(高清版)GB∕T 39303-2020 廢水處理系統(tǒng)微生物樣品前處理通 用技術(shù)規(guī)范

G76中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)廢水處理系統(tǒng)微生物樣品前處理通用技術(shù)規(guī)范G-國家市場監(jiān)督管理總局國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)ⅠGB／T39303—2020本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由中國石油和化學(xué)工業(yè)聯(lián)合會(huì)提出。本標(biāo)準(zhǔn)由全國化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC63)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：南京大學(xué)、南京大學(xué)宜興環(huán)保研究院、南京江島環(huán)境科技研究院有限公司、中海油天津化工研究設(shè)計(jì)院有限公司、藍(lán)保（廈門）水處理科技有限公司、東莞理工學(xué)院、國網(wǎng)天津市電力公司電力科學(xué)研究院、石家莊給源環(huán)?？萍加邢薰?、珠海京工檢測技術(shù)有限公司。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：任洪強(qiáng)、何席偉、張徐祥、白瑩、呂奮勇、牛軍峰、蘇展、耿金菊、李永廣、王慶、1GB／T39303—2020廢水處理系統(tǒng)微生物樣品前處理通用技術(shù)規(guī)范本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了廢水處理系統(tǒng)中微生物樣品的現(xiàn)場處理、微生物菌種分離與保藏、微生物樣品宏基因組DNA提取以及微生物樣品的保存。本標(biāo)準(zhǔn)適用于采用生物處理工藝（活性污泥法工藝和生物膜法工藝）的廢水處理系統(tǒng)中微生物樣品的現(xiàn)場處理、提取與保存。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。污水監(jiān)測技術(shù)規(guī)范SN/T2632微生物菌種常規(guī)保藏技術(shù)規(guī)程3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1微生物樣品已培養(yǎng)或已提取純化的，可直接應(yīng)用于分析研究的各種菌株（包括細(xì)菌、真菌、放線菌等）、DNA等遺傳物質(zhì)；以及包含上述菌株和遺傳物質(zhì)的廢水處理系統(tǒng)中的進(jìn)出水樣品、活性污泥樣品、生物膜樣品等。3.2前處理在開展廢水處理系統(tǒng)微生物研究工作之前對采集的各種微生物樣品所進(jìn)行的各種處理。3.3宏基因組不經(jīng)菌株分離篩選步驟，直接從環(huán)境樣品中提取的遺傳物質(zhì)(DNA或RNA),包含了樣品中所有微生物的遺傳信息。[GB/T30744—2014,定義3.1.6]4縮略語下列縮略語適用于本文件。十六烷基三甲基溴化銨(脫氧核糖核酸(乙二胺四乙酸(2GB／T39303—2020肉湯培養(yǎng)基(光密度(RNaseA：核糖核酸酶A十二烷基硫酸鈉(配成的緩沖液三羥甲基氨基甲烷(16SrRNA基因：細(xì)菌染色體上編碼核糖體RNA16S亞基的基因18SrRNA基因：真核生物染色體上編碼核糖體RNA18S亞基的基因5試劑或材料5.1本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑和水，除非另有規(guī)定，應(yīng)使用分析純試劑和電阻率大于18MΩ·cm的超純水。5.2無水乙醇。5.4鹽酸溶液：1mol/L。量取83mL鹽酸，緩慢加入917mL水中，混勻。5.5氫氧化鈉溶液：40g/L。5.6重鉻酸鉀溶液：5g/L。溶液5.8生理鹽水：稱取9gNaCl,溶于1L水中?；靹蚝笤诟邏簻缇佒?21℃滅菌20min（簡稱滅菌處乙醇溶液5.111/3000孟加拉紅溶液（玫瑰紅水溶液稱取1g孟加拉紅溶解于3L水中。鏈霉素溶液貯液稱取溶解于水中值至8.0,加水稀釋至1L。溶液移取L容量瓶中用水稀釋至刻度。抽提緩沖液稱取磷酸氫二鈉(磷酸二氫鈉(氯化鈉和溶解于水中加入貯液，用鹽酸溶液和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8.0,加水稀釋至1L后滅菌處理。溶液稱取溶解于水中加入貯液用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為8.0,加水稀釋至1L后滅菌處理。5.17酚-氯仿-異戊醇溶液：將500mLTris飽和酚、480mL氯仿和20mL異戊醇溶液混合均勻，貯存于棕色玻璃瓶中，4℃可保存兩周。5.18LB培養(yǎng)基：稱取10g蛋白陳，5g酵母膏，10g氯化鈉，18g瓊脂粉溶解于1L水中，混勻后滅菌處理。酸鉀溶液，再加入18g瓊脂粉，混勻后滅菌處理。解于800mL水中，加入100mL1/3000孟加拉紅溶液，再加入18g瓊脂粉，混勻后滅菌處理。冷卻至50℃~60℃時(shí)，加入100mL鏈霉素溶液，混勻。溶菌酶貯液稱取溶菌酶溶解于溶液保存。貯液稱取溶解于預(yù)先用鹽酸溶液調(diào)節(jié)3GB／T39303—2020值至溶液加熱按每管分裝保存。無菌濾膜：直徑47mm,孔徑為0.22μm或0.45μm的混合纖維素酯濾膜。5.24離心管：材質(zhì)為聚丙烯。6儀器設(shè)備6.1真空泵：真空度大于或等于-80kPa,空載流量大于或等于20L/min。6.2砂芯過濾器：濾頭直徑為50mm,接收瓶體積為500mL~1000mL的砂芯過濾器。6.3超低溫冰箱：最低保存溫度為-80℃。高速冷凍離心機(jī)配有轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)速6.6生化培養(yǎng)箱：溫度調(diào)節(jié)范圍0℃~60℃。高壓滅菌鍋溫度可升至壓力可維持6.9恒溫水浴鍋：溫度調(diào)節(jié)范圍室溫~99℃。光學(xué)顯微鏡放大倍數(shù)微量移液槍渦旋儀轉(zhuǎn)速6.13超微量紫外分光光度計(jì)：波長范圍200nm~850nm。7樣品的現(xiàn)場處理7.1.1樣品的現(xiàn)場處理包括樣品的分裝、固定與現(xiàn)場保存，樣品包括水樣、活性污泥樣品以及生物膜樣品。7.1.2采樣前應(yīng)了解廢水處理系統(tǒng)的處理工藝、廢水類型和廢水排放規(guī)律等情況，并按HJ91.1的規(guī)定進(jìn)行采樣。7.1.3用于分樣和裝樣的器具均應(yīng)滅菌處理，如現(xiàn)場條件無法實(shí)現(xiàn)，應(yīng)用75%乙醇溶液擦拭后使用。7.2水樣的現(xiàn)場處理7.2.1用于菌種分離的水樣處理將無菌濾膜置于砂芯過濾器內(nèi)，使用真空泵對水樣進(jìn)行抽濾。濾膜的過水量視水樣的渾濁程度而定，通常進(jìn)水水樣每張濾膜的過水量為50mL~200mL,出水水樣每張濾膜過水量為500mL~1000mL;水樣過濾應(yīng)于2h內(nèi)完成。過濾后，將濾膜放入50mL離心管中，于1℃~5℃保存。7.2.2用于宏基因組DNA提取的水樣處理7.2.2.1按7.2.1操作將水樣進(jìn)行過濾處理，過濾后，將濾膜放入50mL離心管中，于-20℃保存。7.2.2.2若水樣不能進(jìn)行現(xiàn)場過濾，應(yīng)將水樣置于1℃~5℃保存，并于24h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行過濾處理。7.3活性污泥樣品的現(xiàn)場處理7.3.1用于鏡檢或菌種分離的活性污泥樣品處理將采集的泥水混合物靜置5min~15min至泥水產(chǎn)生明顯分層，棄去上層清液，將下層活性污泥裝4GB／T39303—2020入50mL離心管中，于1℃~5℃保存。7.3.2用于宏基因組DNA提取的活性污泥樣品處理7.3.2.1將采集的泥水混合物靜置5min~15min至泥水產(chǎn)生明顯分層，棄去上層清液，將下層活性污泥裝入50mL離心管中，于-20℃保存。7.3.2.2若現(xiàn)場無法進(jìn)行-20℃保存，可在裝有活性污泥的離心管中加入等體積的無水乙醇進(jìn)行固定后于1℃~5℃保存。7.4生物膜樣品的現(xiàn)場處理7.4.1用于鏡檢或菌種分離的生物膜樣品處理7.4.1.1用鏟子或刀片等工具將生物膜從反應(yīng)器內(nèi)的填料（主要見于移動(dòng)床生物膜反應(yīng)器工藝、生物接觸氧化工藝、生物濾池工藝等）、生物轉(zhuǎn)盤（主要見于生物轉(zhuǎn)盤工藝）或?yàn)V膜（主要見于膜生物反應(yīng)器工藝）表面刮下，裝入50mL離心管中，于1℃~5℃保存。7.4.1.2對于難以刮取的填料附著型生物膜樣品，直接采集其附著的部分填料裝入聚丙烯采樣瓶中（采樣瓶規(guī)格可視填料尺寸而定于1℃~5℃保存。7.4.2用于宏基因組DNA提取的生物膜樣品處理7.4.2.1用鏟子或刀片等工具將生物膜從反應(yīng)器內(nèi)的填料、生物轉(zhuǎn)盤或?yàn)V膜表面刮下，裝入50mL離心管中，于-20℃保存。7.4.2.2對于難以刮取的填料附著型生物膜樣品，直接采集其附著的部分填料裝入聚丙烯采樣瓶中（采樣瓶規(guī)格可視填料尺寸而定于-20℃保存。7.4.2.3若現(xiàn)場無法進(jìn)行-20℃保存，可在裝有生物膜的離心管或裝有填料的采樣瓶中加入50%乙醇溶液，將生物膜或填料浸沒、固定，于1℃~5℃保存。7.5數(shù)據(jù)記錄將采樣時(shí)間、地點(diǎn)、樣品類型、工藝類型、采樣方式、處理方式、樣品體積、保存方式等參數(shù)記錄于廢水處理系統(tǒng)微生物樣品現(xiàn)場處理記錄表（參見附錄A中表A.1)。8菌種分離與保藏8.1.1菌種分離是指從所采集的水樣、活性污泥以及生物膜樣品中分離微生物菌株，包括細(xì)菌、放線8.1.2進(jìn)行微生物菌種分離應(yīng)選用1℃~5℃保存的未經(jīng)固定的樣品。8.1.3菌種分離與保藏工作應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，所用的離心管、槍頭、配制的溶液均應(yīng)滅菌處理，冷卻后使用。8.1.4細(xì)菌的分離篩選采用LB培養(yǎng)基；放線菌的分離篩選采用高氏一號(hào)培養(yǎng)基；真菌的分離篩選采用馬丁氏培養(yǎng)基。8.2微生物的分離培養(yǎng)8.2.1分離培養(yǎng)樣品前處理8.2.1.1含菌濾膜的前處理：取經(jīng)7.2.1處理而得的含菌濾膜一張，在超凈工作臺(tái)中剪碎裝入50mL離5GB／T39303—2020心管中，加入20mL生理鹽水使其浸沒，在渦旋儀上振蕩1min制成菌懸液，除去濾膜，取10mL菌懸液待用。8.2.1.2活性污泥的前處理：取1mL經(jīng)7.3.1處理而得的活性污泥，用生理鹽水稀釋到10mL,在渦旋儀上振蕩30s使其混勻后待用。8.2.1.3生物膜的前處理：對于從填料或生物轉(zhuǎn)盤上刮下的生物膜，取1mL經(jīng)7.4.1.1處理而得的生物膜，用生理鹽水稀釋到10mL,在渦旋儀上振蕩30s使其混勻后待用。對于附著于填料上的生物膜，取10g經(jīng)7.4.1.2處理而得的填料放入三角瓶中（三角瓶體積視填料尺寸而定加入生理鹽水使其浸沒，在250r/min的振蕩培養(yǎng)箱振蕩2min制成菌懸液，取10mL菌懸液待用。8.2.2.1取1mL8.2.1制得的菌懸液，用生理鹽水稀釋到10mL,制成108.2.2.2取1mL8.28.2.2.3按上述步驟依次稀釋成10-3~10-9的樣品稀釋液，振蕩均勻。取各梯度樣品稀釋液100μL分別涂布于培養(yǎng)基平板上，LB培養(yǎng)基37℃倒置培養(yǎng)2d~3d,高氏一號(hào)培養(yǎng)基28℃倒置培養(yǎng)3d~5d,馬丁氏培養(yǎng)基28℃倒置培養(yǎng)5d~7d,觀察菌落生長情況。8.2.2.5將長出的單菌落分別轉(zhuǎn)接到新的相同培養(yǎng)基平板上，并做好相應(yīng)的記號(hào)，于相同溫度下繼續(xù)培養(yǎng)。8.2.2.6將平板上長出的單菌落多次劃線分離培養(yǎng)，根據(jù)平板上的菌落形態(tài)和顏色，輔以鏡檢檢測，直至獲得純的單菌落。8.2.2.7對獲得的單菌落，通過比較細(xì)菌和放線菌的16SrRNA基因序列，或真菌的18SrRNA基因序列，進(jìn)行菌種鑒定，排除重復(fù)的菌株。按照SN/T2632操作。將所分離的菌株來源、種屬、培養(yǎng)條件、保存方式等相關(guān)參數(shù)記錄于廢水處理系統(tǒng)微生物分離鑒定記錄表（參見表A.2)。9微生物樣品宏基因組DNA提取與保存9.1.1進(jìn)行宏基因組DNA提取應(yīng)選用-20℃保存的樣品，或經(jīng)乙醇固定的樣品。9.1.2宏基因組DNA提取過程中，所用的離心管、槍頭、配制的溶液均應(yīng)滅菌處理，冷卻后使用。9.1.3用超微量分光光度計(jì)測定DNA溶液的濃度和純度，宏基因組DNA應(yīng)達(dá)到的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為：之間且9.2宏基因組DNA提取樣品前處理9.2.1含菌濾膜前處理：取經(jīng)7.2.2處理而得的含菌濾膜二至四張，在超凈工作臺(tái)用滅菌剪刀將含菌濾膜剪成碎片，浸泡于裝有生理鹽水的50mL離心管中，充分振蕩制成菌懸液，除去濾膜，菌懸液經(jīng)8000r/min離心分離10min后棄去上層清液，沉淀用于宏基因組DNA提取。9.2.2活性污泥前處理：將經(jīng)7.3.2處理的活性污泥于8000r/min下離心分離2min,棄去上層清液，6GB／T39303—2020沉淀用于宏基因組DNA提取。9.2.3生物膜前處理：對于從填料或生物轉(zhuǎn)盤上刮下的生物膜，若經(jīng)過固定，則將混合物于8000r/min下離心分離10min,棄去上層清液，沉淀用于宏基因組DNA提取，未經(jīng)固定的生物膜可直接用于宏基因組DNA提??；對于填料附著型生物膜，將填料浸泡于裝有生理鹽水的三角瓶中，振蕩制成菌懸液，于8000r/min下離心分離10min后棄去上層清液，沉淀用于宏基因組DNA提取。9.3宏基因組DNA提取條件下振蕩30min。加入溶液和溶菌酶貯液繼續(xù)振蕩加入溶液于水浴30min后，6000r/min離心分離10min,將上層清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。向沉淀中加入抽提緩沖液和溶液于水浴下離心分離10min,將上層清液與9.3.2中的上清液合并于同一離心管中。測量合并后的上層清液體積，加入RNaseA貯液至其終濃度為200μg/mL,于37℃水浴15min。9.3.6加入等體積的酚-氯仿-異戊醇溶液，輕輕搖勻，13000r/min下離心分離15min,將上層水相移入新的離心管中，加入等體積的異丙醇，于-20℃中沉淀1h后，于4℃下13000r/min離心分離10min,棄去上層清液。向沉淀中加入200μL無水乙醇，放置3s~5s后棄去無水乙醇，再重復(fù)一次，然后將沉淀物放置于超凈工作臺(tái)中吹干，加入50μLTE溶液溶解沉淀物，即為DNA溶液。注1：宏基因組D