預(yù)混合飼料中d-生物素的測(cè)定 征求意見(jiàn)稿

4.3儀器設(shè)備GB/T17778－202×預(yù)混合飼料中d-生物素的測(cè)定本文件描述了預(yù)混合飼料中d-生物素的分光光度和高效液相色譜測(cè)定方法。本文件適用于復(fù)合預(yù)混合飼料、維生素預(yù)混合飼料中d-生物素的測(cè)定。本文件分光光度法的檢出限為4mg/kg、定量限為12mg/kg，高效液相色譜法的檢出限為2mg/kg、定量限為6mg/kg。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T20195動(dòng)物飼料試樣的制樣3術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4方法1——分光光度法4.1原理用無(wú)水乙醇將試樣中d-生物素提取出來(lái)，在硫酸乙醇溶液中d-生物素和4-二甲基氨基肉桂醛生成橙色化合物，在530nm處顏色深淺與d-生物素含量成正比。4.2試劑或材料警示：強(qiáng)酸應(yīng)小心操作，取用均需在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。除非另有規(guī)定，僅使用分析純?cè)噭?.2.1水：GB/T6682，一級(jí)。4.2.2硫酸乙醇溶液：將2體積的硫酸與98體積的無(wú)水乙醇混勻。4.2.34-二甲基氨基肉桂醛無(wú)水乙醇溶液：2g/L。4.2.4標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（1mg/mL準(zhǔn)確稱取d-生物素（純度≥98%）標(biāo)準(zhǔn)品適量（精確至0.01mg）于50mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇溶解并定容至刻度，混勻。于4℃保存，有效期為3個(gè)月。4.2.5標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（20μg/mL準(zhǔn)確移取d-生物素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（4.2.5）1mL于50mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇稀釋至刻度，混勻。于4℃保存，有效期為2個(gè)月。GB/T17778－202×4.3.1分光光度計(jì)：±1nm。4.3.2分析天平：精度0.01mg、0.1mg。4.3.3超聲清洗器。4.4樣品按GB/T20195制備試樣，至少200g，充分混勻，裝入棕色磨口瓶中保存，備用。4.5試驗(yàn)步驟4.5.1試樣溶液的制備稱取維生素預(yù)混料2g（精確至0.0001g）、復(fù)合預(yù)混合飼料5g~10g（精確至0.0001g），置于50mL容量瓶中，加入30mL無(wú)水乙醇置于超聲清洗器（4.3.3）中超聲20min，用無(wú)水乙醇定容至刻度。過(guò)濾備用。4.5.2測(cè)定4.5.2.1標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制精確吸取d-生物素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（4.2.5）0.00mL、0.80mL、1.60mL、4.00mL、6.40mL、8.00mL于20mL容量瓶中，分別加入無(wú)水乙醇8.00mL、7.20mL、6.40mL、4.00mL、1.60mL、0.00mL，加入硫酸乙醇溶搖勻，室溫下放置1h，用無(wú)水乙醇（4.2.1）稀釋至刻度，混勻。用1cm比色皿在530nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以d-生物素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其相關(guān)系數(shù)應(yīng)不低于0.99。4.5.2.2樣品測(cè)定精確吸取試樣提取液（4.5.1）8.00mL于20mL容量瓶中，加入硫酸乙醇溶液（4.2.2）2mL和4-二甲基氨基肉桂醛無(wú)水乙醇溶液（4.2.3）2mL，搖勻，室溫下放置1h，用無(wú)水乙醇（4.2.1）稀釋至刻度，混勻。用試劑空白作為參比溶液，用1cm比色皿在530nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。試樣溶液中d-生物素的質(zhì)量濃度應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)，若超出線性范圍，應(yīng)將試樣溶液用無(wú)水乙醇稀釋后，重新測(cè)定。單點(diǎn)校準(zhǔn)定量時(shí)，試樣溶液中d-生物素的質(zhì)量濃度與標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度相差不超過(guò)30%。4.6試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理試樣中d-生物素的含量，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)w1表示，單位為毫克每千克（mg/kg多點(diǎn)校正按公式（1）計(jì)算，單點(diǎn)校正按公式（2）計(jì)算：w1=×n………（1）式中：ρ1——從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的試樣溶液中d-生物素質(zhì)量濃度，單位為微克每毫升(μg/mLm——試樣質(zhì)量，單位為克（g）；V1——試樣提取液的總體積，單位為毫升（mL）；V2——從提取液（V1）中分取的溶液體積，單位為毫升（mL）。GB/T17778－202×n——超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍后的稀釋倍數(shù)。w1=×n………（2）式中：A1——試樣溶液中d-生物素吸光值；ρs1——標(biāo)準(zhǔn)溶液d-生物素質(zhì)量濃度，單位為微克每毫升(μg/mL）；As1——標(biāo)準(zhǔn)溶液d-生物素吸光值；m——試樣質(zhì)量，單位為克（g）；V1——試樣提取液的總體積，單位為毫升（mL）；V2——從提取液（V1）中分取的溶液體積，單位為毫升（mL）。n——超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍后的稀釋倍數(shù)。測(cè)定結(jié)果以平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示，計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。4.7精密度4.7.1重復(fù)性在重復(fù)性條件下，獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的相對(duì)偏差規(guī)定如表，以大于規(guī)定的相對(duì)偏差的情況不超過(guò)5%為前提。d-生物素含量/（mg/kg）相對(duì)偏差/（%）20＜100304.7.2再現(xiàn)性在再現(xiàn)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)試結(jié)果的測(cè)定值的絕對(duì)差值不大于表2中所示的值，以大于表2中絕對(duì)差值的情況不超過(guò)5%為前提。d-生物素含量/（mg/kg）絕對(duì)差值/（%）＜1005方法2——高效液相色譜法（仲裁法）5.1原理試樣中的d-生物素用水提取后，用高效液相色譜儀分離測(cè)定，外標(biāo)法定量。GB/T17778－202×5.2試劑和材料除非另有規(guī)定，僅使用分析純?cè)噭?.2.1水：GB/T6682，一級(jí)。5.2.2二乙烯三胺五乙酸（DTPA）。5.2.20.05%三氟乙酸溶液：量取5mL三氟酸，用水定容至100mL，用氫氧化鈉溶液[c(NaOH)=5mol/L]調(diào)節(jié)pH至2.5。5.2.3乙腈：色譜純。5.2.4標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（0.2mg/mL準(zhǔn)確稱取d-生物素（純度≥98%）標(biāo)準(zhǔn)品適量（精確至0.01mg）于50mL容量瓶中，用水定容至刻度，混勻。于4℃保存，有效期為3個(gè)月。5.2.5標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（20μg/mL）:準(zhǔn)確量取d-生物素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液1.00mL于50mL容量瓶中，用水稀釋至刻度。于4℃保存，有效期為2個(gè)月。5.2.6標(biāo)準(zhǔn)系列溶液：準(zhǔn)確移取適量標(biāo)準(zhǔn)中間溶液(5.2.5)，用水稀釋定容配成標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，濃度分別為:0μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL，臨用現(xiàn)配。5.3儀器設(shè)備5.3.1超聲清洗器。5.3.2分析天平：精度0.01mg、0.1mg。5.3.3高效液相色譜儀：配有紫外或二極管矩陣檢測(cè)器。5.4樣品5.5試驗(yàn)步驟5.5.1試樣溶液制備稱取維生素預(yù)混合飼料2g（精確至0.0001g）、復(fù)合預(yù)混合飼料5g（精確至0.0001g置于100mL容量瓶中（若預(yù)混合飼料中含有礦物質(zhì)，加入0.1gDTPA加入三分之二體積的蒸餾水，在超聲清洗器（5.3.1）中超聲提取20min，冷卻后用水定容至刻度，過(guò)0.45μm濾膜，待測(cè)定。5.5.2測(cè)定5.5.2.1高效液相色譜條件高效液相色譜參考條件如下：a）色譜柱：C18柱，柱長(zhǎng)250nm，內(nèi)徑4.6nm，粒度5μm；或性能相當(dāng)者；b）流動(dòng)相：三氟乙酸溶液（5.2.2）+乙腈（5.2.3）=85+15；c）流動(dòng)相流速：1.0mL/min；d）進(jìn)樣體積：20μL；e）柱溫：30℃;f）檢瘕波長(zhǎng)：210nm。5.5.2.2標(biāo)準(zhǔn)系列溶液和試樣溶液測(cè)定GB/T17778－202×在儀器的最佳條件下，分別取標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（5.2.6）和試樣溶液（5.5.1）上機(jī)測(cè)定。d-生物素標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜圖見(jiàn)附錄A。5.5.2.3定性以保留時(shí)間定性，試樣溶液中待測(cè)物保留時(shí)間應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中待測(cè)物的保留時(shí)間一致，其相對(duì)偏差在±2.5%之內(nèi)。5.5.2.4定量以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中的濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)不應(yīng)低于0.99。試樣溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液中待測(cè)物的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測(cè)的線性范圍內(nèi)，如超出線性范圍，應(yīng)將試樣提取液用水稀釋（稀釋倍數(shù)n）至線性范圍內(nèi)，重新試驗(yàn)。單點(diǎn)校準(zhǔn)定量時(shí)，試樣溶液中待測(cè)物的濃度與標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度相差不超過(guò)30%。5.6試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理試樣中d-生物素的含量，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)w1表示，單位為毫克每千克（mg/kg多點(diǎn)校正按公式（1）計(jì)算，單點(diǎn)校正按公式（2）計(jì)算：×n………式中：ρ1——從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的試樣溶液中d-生物素質(zhì)量濃度，單位為微克每毫升(μg/mLm——試樣質(zhì)量，單位為克（g）；V1——試樣提取液的總體積，單位為毫升（mLn——超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍后的稀釋倍數(shù)?！羘………式中：A1——試樣溶液中d-生物素峰面積；ρs1——標(biāo)準(zhǔn)溶液d-生物素質(zhì)量濃度，單位為微克每毫升(μg/mLAs1——標(biāo)準(zhǔn)溶液d-生物素峰面積；m——試樣質(zhì)量，單位為克（g）；V1——