發(fā)熱伴血小板減少綜合征血清學(xué)、病原學(xué)診斷方法、病原學(xué)、臨床及流行病學(xué)資料

（規(guī)范性）

發(fā)熱伴血小板減少綜合征血清特異性抗體檢測(cè)A.1IgM捕獲ELISA法（MacELISA）檢測(cè)SFTS病毒IgM抗體A.1.1原理根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合的原理，用酶標(biāo)板中預(yù)包被的抗人IgM抗體（抗μ鏈）捕獲待檢測(cè)血清中的IgM抗體，加入酶標(biāo)病毒抗原，或先后加入病毒抗原與酶標(biāo)特異性抗體，反應(yīng)后加底物顯色。顯色程度與特異性IgM抗體含量呈正相關(guān)。A.1.2實(shí)驗(yàn)材料可根據(jù)所用試劑盒的相關(guān)要求進(jìn)行調(diào)整。a)洗板機(jī)、酶標(biāo)儀、恒溫溫箱或水浴箱（37℃±2℃）。b)10μL～200μL可調(diào)移液器、10mL吸管。c)稀釋血清用的試管。d)蒸餾水或去離子水。e)吸水紙。f)SFTS病毒IgM抗體ELISA檢測(cè)試劑盒。A.1.3檢測(cè)步驟應(yīng)參考所選用試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)，主要步驟如下。a)在包被板中加入樣品稀釋液，100?μL/孔，然后在相應(yīng)孔中加入陰、陽性對(duì)照以及待檢血清各10?μL。b)封板膜封板后混勻，37℃孵育30?min。c)用洗滌液沖洗6次，拍干。d)每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的病毒抗原，或先后加入病毒抗原與酶標(biāo)特異性抗體100?μL，然后重復(fù)步驟b)和c)。e)于各反應(yīng)孔內(nèi)加顯色液，混勻后置37℃避光顯色15?min。f)加終止液（主要成分為1moL/L硫酸溶液）于每反應(yīng)孔，50?μL/孔，輕拍混勻。g)30?min內(nèi)于450?nm波長(zhǎng)處（建議用雙波長(zhǎng)450?nm/630?nm檢測(cè)）讀取每孔的吸光度。A.1.4結(jié)果判斷在陰、陽性對(duì)照成立的情況下，待檢血清OD值≥臨界值者為陽性，小于臨界值者為陰性。臨界值計(jì)算公式：臨界值?=?陰性對(duì)照平均OD值（陰性對(duì)照OD值若小于0.05，則按0.05計(jì)算）+0.10。A.1.5意義IgM抗體陽性，表示患者新近或曾經(jīng)感染SFTS病毒，可用于臨床診斷參考。A.2膠體金等標(biāo)記法快速檢測(cè)SFTS病毒IgM/IgG抗體A.2.1原理在用硝酸纖維素膜制備的免疫層析試紙條上包被抗人IgM單克隆抗體、抗人IgG單克隆抗體，可捕獲人血清中IgM和IgG抗體，采用SFTS病毒抗原作為標(biāo)記抗原，若樣本中含病毒特異性的IgM、IgG抗體，則檢測(cè)區(qū)相應(yīng)位置出現(xiàn)條帶。A.2.2試驗(yàn)材料可根據(jù)所用試劑盒的相關(guān)要求進(jìn)行調(diào)整。a)膠體金標(biāo)記試紙條快速IgM/IgG檢測(cè)試劑盒；b)滴管或加樣器。A.2.3檢測(cè)步驟應(yīng)參考所選用試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)，主要步驟如下。a)撕開鋁箔袋，取出試劑卡，平置于水平桌面上做好標(biāo)記。b)將血清標(biāo)本用緩釋液稀釋（1:100）后,取適量（60?μL～80?μL）滴加于測(cè)試卡上的樣品孔內(nèi)，c)5?min～20?min內(nèi)觀察結(jié)果。A.2.4結(jié)果判斷在質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)紫色條帶顯示檢測(cè)成立，檢測(cè)區(qū)出現(xiàn)紫色條帶表示SFTS病毒特異性IgM和/或IgG抗體陽性。A.2.5意義IgM抗體陽性，表示患者新近或曾經(jīng)感染SFTS病毒，可用于臨床診斷參考。IgG抗體陽性,提示患者曾受到SFTS病毒感染；恢復(fù)期較急性期IgG抗體陽轉(zhuǎn)，可確診。A.3間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)抗SFTS病毒IgG抗體A.3.1原理將SFTS病毒抗原包被酶標(biāo)板，結(jié)合樣本中病毒特異性抗體，再加酶標(biāo)記的抗人IgG抗體進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)后加底物顯色或發(fā)光。顯色程度或發(fā)光強(qiáng)度與特異性IgG抗體含量呈正相關(guān)。A.3.2試驗(yàn)材料可根據(jù)所用試劑盒的相關(guān)要求進(jìn)行調(diào)整。a)洗板機(jī)、酶標(biāo)儀、恒溫溫箱或水浴箱（37℃±2℃）。b)10μL～200μL可調(diào)移液器、10mL吸管。c)稀釋血清用的試管。d)蒸餾水或去離子水。e)吸水紙。f)SFTS病毒IgG抗體ELISA檢測(cè)試劑盒。A.3.3檢測(cè)步驟應(yīng)參考所選用試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)，主要步驟如下。a)在包被板中加入樣品稀釋液，100μL/孔，然后在相應(yīng)孔中加入陰、陽性對(duì)照以及不同稀釋度的待檢血清。b)封板膜封板后混勻，37℃孵育40min。c)用洗滌液沖洗6次，拍干。d)每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的酶結(jié)合物100μL，然后重復(fù)步驟b)和c)。e)于各反應(yīng)孔內(nèi)加顯色液，混勻后置37℃避光顯色15min。f)加終止液（主要成分為1moL/L硫酸溶液）于每反應(yīng)孔，50μL/孔，輕拍混勻。g)30min內(nèi)于450nm波長(zhǎng)處讀取每孔的吸光度。A.3.4結(jié)果判斷在陰、陽性對(duì)照成立的情況下，待檢血清OD值≥臨界值者為陽性，小于臨界值者為陰性。臨界值計(jì)算公式：臨界值=陰性對(duì)照平均OD值（陰性對(duì)照OD值若小于0.05，則按0.05計(jì)算）+0.10。A.3.5意義陽性結(jié)果,提示曾受SFTS病毒感染?；謴?fù)期血清抗體滴度比急性期抗體陽轉(zhuǎn)或滴度有4倍或以上升高，可確診。A.4間接免疫熒光法（IFA）檢測(cè)SFTS病毒IgG抗體A.4.1原理利用抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性的特點(diǎn)，將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體上，與其相應(yīng)的抗原結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。根據(jù)熒光顯微鏡下是否存在特異性熒光進(jìn)行結(jié)果判定。A.4.2試驗(yàn)材料材料與試劑如下，可根據(jù)所用試劑盒的相關(guān)要求進(jìn)行調(diào)整。a)抗原片：SFTS病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株感染VeroE6制備，低溫干燥保存。b)陽、陰性對(duì)照：患者恢復(fù)期血清（陽性對(duì)照）、陰性血清。c)熒光素標(biāo)記羊抗人（或兔抗人）IgG抗體。d)常用稀釋液：1×PBS，伊文思藍(lán)等。e)熒光顯微鏡。A.4.3檢測(cè)步驟應(yīng)參考所選用試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)，主要步驟如下。a)用1×PBS稀釋待檢血清，從1:20開始做4倍連續(xù)稀釋至1:320，或至所需要的稀釋度。b)按照稀釋度從高到低的順序依次加入待檢血清,加入量以覆蓋細(xì)胞抗原面為準(zhǔn)（若為雙份血清，最好上排為急性期血清,下排為恢復(fù)期血清），同時(shí)設(shè)陽性、陰性對(duì)照，在37℃濕盒孵育30?min。c)用1×PBS洗滌3次，每次5min，再用蒸餾水洗滌3次脫鹽，室溫吹干。d)用含伊文思藍(lán)PBS按工作濃度稀釋熒光結(jié)合物，每孔加入適量（以完全覆蓋細(xì)胞面為準(zhǔn)），在37℃濕盒孵育30min，然后步驟同c）。e）熒光顯微鏡觀察結(jié)果。A.4.4結(jié)果判斷細(xì)胞內(nèi)病毒特異性熒光為黃綠色顆粒，分布在感染細(xì)胞的胞漿內(nèi)。根據(jù)是否出現(xiàn)特異性熒光、熒光亮度、出現(xiàn)熒光的陽性細(xì)胞數(shù)占比定量或定性對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定。熒光反應(yīng)大致分為“+”～“++++”，無特異性熒光者為“-”。檢測(cè)抗體滴度時(shí)，以能觀察到明顯特異性熒光反應(yīng)的最高血清稀釋度的倒數(shù)表示。A.4.5意義陽性結(jié)果,表明曾受到SFTS病毒感染；恢復(fù)期血清抗體陽轉(zhuǎn)，或抗體滴度較急性期抗體滴度有4倍或4倍以上升高，可確診。

（規(guī)范性）

發(fā)熱伴血小板減少綜合征病原學(xué)檢測(cè)可采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction,RT-PCR）、實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Real-timeRT-PCR,實(shí)時(shí)熒光RT-PCR）、基因測(cè)序或其他經(jīng)過評(píng)估合格的病毒基因組核酸檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，檢出特異性病毒核酸具有確診意義。B.1RT-PCR法檢測(cè)SFTS病毒核酸B.1.1原理PCR技術(shù)是利用雙鏈DNA分子堿基配對(duì)原則，在體外高效擴(kuò)增DNA片段的方法，其特異性取決于人工合成的寡核苷酸引物序列。PCR由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。引物與待擴(kuò)增片段兩條鏈兩段DNA序列分別互補(bǔ)結(jié)合后，在DNA聚合酶催化下，引導(dǎo)引物的5′端向3′端方向延伸合成雙鏈DNA片段。不斷重復(fù)上述三個(gè)基本的溫控循環(huán)步驟，可使DNA產(chǎn)量呈指數(shù)上升。SFTS病毒為負(fù)鏈RNA病毒，PCR擴(kuò)增檢測(cè)前需經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄酶作用，合成cDNA鏈，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即RT-PCR。從患者標(biāo)本中提取病毒基因組RNA，利用SFTS病毒特異性引物進(jìn)行核酸擴(kuò)增，通過擴(kuò)增片段大小、基因組序列比對(duì)分析等方式，達(dá)到病原體鑒定等目的。B.1.2試驗(yàn)材料主要試劑及儀器設(shè)備如下，可根據(jù)所用試劑的相關(guān)要求進(jìn)行調(diào)整。a)RNA提取試劑盒。b)SFTS病毒核酸擴(kuò)增引物（表1）。c)逆轉(zhuǎn)錄與PCR擴(kuò)增試劑盒。d)移液器（10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL）及配套吸頭、PCR反應(yīng)管、離心管（1.5mL）及管架、臺(tái)式高速離心機(jī)、普通冰箱、旋渦混合器、PCR儀、核酸電泳儀、凝膠成像儀等。表1SFTS病毒核酸檢測(cè)參考引物片段名稱位置序列（5’-3’）SS-F-outer47-68TCCAACGTTGACCTCAAATCTGS-R-outer730-750GGCTCATCATCCTCATCCAAGS-F-inner169-189GTCAATGGTCAAGAGGATGGGS-R-inner602-622GCTCATGCCTCTTAGCCTTGCSFTS-S-1F1-22ACACAAAGACCCCCTTCATTTGGSFTS-S-1R724-749GCTCATCATCCTCATCCAAGACACSFTS-S-2F581-604CTCCTCCAGATAGAGTCACTTGCASFTS-S-2R1206-1226TGAAGCCACAACCAAGACCCTMM-F-outer1954-1974TCAGTGAGGAGATGTCGTTGGM-R-outer2617-2637CTGGCTGTCATGGCTTCTCTCM-F-inner2080-2099TCTGATGGGTGTGGAGGAGCM-R-inner2422-2444CACTGTATCTCTCCAACCTTGCCLL-F-outer3842-3861TTCCTCATGGACAACCCTGCL-R-outer4498-4517CTATGCGGCTCCTGACAATGL-F-inner4001-4021ACATCGGGAGGAACTCTCAGCL-R-inner4388-4407AGCATTCGCTCCTGGTTAGGB.1.3檢測(cè)步驟應(yīng)參考所選用試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)，主要步驟如下。a)病毒RNA提?。喊丛噭┱f明書操作，制備病毒RNA。b)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：可用隨機(jī)引物或病毒特異性引物，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行。c)PCR擴(kuò)增：根據(jù)所用PCR擴(kuò)增試劑盒，配置反應(yīng)體系。第一輪PCR反應(yīng)體系的上下游引物為外套引物，模板為cDNA。建議反應(yīng)條件：95℃3?min預(yù)變性；94℃30?sec變性、55℃30sec退火、72℃1?min延伸，共35個(gè)循環(huán)；72℃?10?min延伸。第二輪PCR反應(yīng)體系的上下游引物為內(nèi)套引物，模板為第一輪PCR產(chǎn)物。建議反應(yīng)條件：95℃3?min預(yù)變性；94℃30?sec變性、52℃30?sec退火、72℃45?sec延伸，共40個(gè)循環(huán)；72℃10?min延伸。d)結(jié)果判定：1.5%濃度瓊脂糖電泳分析，根據(jù)擴(kuò)增條帶大小進(jìn)行鑒定。若條帶的分子量與預(yù)期片段大小相同，則表明SFTS病毒核酸擴(kuò)增陽性。必要時(shí)，可進(jìn)行：e)PCR片段的回收和核苷酸序列測(cè)定：切下特異分子量條帶，用凝膠電泳回收試劑盒回收純化所擴(kuò)增的DNA片段，測(cè)序儀測(cè)序。B.1.4意義排除PCR污染后，擴(kuò)增到特異性條帶可確診，陰性結(jié)果不能排除病毒感染。B.2實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR（qRT-PCR）法檢測(cè)SFTS病毒核酸B.2.1原理根據(jù)SFTS病毒基因組序列特征，設(shè)計(jì)特異性引物和特異性熒光標(biāo)記核酸探針，可快速實(shí)現(xiàn)病毒檢測(cè)。探針結(jié)合部位位于引物結(jié)合區(qū)域內(nèi)，其5’端和3’端可分別標(biāo)記不同的熒光素，稱為報(bào)告熒光基團(tuán)（用R表示）和淬滅熒光基團(tuán)（用Q表示，淬滅熒光基團(tuán)也可用小溝結(jié)合物(MGB)）。當(dāng)引物和探針同時(shí)與目的基因片段結(jié)合時(shí)，探針R基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)被Q基團(tuán)所吸收，儀器檢測(cè)不到R所發(fā)出的熒光信號(hào)；當(dāng)PCR擴(kuò)增延伸到探針結(jié)合部位時(shí)，Taq酶發(fā)揮5’→3’外切核酸酶的功能，將探針?biāo)獬蓡魏塑账?，探針上的R基團(tuán)游離釋放，所發(fā)出的熒光不再為Q基團(tuán)所淬滅，可被檢測(cè)儀接收識(shí)別，隨著PCR循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)的延續(xù)，R和Q基團(tuán)游離于溶液中的量不斷增加，儀器可繼續(xù)檢測(cè)到R所發(fā)出的熒光信號(hào)。qRT-PCR可定性或定量檢測(cè)標(biāo)本中的病毒核酸。B.2.2試驗(yàn)材料主要試劑及儀器設(shè)備如下，可根據(jù)所用試劑的相關(guān)要求進(jìn)行調(diào)整。a)RNA提取試劑盒。b)SFTS病毒核酸檢測(cè)引物及探針（表2），或其他SFTS病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒。c)移液器（10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL）及配套吸頭、PCR反應(yīng)管、離心管（1.5mL）及管架、臺(tái)式高速離心機(jī)、普通冰箱、旋渦混合器、實(shí)時(shí)熒光PCR儀等。表2SFTS病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法核酸檢測(cè)參考引物及探針序列片段引物名稱位置序列（5’-3’）SS-F1104-1125GGGTCCCTGAAGGAGTTGTAAAS-R1155-1178TGCCTTCACCAAGACTATCAATGTS-Probe1127-1146TexasRed-TTCTGTCTTGCTGGCTCCGCGC-BHQ2MM-F1369-1393AAGAAGTGGCTGTTCATCATTATTGM-R1424-1445GCCTTAAGGACATTGGTGAGTAM-Probe1394-1420FAM-TCATCCTCCTTGGATATGCAGGCCTCA-BHQ1LL-F3138-3162AGTCTAGGTCATCTGATCCGTTYAGL-R3209-3230TGTAAGTTCGCCCTTTGTCCATL-Probe3168-3197HEX-CAATGACAGACGCCTTCCATGGTAATAGGG-BHQ1B.2.3檢測(cè)步驟應(yīng)參考所選用試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)，主要步驟如下。a)病毒RNA提?。喊丛噭┱f明書操作，制備病毒RNA。b)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增：根據(jù)所用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑，配置擴(kuò)增反應(yīng)體系。使用SFTS病毒特異性引物和探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。建議反應(yīng)條件：50℃30?min；95℃10?min；95℃15?sec，60℃45?sec，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)條件可根據(jù)所用試劑和熒光PCR儀器進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整。B.2.4結(jié)果判斷以熒光PCR反應(yīng)的前3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為本底信號(hào)，以本底信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)差的10倍作為熒光閾值，標(biāo)本擴(kuò)增產(chǎn)生的熒光信號(hào)達(dá)到熒光閾值時(shí)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)為循環(huán)閾值（Ct值），以Ct值<35、熒光信號(hào)數(shù)據(jù)線性化處理后對(duì)應(yīng)循環(huán)數(shù)生成的曲線圖成“S”形的標(biāo)本，可判斷為相應(yīng)的SFTS病毒核酸陽性，Ct>38可判斷為陰性，Ct值處于35～40之間者，需采用另一套引物探針或其他檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)判斷。B.2.5意義排除污染后，檢出病毒核酸可確診，用于早期診斷，陰性結(jié)果不能排除病毒感染。B.3病毒分離B.3.1原理病毒必須依賴易感活細(xì)胞進(jìn)行增殖?；谶@一特性，利用SFTS病毒敏感細(xì)胞，如VeroE6和Vero細(xì)胞等對(duì)SFTS病毒進(jìn)行體外培養(yǎng)增殖，一般不產(chǎn)生可見細(xì)胞病變，可通過觀察細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)上清中SFTS病毒蛋白和核酸的存在情況，檢驗(yàn)病毒是否存在。B.3.2試驗(yàn)材料主要試劑及儀器設(shè)備如下，可根據(jù)所用試劑的相關(guān)要求進(jìn)行調(diào)整。a)10～200μL、1mL移液器、無菌吸頭。b)96孔/24孔組織培養(yǎng)板，或T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶等。c)Vero/VeroE6細(xì)胞等。d)細(xì)胞生長(zhǎng)液、維持液與Hank's液。e)CO2培養(yǎng)箱、生物安全柜、倒置顯微鏡。B.3.3實(shí)驗(yàn)步驟a)樣本處理和稀釋：患者急性期血清標(biāo)本用Hank's液適當(dāng)稀釋后（如1:10、1:20等）可直接用于病毒分離；組織等標(biāo)本需研磨后離心后，取適量上清液用來接種細(xì)胞。對(duì)懷疑污染的標(biāo)本，一般使用較大劑量抗生素（如青霉素1萬單位，鏈霉素1萬微克，和制霉菌素適量）處理后經(jīng)12000?g離心20?min，去除大部分細(xì)菌和雜質(zhì)。在進(jìn)行病毒細(xì)胞培養(yǎng)分離時(shí)設(shè)置一個(gè)同樣稀釋的正常人血清做陰性對(duì)照。b)細(xì)胞接種：以T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶為例。將培養(yǎng)好的單層細(xì)胞上清棄掉，用Hank’s液洗滌2遍，取處理后的血清或組織研磨液標(biāo)本0.5～1mL接種單層細(xì)胞。37℃CO2培養(yǎng)箱中吸附2?h后用無菌Hank's洗滌細(xì)胞層1～2次，每次5mL，最后加入維持液5mL，37℃培養(yǎng)。每隔3～4d換維持液。c)培養(yǎng)至第7?d～10?d刮取少量細(xì)胞點(diǎn)抗原片進(jìn)行免疫熒光或采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法等進(jìn)行鑒定，如果陽性（分離到的第一代病毒需有細(xì)胞免疫熒光陽性的檢測(cè)結(jié)果），則收集上清或繼續(xù)接種新鮮細(xì)胞進(jìn)行病毒培養(yǎng)；如果檢測(cè)結(jié)果仍為陰性，則收集培養(yǎng)液，凍存于-70℃或液氮中以備重新檢測(cè)，細(xì)胞需繼續(xù)傳代。d)連續(xù)傳代：用胰酶消化以上步驟中檢測(cè)為陰性的細(xì)胞，用3～4mL新鮮培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，取1/2(1.5～2mL)細(xì)胞懸液與大約同等數(shù)量的新鮮制備的正常細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)，重復(fù)步驟c）檢測(cè)至第3代。取剩余1/2(1.5～2mL)細(xì)胞懸液離心后保存于-70℃待查。e)病毒抗原和核酸檢測(cè)：刮取少量細(xì)胞制備抗原片，利用SFTS病毒特異性抗體進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)，如果熒光檢測(cè)陽性，說明存在病毒復(fù)制。對(duì)陽性分離物參照SFTS病毒核酸檢測(cè)方法，提取核酸，進(jìn)行序列測(cè)定分析。B.3.4結(jié)果判斷a)經(jīng)SFTS病毒特異性抗體檢測(cè)用于分離病毒的細(xì)胞，熒光陽性說明標(biāo)本中存在感染性SFTS病毒。b)連續(xù)傳代培養(yǎng)，檢出病毒特異性核酸拷貝數(shù)有所上升，說明標(biāo)本中存在感染性SFTS病毒。B.3.5意義分離到病毒可確診，陰性結(jié)果不能排除病毒感染。

（資料性）

發(fā)熱伴血小板減少綜合征病原學(xué)、流行病學(xué)、臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和鑒別診斷病原學(xué)發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒（Severefeverwiththrombocytopeniasyndromevirus，SFTSV）為分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒，呈球形，表面為脂質(zhì)雙層包膜，表面有刺突，由病毒糖蛋白構(gòu)成，基于病毒所引發(fā)疾病的主要臨床特征而命名。病毒學(xué)分類屬白蛉纖細(xì)病毒科（Phenuiviridae），班達(dá)病毒屬（Bandavirusgenus），分類名為大別班達(dá)病毒（Bandavirusdabieense）。2014年，國(guó)際病毒分類命名委員會(huì)（internationalcommitteeontaxonomyofviruses，ICTV）將其歸類于布尼亞病毒科白蛉病毒屬，命名為SFTS病毒（SFTSvirus）。2016年，ICTV對(duì)布尼亞樣病毒進(jìn)行重新分類，于2017年3月，將原布尼亞病毒科白蛉病毒屬（Phlebovirus）和無包膜的單股負(fù)鏈RNA植物病毒纖細(xì)病毒屬（Tenuivirus）的詞根（Phlebovirus+Tenuivirus→Phenuiviridae）組合而成白蛉纖細(xì)病毒科或簡(jiǎn)稱為白纖病毒科。班達(dá)病毒屬的命名根據(jù)該屬首個(gè)分離病毒所在地印度班扎（Bhanja）和SFTS病毒的首次發(fā)現(xiàn)時(shí)的命名大別山病毒（DabieMountainvirus,DBMV）的融合（Bhanjavirus+DabieMountainvirus→Bandavirus）。病毒基因組由3個(gè)片段組成，分別為大（L)、中(M)、小(S）片段，分別編碼RNA依賴性RNA聚合酶（RdRp或L蛋白）、糖蛋白（GPs）Gn和Gc，以及核衣殼蛋白（N）和非結(jié)構(gòu)蛋白（NSs），每個(gè)病毒顆粒至少應(yīng)包裝一個(gè)拷貝L、M和S核衣殼，但成熟的病毒顆粒內(nèi)并不一定包裝等摩爾比的核衣殼，病毒顆粒內(nèi)可包裝相等或非等摩爾比L、M和SRNA。SFTSV可通過自然突變、重組和重配等方式而進(jìn)化，形成豐富的遺傳多樣性?；诨蚪M序列生物信息分析，可將病毒分為A～F六個(gè)基因型，基因型別分布呈現(xiàn)一定空間聚集特征，主要流行區(qū)多存在多個(gè)基因型同時(shí)流行，提示SFTSV可能存在較遠(yuǎn)距離的跨區(qū)域傳播。生化和形態(tài)學(xué)研究顯示，SFTSV總化學(xué)含量分別為2%RNA、58%蛋白質(zhì)、33%脂肪和7%碳水化合物。病毒離子的沉降系數(shù)在400～500s之間，蔗糖中的浮力密度為1.16～1.18g/cm3，氯化銫（CsCl）為1.20～1.21g/cm3。SFTSV在4℃能保持相對(duì)穩(wěn)定，1周內(nèi)病毒感染性無明顯下降。室溫（25℃）狀態(tài)下6h，物體表面病毒可維持感染性。對(duì)熱敏感，37℃保存，感染性下降較快，60℃下30分鐘可滅活病毒。對(duì)脂質(zhì)溶劑或非離子去污劑敏感，可去除病毒包膜，導(dǎo)致病毒失去感染性。對(duì)強(qiáng)酸、堿、紫外線和常用含氯消毒劑等敏感，可滅活病毒。在pH3.0條件下，病毒活力有損害，但不能完全滅活病毒。C.2流行病學(xué)發(fā)熱伴血小板減少綜合征流行是病毒、宿主動(dòng)物、蜱媒生物和易感者之間的相互作用的結(jié)果，常受流行區(qū)溫度、濕度和降水等氣候條件、生態(tài)環(huán)境、宿主動(dòng)物種群動(dòng)態(tài)、經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展、以及人群生產(chǎn)生活特征等因素影響。自2010年，本病病因明確以來，我國(guó)發(fā)熱伴血小板減少綜合征波及地區(qū)不斷擴(kuò)大，每年報(bào)告病例數(shù)呈不斷上升趨勢(shì)。C.2.1傳染源C.2.1.1蜱攜帶病毒的蜱為重要傳染源。蜱發(fā)育過程為變態(tài)發(fā)育，分為卵、幼蟲、若蟲和成蟲四個(gè)階段，除卵外的所有發(fā)育階段均需吸血，更換宿主。已知有多種蜱可感染和攜帶SFTS病毒，長(zhǎng)角血蜱為主要儲(chǔ)存宿主和傳播媒介，病毒可經(jīng)卵垂直傳播和跨期傳播，曾在蜱的卵、幼蟲、若蟲和成蟲等不同發(fā)育階段檢出病毒。長(zhǎng)角血蜱具有孤雌生殖的特性，易于造成種群及其所攜帶病原大范圍播散。地方性流行區(qū)流行病學(xué)調(diào)查顯示，蜱的帶毒率波動(dòng)范圍約為0.6%～5%。蜱叮咬和吸食宿主的血液可對(duì)宿主造成直接傷害，如皮膚過敏反應(yīng)、阻礙幼畜發(fā)育等，同時(shí)可傳播病毒、細(xì)菌、立克次體、原蟲等多種重要病原體，主要通過唾液、基底神經(jīng)節(jié)體液、中腸返流、排泄物等傳播，導(dǎo)致蜱傳疾病。蜱蟲的分布與自然環(huán)境密切相關(guān)，環(huán)境變化，特別是氣候和景觀的變化，可能促進(jìn)了蜱的空間擴(kuò)張和SFTSV的傳播。C.2.1.2患者人感染SFTS病毒后可產(chǎn)生較高水平病毒血癥，急性期患者血液、血性分泌物、排泄物及其污染物中均可檢出病毒。少數(shù)患者病毒血癥期長(zhǎng)，整個(gè)病程中持續(xù)存在，尤其是部分重癥和死亡病例，在病程后期血液中感染性病毒含量高，傳染性強(qiáng)。無防護(hù)接觸患者（死者）血液、血性分泌物、排泄物及其污染物可造成病毒傳播。國(guó)內(nèi)外均有SFTS患者引發(fā)院內(nèi)感染以及因參加本病死亡者不安全葬禮引發(fā)聚集性疫情的報(bào)道。C.2.1.3動(dòng)物感染病毒的動(dòng)物可為傳染源，動(dòng)物儲(chǔ)存宿主尚不明確。牛、羊等家養(yǎng)動(dòng)物和嚙齒類動(dòng)物、刺猬等野生動(dòng)物均可感染病毒，地方性流行區(qū)，家養(yǎng)動(dòng)物，特別是牛和山羊，SFTSV感染率高，大多數(shù)動(dòng)物感染后，病毒血癥水平低，持續(xù)時(shí)間短，多無明顯疾病癥狀，可發(fā)揮病毒擴(kuò)散宿主作用。有報(bào)道顯示，貓、犬、狐貍、水貂、駱駝等動(dòng)物感染后可出現(xiàn)明顯癥狀甚至死亡，包括野鹿、野豬、野生獾和果子貍等野生動(dòng)物中，可檢測(cè)到病毒抗原和抗體，病毒血癥期約為5-10天，接觸患病或死亡動(dòng)物及其污染物可造成病毒傳播。C.2.2傳播途徑C.2.2.1主要經(jīng)攜帶病毒的蜱叮咬傳播發(fā)熱伴血小板減少綜合征主要經(jīng)攜帶病毒的蜱叮咬傳播，以長(zhǎng)角血蜱為主。除長(zhǎng)角血蜱外，曾從褐黃血蜱、龜形花蜱、豪豬血蜱、臺(tái)灣血蜱、巨棘血蜱等蜱中分離到病毒，從嗜群血蜱、血紅扇頭蜱、微小牛蜱、微小扇頭蜱、草原革蜱、亞洲璃眼蜱、日本硬蜱等蜱中檢出病毒RNA。C.2.2.2可通過接觸引發(fā)人與人之間傳播人與人之間傳播主要通過接觸患者或因本病死亡尸體血液、血性分泌物、排泄物及其污染物等引發(fā)。特定條件下，血液或血性分泌物、排泄物及其污染物可因噴濺、溢灑或干燥后攪動(dòng)等原因形成氣溶膠，通過口鼻腔粘膜或沾染皮膚破損處而傳播。C.2.2.3可通過接觸發(fā)病或本病死亡動(dòng)物引發(fā)動(dòng)物到人的傳播有通過接觸發(fā)病或死亡的貓、犬、駱駝、果子貍、狐貍等動(dòng)物而感染的報(bào)道。C.2.3人群易感性人群普遍易感。感染后可獲得免疫力，血液中特異性抗體可持續(xù)數(shù)年。在本病流行地區(qū)，在丘陵、山地、林地等區(qū)域生活的居民、從事戶外生產(chǎn)活動(dòng)的人群及旅游者感染風(fēng)險(xiǎn)較高?；颊叩尼t(yī)護(hù)、陪伴和探視人員，以及死亡患者殮殯人員如未進(jìn)行規(guī)范防護(hù)，具有較高的感染風(fēng)險(xiǎn)。C.2.4流行特征本病高度散發(fā)，具有一定空間聚集性。本病的流行受氣候、環(huán)境、蜱的季節(jié)性消長(zhǎng)以及人群與蜱接觸機(jī)會(huì)等因素影響，發(fā)病具有明顯季節(jié)性，各地流行季節(jié)及季節(jié)高峰有所差異。我國(guó)一般每年3月份報(bào)告病例數(shù)開始逐漸增多，5～7月達(dá)發(fā)病高峰，之后發(fā)病數(shù)逐步下降，部分地區(qū)可在9～10月份出現(xiàn)小的發(fā)病高峰。截止2023年，中國(guó)大陸地區(qū)有27個(gè)省份報(bào)告發(fā)熱伴血小板減少綜合征病例，若診療不及時(shí)，中老年病例病死率可高達(dá)20%以上。病例分布呈現(xiàn)一定空間聚集性，絕大部分病例發(fā)生在山東、河南、安徽、湖北、遼寧、浙江和江蘇等7個(gè)省份。韓國(guó)、日本、越南、泰國(guó)、緬甸等國(guó)家也有本地感染病例報(bào)告，日本、韓國(guó)均于2013年首次報(bào)告本地病例。截至2023年，日本中西部的長(zhǎng)崎縣、鹿兒島縣、山口縣及宮崎縣等30個(gè)府縣共報(bào)告930例病例（死亡103例，病死率11.08%）,絕大多數(shù)病例為40歲以上病例（占總病例數(shù)的97.4%），病例多發(fā)生于4-10月；韓國(guó)全國(guó)共報(bào)告1885例病例（死亡354例，病死率為18.8%）,主要分布于濟(jì)州、江原道、慶尚北道、忠清南道等地,病例多發(fā)生在5-10月份。C.2.4.1季節(jié)性發(fā)熱伴血小板減少綜合征全年均可發(fā)病，多發(fā)于春夏季節(jié)。一般3月份報(bào)告病例數(shù)逐步增多，5～7月達(dá)到高峰，之后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，個(gè)別省份9-10月出現(xiàn)小高峰，11月后下降，12月至次年2月僅有少數(shù)病例報(bào)告。各地發(fā)病高峰受氣候、地理位置等因素影響而有所差異。C.2.4.2地理分布本病以散發(fā)為主，具有一定地域聚集性。近年來，報(bào)告病例地區(qū)呈逐步擴(kuò)大趨勢(shì)。在中國(guó)，發(fā)熱伴血小板減少綜合征多分布在山區(qū)和丘陵地帶，包括臺(tái)灣省在內(nèi)累計(jì)28個(gè)省份曾有病例報(bào)告，主要集中在山東、河南、安徽、湖北、遼寧、浙江、江蘇等7個(gè)省份。C.2.4.3年齡、性別、職業(yè)分布各年齡組人群均可發(fā)病，95%以上報(bào)告病例集中在40歲以上人群，病死率隨年齡增長(zhǎng)相應(yīng)增高?；颊咝詣e差別不明顯，病例職業(yè)以農(nóng)民為主，85%以上的病例為農(nóng)民，多為農(nóng)、林業(yè)從業(yè)者。C.3臨床表現(xiàn)潛伏期為5d～14d，多為6d～9d。本病起病急，臨床上病程可分三期：初期、極期和恢復(fù)期。C.3.1初期又稱發(fā)熱期。為病初1d～3d，病程長(zhǎng)者可至1周，發(fā)熱，體溫多為38℃～40℃，可高達(dá)40℃以上，伴乏力以及食欲不振、惡心、嘔吐、腹痛（多為腹壁觸痛）、腹瀉（多為無痛性稀便）等消化道癥狀，部分患者出現(xiàn)肌肉酸痛、腹瀉，少數(shù)出現(xiàn)神志淡漠。查體常見單側(cè)腹股溝或頸部、腋窩等淺表淋巴結(jié)腫大伴觸痛，較大者局部紅、腫、熱、痛明顯，一般無皮疹。C.3.2極期亦稱多器官功能損害期。一般發(fā)生在病后1周左右，常與可與發(fā)熱期重疊，持續(xù)高熱，可呈稽留熱，部分患者發(fā)熱減退后癥狀繼續(xù)加重，出現(xiàn)極度乏力、消化道癥狀明顯加重。部分患者可出現(xiàn)下頜、四肢等不自主抖動(dòng)伴肌張力增高。重癥患者可出現(xiàn)皮膚瘀斑、消化道出血、肺出血、煩躁不安、譫妄，甚至抽搐、昏迷，可因循環(huán)衰竭、呼吸衰竭、彌漫性血管內(nèi)凝血等死亡。C.3.3恢復(fù)期一般病后2周左右，體溫逐漸恢復(fù)正常，癥狀逐漸緩解，有并發(fā)癥者病程可延長(zhǎng)。C.3.4預(yù)后大多數(shù)患者預(yù)后良好，但老年患者、既往有基礎(chǔ)疾病、出現(xiàn)精神神經(jīng)癥狀、出血傾向明顯以及LHD、AST、ALT、CK等血清酶活性持續(xù)增高的患者，預(yù)后差。C.4實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)本病發(fā)病早期無特異性，確診需要病原學(xué)和免疫學(xué)檢測(cè)陽性結(jié)果。SFTS病毒屬二類病原體，具有較高致病性，涉及感染性樣本的操作，如病毒分離培養(yǎng)、未經(jīng)培養(yǎng)的陽性或疑似陽性樣本的滅活、檢測(cè)等需在生物安全二級(jí)（BSL-2）或以上實(shí)驗(yàn)室開展。動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)在動(dòng)物生物安全三級(jí)（ABSL-3）實(shí)驗(yàn)室開展。滅活后的樣本核酸檢測(cè)，可在相應(yīng)的專門區(qū)域或?qū)嶒?yàn)室進(jìn)行，嚴(yán)格按照分區(qū)操作原則操作。實(shí)驗(yàn)室個(gè)人防護(hù)應(yīng)按照相應(yīng)實(shí)驗(yàn)室生物安全防護(hù)等級(jí)要求執(zhí)行。C.4.1臨床實(shí)驗(yàn)室檢查早期臨床實(shí)驗(yàn)室檢查可見具有提示意義的診斷指標(biāo)。發(fā)病早期血常規(guī)檢查可見血小板和白細(xì)胞計(jì)數(shù)下降。白細(xì)胞計(jì)數(shù)下降多為（1.0～３.0）×109/Ｌ，重癥者可＜1.0×109/Ｌ；血小板計(jì)數(shù)減少，多為（30～60）×109/Ｌ，重癥者可＜30×109/Ｌ。發(fā)病早期外周血白細(xì)胞輕度降低,隨著病情進(jìn)展至極期，外周血白細(xì)胞、血小板進(jìn)行性降低，外周血白細(xì)胞下降可先于血小板減少。生物化學(xué)檢查可見乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）及谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）等升高，可進(jìn)行性上升，達(dá)正常值10倍以上，提示多臟器功能受損。重型、危重型病例鐵蛋白、D-二聚體、CRP、淀粉酶、脂肪酶、炎癥因子如白細(xì)胞介素-6（IL-6）等均可顯著升高。尿常規(guī)檢查，半數(shù)以上病例出現(xiàn)蛋白尿（＋～＋＋＋），少數(shù)病例出現(xiàn)尿潛血或血尿。凝血功能檢查可現(xiàn)凝血功能異常，血漿凝血酶原時(shí)間(PT)和活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)延長(zhǎng)。C.4.2病原學(xué)檢測(cè)C.4.2.1樣本采集、保存和運(yùn)輸病原特異性檢測(cè)，一般采集血標(biāo)本，可為血清、全血、血漿等，也可采集呼吸道、消化道、尿液和糞便標(biāo)本。血清采集時(shí)，用無菌真空管，采集患者急性期（發(fā)病后1周內(nèi)）和恢復(fù)期（與急性期標(biāo)本采集間隔不少于3天，一般發(fā)病后2-4周）非抗凝血標(biāo)本3-5mL，及時(shí)分離血清，分裝保存于帶螺旋蓋、內(nèi)有墊圈的凍存管內(nèi)。如血液樣本自采集到實(shí)驗(yàn)室接種細(xì)胞的時(shí)間少于1天，可在低溫或室溫條件下轉(zhuǎn)運(yùn)，如超過24h者，需將標(biāo)本保存在-70℃以下，干冰運(yùn)輸，用于病毒特異性核酸、抗原和抗體檢測(cè)及病原體分離。采集患者呼吸道、分泌物、嘔吐物等樣本時(shí)，可應(yīng)用拭子進(jìn)行采集。將采集后的拭子標(biāo)本放置在含有少量無菌鹽水或磷酸鹽緩沖液的無菌容器中，使用商業(yè)化的拭子時(shí)，標(biāo)本保存液應(yīng)適合用于相應(yīng)的檢測(cè)目的，以上標(biāo)本如果1小時(shí)以內(nèi)不能開展檢測(cè)，均應(yīng)低溫保存和運(yùn)輸。C.4.2.2病原學(xué)檢測(cè)一般在SFTS發(fā)病后7天內(nèi)患者血標(biāo)本病原學(xué)檢測(cè)檢出率高，在發(fā)病10天以上的患者血液中檢出病毒核酸、分離到病毒的報(bào)道并不少見，部分死亡病例，整個(gè)病程均可檢出高載量病毒。用于病毒分離的血液標(biāo)本通常需采集3～5mL，采集的方式取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?shí)驗(yàn)室偏好，可為全血、白細(xì)胞、血漿或血清。全血、白細(xì)胞和血漿需要收集到含有抗凝劑的試管中，常用的抗凝劑是乙二胺四乙酸（EDTA)（紫管）、肝素（綠管）、檸檬酸葡萄糖（黃管），血清標(biāo)本需要收集到不含抗凝劑的試管中（紅管）或含有促凝劑的管。抗凝劑中，肝素對(duì)某些聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）具有抑制作用，影響核酸篩查檢測(cè)結(jié)果。C.4.2.3免疫學(xué)檢測(cè)SFTSV感染進(jìn)入恢復(fù)期后（發(fā)病7天以后），隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，患者標(biāo)本中病毒特異性核酸、抗原等指標(biāo)的檢出率不斷降低，抗體的檢出率逐步升高。免疫學(xué)檢測(cè)方法易于形成適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)使用和高通量篩查檢測(cè)使用的檢測(cè)試劑，在疾病診斷和流行病學(xué)調(diào)查方面具有重要意義。IgM抗體可在患者發(fā)病2～3天后檢出，發(fā)病5天后檢出率明顯上升，可持續(xù)到發(fā)病后6個(gè)月，部分可達(dá)一年以上。IgG抗體在發(fā)病7～10天后檢出率高，可持續(xù)5年以上。因此，一般單份標(biāo)本抗體檢測(cè)不能實(shí)現(xiàn)確診目的，雙份血清抗體陽轉(zhuǎn)或恢復(fù)期滴度較急性期4倍及以上增高者，可確診。如病毒核酸和抗原等指標(biāo)檢測(cè)陰性，雙份血清標(biāo)本IgG抗體檢測(cè)均為陰性，可做排除診斷；少數(shù)重癥患者，從發(fā)病到死亡整個(gè)病程中都不能檢出特異性抗體。C.5鑒別診斷C.5.1與其他蜱傳疾病相鑒別蜱屬于節(jié)肢動(dòng)物門蛛形綱蜱螨目蜱總科，蜱總科又分為硬蜱科及軟蜱科。目前，全世界已知蜱類800余種，我國(guó)已發(fā)現(xiàn)110余種，各省份均有分布，不同地區(qū)優(yōu)勢(shì)蜱種類可能不同。蜱叮咬人后可引起過敏、潰瘍或發(fā)炎等癥狀，一般均較輕微，少數(shù)患者會(huì)經(jīng)歷虛弱或麻痹，并逐漸向