣品，及玉米赤霉烯酮添加濃度分別為25μg/kg、50μg/kg、100μg/kg、200μg/kg

的陽(yáng)性豆粕樣品，經(jīng)過(guò)篩和粉碎后，各稱取(5.00±0.01)g到50mL離心管中，加入15mL80%

甲醇，渦動(dòng)3min，室溫3000r/min以上離心5min；取100μL上清液加入300μL樣本稀釋液（A：

0.01mol/L、pH7.2的磷酸鹽緩沖液；B：0.02mol/L、pH7.2的磷酸鹽緩沖液；C：0.05mol/L、

pH7.2的磷酸鹽緩沖液；D：0.1mol/L、pH7.2的磷酸鹽緩沖液）混勻后，取200L進(jìn)行檢測(cè)，

結(jié)果見(jiàn)表19。

表19樣本稀釋液的選擇

樣本稀釋液

添加濃度

ABCD

0μg/kg＋＋＋＋＋＋

25μg/kg＋＋＋＋＋

50μg/kg＋＋＋＋

100μg/kg—＋＋＋

16

200μg/kg————

由表19可知，采用B、C、D樣本稀釋液濃度過(guò)高，T線顯色淺，且不同濃度梯度下T線

顯色無(wú)明顯梯度；采用A樣本稀釋液時(shí)，T線顯色深淺適中且梯度明顯，為最優(yōu)方案。

（4）樣本稀釋液體積的選擇

取陰性豆粕樣品，及玉米赤霉烯酮添加濃度分別為25μg/kg、50μg/kg、100μg/kg、200μg/kg

的陽(yáng)性豆粕樣品，經(jīng)過(guò)篩和粉碎后，各稱取(5.00±0.01)g到50mL離心管中，加入15mL80%

甲醇，渦動(dòng)3min，室溫3000r/min以上離心5min；取100μL上清液分別加入50μL、100μL、200μL、

300μL0.01mol/L、pH7.2的磷酸鹽緩沖液混勻后，取200L進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表20。

表20樣本稀釋液體積的選擇

樣本稀釋液體積

添加濃度

50μL100μL200μL300μL

0μg/kg＋＋＋＋＋＋＋＋＋

25μg/kg＋＋＋＋＋＋＋

50μg/kg＋＋＋＋

100μg/kg＋＋＋—

200μg/kg—＋——

由表20可知，樣本稀釋液體積為50μL時(shí)，T線顯色淺且梯度不明顯；樣本稀釋液體積為

100μL時(shí)，顯色稍加深但梯度不明顯；當(dāng)樣本稀釋液體積為200μL時(shí)，檢測(cè)限濃度T線不消線；

當(dāng)樣本稀釋液體積為300μL時(shí)，T線顯色深淺適中且梯度明顯，為最優(yōu)方案。

由此可見(jiàn)，飼料原料樣品前處理方法為：試樣經(jīng)過(guò)篩、粉碎后，稱取(5.00±0.01)g至50mL

離心管中，加入15mL80%甲醇，渦動(dòng)5min，室溫3000r/min以上離心5min，取100μL上清液

加入300μL0.01mol/L、pH7.2的磷酸鹽緩沖液，混勻，待檢。

2、孵育時(shí)間的研究

把金標(biāo)抗體凍干在微孔中，組裝試紙條，檢測(cè)樣品。檢測(cè)前需要使用200μL經(jīng)上述1處

理的待測(cè)樣品液加入微孔中充分溶解金標(biāo)抗體，分別孵育1min、2min、3min、5min、8min，

之后插入試紙條，液體流動(dòng)時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，反應(yīng)5min后觀察結(jié)果。

取陰性豆粕樣品，及玉米赤霉烯酮添加濃度分別為25μg/kg、50μg/kg、100μg/kg、200μg/kg

的陽(yáng)性豆粕樣品，用試紙條進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表21。

表21孵育時(shí)間研究結(jié)果

孵育時(shí)間（min）

添加濃度

12358

0μg/kg＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

25μg/kg＋＋＋＋＋＋＋＋

17

50μg/kg＋＋＋＋＋

100μg/kg＋＋＋—＋

200μg/kg—————

由表21可知，孵育時(shí)間為1min、2min、3min時(shí)，金標(biāo)抗體與樣品反應(yīng)不充分，T線顯色

淺，顯色梯度不明顯；樣品處理時(shí)間為5min、8min時(shí)，T線顯色無(wú)明顯差異，考慮到金標(biāo)抗

體與樣品反應(yīng)的充分性以及實(shí)驗(yàn)的快速性，選擇孵育時(shí)間為5min，T線顯色深淺適中且梯度

明顯，為最優(yōu)方案。

3、顯色時(shí)間的研究

把金標(biāo)抗體凍干在微孔中，組裝試紙條，檢測(cè)樣品。檢測(cè)前需要使用200μL經(jīng)上述1處

理的待測(cè)樣品液加入微孔中充分溶解金標(biāo)抗體，孵育5min，之后插入試紙條，液體流動(dòng)時(shí)

開(kāi)始計(jì)時(shí)，分別反應(yīng)3min、5min、8min、10min、15min后觀察結(jié)果。

取陰性豆粕樣品，及玉米赤霉烯酮添加濃度分別為25μg/kg、50μg/kg、100μg/kg、200μg/kg

的陽(yáng)性豆粕樣品，用試紙條進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表22。

表22顯色時(shí)間研究結(jié)果

顯色時(shí)間（min）

添加濃度

3581015

0μg/kg＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

25μg/kg＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

50μg/kg＋＋＋＋＋＋

100μg/kg＋————

200μg/kg－————

由表22可知，顯色時(shí)間為3min時(shí)，NC膜上試劑展開(kāi)不充分，T線顯色淺，顯色梯度不

明顯；顯色時(shí)間為5min、8min、10min、15min時(shí)，T線顯色無(wú)明顯差異，考慮到試劑展開(kāi)的

充分性以及實(shí)驗(yàn)的快速性，選擇顯色時(shí)間為5min，T線顯色深淺適中且梯度明顯，為最優(yōu)方

案。

由此可見(jiàn)，飼料原料樣品檢測(cè)過(guò)程為：把金標(biāo)抗體凍干在微孔中，組裝試紙條，檢測(cè)前

需要使用200μL經(jīng)處理的待測(cè)樣品液加入微孔中充分溶解金標(biāo)抗體，孵育5min，之后插入試

紙條，液體流動(dòng)時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，反應(yīng)5min后觀察結(jié)果。

（六）檢測(cè)方法技術(shù)參數(shù)的確定

1、檢測(cè)限

取空白小麥、大米、黃豆、玉米、豆粕、花生粕、DDGS樣品各100份，按表23添加至

工作濃度，經(jīng)樣品前處理后進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表24。