動(dòng)物源產(chǎn)氣莢膜梭菌分離與鑒定技術(shù)規(guī)程

ICSFORMTEXT67.120.10?CCSFORMTEXTX22FORMTEXT?????FORMTEXTNYFORMTEXTNY/TFORMTEXTXXXX—XXXXFORMTEXT?????動(dòng)物源產(chǎn)氣莢膜梭菌分離與鑒定技術(shù)規(guī)程TechnicalcodeofpracticeforisolationandidentificationofClostridiumperfringensfromanimals（送審稿）FORMTEXTXXFORMTEXTXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX發(fā)布FORMTEXTXXFORMTEXTXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX實(shí)施FORMTEXT中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部???發(fā)布NY/TXXXXX—2022I前??言本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本標(biāo)準(zhǔn)的某些內(nèi)容可能涉及專(zhuān)利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專(zhuān)利的責(zé)任。本文件由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜牧獸醫(yī)局提出。本文件由全國(guó)獸藥殘留與耐藥性控制專(zhuān)家委員會(huì)歸口。本文件起草單位：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。本文件起草人：王少林，趙琪，吳聰明，張純萍，張仕泓，王鶴佳，周宇晴，徐士新，陳安杰，崔明全，李霆，程敏。

PAGEPAGE10動(dòng)物源產(chǎn)氣莢膜梭菌分離與鑒定技術(shù)規(guī)程1范圍本文件確立了動(dòng)物源產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridiumperfringens）分離與鑒定的程序，規(guī)定了樣品采集與保存運(yùn)輸、分離純化、篩查與鑒定、菌種保藏、生物安全要求的操作指示，描述了相應(yīng)的試驗(yàn)方法。本文件適用于動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)對(duì)動(dòng)物直腸/泄殖腔拭子、新鮮糞便、腸道內(nèi)容物等樣品中產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離和鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4789.13食品安全標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗(yàn)GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求NY/T1948獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室生物安全要求通則NY/T4141動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)樣品采集技術(shù)規(guī)程3術(shù)語(yǔ)與定義本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4試劑或材料4.1要求除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純，水為符合GB/T6682規(guī)定的三級(jí)水，培養(yǎng)基按附錄A配制或用商品化產(chǎn)品。4.2試劑4.2.1滅菌液體石蠟。4.2.2PCR預(yù)混液（2×PCRMasterMix）。4.2.350×TAE緩沖液。4.2.4瓊脂糖。4.2.5DNAMarker（2000bp）。4.2.6α-氰-4-羥基肉硅酸（HCCA）。4.2.7甘油。4.3溶液制備4.3.11×TAE緩沖液：取50×TAE緩沖液20mL，加水至1000mL。4.3.21%瓊脂糖凝膠：取瓊脂糖1.0g，于100mL1×TAE中加熱，充分溶解。4.3.3基質(zhì)溶液：取α-氰-4-羥基肉硅酸（HCCA），按說(shuō)明書(shū)配制，或用市售商品。4.3.4滅菌甘油：取甘油適量，121℃高壓滅菌20min。4.4培養(yǎng)基制備4.4.1Amies運(yùn)送培養(yǎng)基：按照附錄A中A.1的規(guī)定執(zhí)行。4.4.2液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（FTG）：按照A.2的規(guī)定執(zhí)行。4.4.3胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂培養(yǎng)基（TSC）：按照A.3的規(guī)定執(zhí)行。4.4.45%綿羊血瓊脂培養(yǎng)基：按照A.4的規(guī)定執(zhí)行。44.55%蔗糖脫脂乳保護(hù)劑：按照A.5的規(guī)定執(zhí)行。4.5標(biāo)準(zhǔn)菌株產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素C型（Clostridiumperfringens,TypeC）[CVCC60101]。4.6材料4.6.1無(wú)菌脫纖維綿羊血。4.6.2生化鑒定試劑盒或鑒定卡。4.6.3細(xì)菌DNA提取試劑盒。4.6.4磁珠保藏管。5儀器設(shè)備5.1二級(jí)生物安全柜。5.2冰箱：2℃～8℃，-20℃或以下。5.3分析天平：感量0.01g。5.4精密天平：感量0.001g。5.5移液器：0.5μL～1000μL。5.6恒溫培養(yǎng)箱。5.7厭氧培養(yǎng)裝置。5.8微生物生化鑒定系統(tǒng)。5.9PCR儀。5.10高速冷凍離心機(jī)：離心速度≥12000r/min。5.11核酸電泳儀。5.12電泳凝膠成像分析系統(tǒng)。5.13微生物質(zhì)譜儀（MALDI-TOFMS）。6分離鑒定程序分離與鑒定流程見(jiàn)圖1。動(dòng)物直腸/泄殖腔拭子、新鮮糞便、腸道內(nèi)容物等樣品（動(dòng)物直腸/泄殖腔拭子、新鮮糞便、腸道內(nèi)容物等樣品（7）預(yù)增菌預(yù)增菌（8.1）增菌（8增菌（8.2）純化（8.3純化（8.3）形態(tài)學(xué)檢查（9.1.1形態(tài)學(xué)檢查（9.1.1）PCR鑒定（9.2.3）PCR鑒定（9.2.3）生化鑒定（9.2.2）微生物質(zhì)譜微生物質(zhì)譜鑒定（9.2.4）產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)氣莢膜梭菌圖1產(chǎn)氣莢膜梭菌分離與鑒定流程7樣品采集與保存運(yùn)輸樣品采集與保存運(yùn)輸按照NY/T4141的規(guī)定執(zhí)行。8分離純化8.1預(yù)增菌8.1.1動(dòng)物直腸/泄殖腔拭子取樣品液200L，置FTG培養(yǎng)基2mL中，混勻，液體石蠟封固，36℃（±1℃）厭氧培養(yǎng)20h～24h。8.1.2新鮮糞便、腸道內(nèi)容物取樣品適量，置FTG培養(yǎng)基2mL中，混勻，液體石蠟封固，36℃（±1℃）厭氧培養(yǎng)20h～24h。8.2增菌取預(yù)增菌液1mL、約50℃的TSC瓊脂培養(yǎng)基9mL，傾注平皿，緩慢旋轉(zhuǎn)混勻，室溫凝固。再加入約50℃的TSC瓊脂培養(yǎng)基10mL，室溫凝固，正置，36℃（±1℃）厭氧培養(yǎng)20h～24h。8.3純化挑取圓形黑色單菌落，接種5%綿羊血瓊脂培養(yǎng)基，36℃（±1℃）倒置厭氧培養(yǎng)20h～24h。挑取有溶血環(huán)、表面光滑菌落，接種5%綿羊血瓊脂培養(yǎng)基，36℃（±1℃）倒置厭氧培養(yǎng)20h～24h，純化，備用。9篩查與鑒定9.1篩查9.1.1形態(tài)學(xué)檢查取純化菌落，按照GB4789.13規(guī)定執(zhí)行。9.2鑒定9.2.1通則生化鑒定、PCR鑒定和質(zhì)譜鑒定3種方法任選其一。9.2.2生化鑒定按照GB4789.13規(guī)定執(zhí)行，也可以使用生化鑒定試劑盒、鑒定卡或微生物生化鑒定系統(tǒng)鑒定。9.2.3PCR鑒定9.2.3.1模板制備取新鮮的純化菌落，加滅菌水1mL，煮沸10min，冰浴冷卻，12000r/min離心3min。取上清液，備用?；蚴褂眉?xì)菌DNA提取試劑盒提取DNA作為模板。產(chǎn)氣莢膜梭菌標(biāo)準(zhǔn)菌株作為陽(yáng)性對(duì)照，水為陰性對(duì)照。9.2.3.2引物引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度見(jiàn)表1。表1產(chǎn)氣莢膜梭菌的PCR引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度細(xì)菌引物序列擴(kuò)增片段長(zhǎng)度，bp產(chǎn)氣莢膜梭菌上游引物（cpa-F）:5'-GCTAATGTTACTGCCGTTGA-3'下游引物（cpa-R）:5'-CCTCTGATACATCGTGTAAG-3'3249.2.3.3反應(yīng)體系反應(yīng)體系（30μL）見(jiàn)表2。表2PCR反應(yīng)體系試劑體積，μL2×PCRMasterMix15上游引物（10μmol/L）1下游引物（10μmol/L）1水（ddH2O）12模板19.2.3.4反應(yīng)條件94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。9.2.3.5電泳取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，于1%的瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像分析。9.2.3.6結(jié)果判定擴(kuò)增條帶大小符合324bp的為陽(yáng)性。陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物必要時(shí)測(cè)序比對(duì)鑒定，相似度不低于99%。產(chǎn)氣莢膜梭菌PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果和測(cè)序結(jié)果見(jiàn)附錄B中B.1和B.2。9.2.4質(zhì)譜鑒定9.2.4.1菌樣制備挑取單個(gè)新鮮純化菌落，均勻涂布于靶板樣品孔中，室溫干燥。吸取1μL基質(zhì)溶液滴于樣品上，混勻，室溫干燥。標(biāo)準(zhǔn)菌株的新鮮菌落同法操作。9.2.4.2儀器校準(zhǔn)檢測(cè)樣品前，應(yīng)對(duì)微生物質(zhì)譜儀進(jìn)行校準(zhǔn)。9.2.4.3測(cè)定取制備好的樣品靶板，置質(zhì)譜儀靶板槽中。編輯樣品信息后，進(jìn)行譜圖的數(shù)據(jù)采集。9.2.4.4結(jié)果判定微生物質(zhì)譜儀自動(dòng)完成譜圖的比對(duì)和鑒定。以不同分值顯示結(jié)果，鑒定分值達(dá)到種水平可信即可。產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素C型標(biāo)準(zhǔn)菌株質(zhì)譜鑒定譜圖見(jiàn)附錄C。10菌株保藏取新鮮純化菌，加入含有5%無(wú)菌脫纖維羊血的FTG培養(yǎng)基制成菌懸液，與滅菌甘油溶液混合，使甘油終濃度為20%~40%；或加入磁珠保藏管；或加入5%蔗糖脫脂乳保護(hù)劑，凍干。-20℃或以下保藏。11生物安全要求實(shí)驗(yàn)室設(shè)施設(shè)備、人員防護(hù)及實(shí)驗(yàn)的安全操作、實(shí)驗(yàn)廢棄物和菌種的處理應(yīng)符合GB19489和NY/T1948的要求。

附錄A（規(guī)范性）培養(yǎng)基A.1Amies運(yùn)送培養(yǎng)基A.1.1成分氯化鈉3.0g磷酸二氫鉀0.2g磷酸氫二鈉1.15g氯化鉀0.2g氯化鎂0.1g硫代乙醇酸鈉1.0g氯化鈣0.1g瓊脂7.5g水1000mLA.1.2制法將A.1.1中各成分加入水中，混勻，加熱煮沸至完全溶解，調(diào)節(jié)pH至7.3±0.1，121℃高壓滅菌15min，備用。A.2液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（FTG）A.2.1基礎(chǔ)液胰蛋白胨15.0gL-胱氨酸0.5g酵母粉5.0g葡萄糖5.0g氯化鈉2.5g硫乙醇酸鈉0.5g刃天青0.001g瓊脂0.75g水1000mL將A.2.1中各成分加入水中，混勻，調(diào)節(jié)pH值至7.1±0.2，121℃高壓滅菌15min，備用。A.2.2制法基礎(chǔ)液1000mLD-環(huán)絲氨酸80mL將各成分混勻，備用。A.3胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂培養(yǎng)基（TSC）A.3.1基礎(chǔ)液胰胨15.0g大豆胨5.0g酵母粉5.0g焦亞硫酸鈉1.0g檸檬酸鐵銨瓊脂1.0g15.0g水1000ml將A.3.1中各成分加入水中，混勻，調(diào)節(jié)pH值至7.3±0.2，121℃高壓滅菌15min，備用。A.3.2制法基礎(chǔ)液1000mLD-環(huán)絲氨酸80mL將各成分混勻，備用。A.45%綿羊血瓊脂培養(yǎng)基A.4.1成分蛋白胨10.0g牛腦浸粉12.5g葡萄糖2.0g牛心浸粉5.0g氯化鈉5.0g磷酸氫二鈉2.5g瓊脂15.0g水1000ml將A.4.1中各成分加入水中，混勻，調(diào)節(jié)pH值至7.4±0.2，121℃高壓滅菌15min。冷卻至約50℃，備用。A.4.2制法基礎(chǔ)液1000mL無(wú)菌脫纖維綿羊血200ml將各成分混勻，傾注平板，備用。A.55%蔗糖脫脂乳保護(hù)劑A.5.1成分脫脂乳10.0g蔗糖5.0g水100mLA.5.2制法將A.5.1中各成分混勻，112℃高壓滅菌20min，備用。附錄B（資料性）產(chǎn)氣莢膜梭菌PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果和測(cè)序結(jié)果B.1PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖B.1。標(biāo)引序號(hào)說(shuō)明：M--2000bpDNAMarker；1-7--為產(chǎn)氣莢膜梭菌；8--為陽(yáng)性對(duì)照（CVCC60101）；9--為陰性對(duì)照（ddH2O）。圖B.1產(chǎn)氣莢膜梭菌PCR產(chǎn)物電泳圖B.2目標(biāo)片段測(cè)序結(jié)果見(jiàn)如下。GCTAATGTTACTGCCGTTGACCGCGCAGGACATGTTAAGTTTGAGACTTTTGCAGAGGAAAGAAAAGAACAGTATAAAATAAACACAGCAGGTTGCAAAACTAATGAGGATTTTTATGCTGATATCT