第7章 干細胞與組織工程上課件

第7章

干細胞與組織工程什么是干細胞(stemcells)干細胞是具有自我復制和多項分化潛能的原始細胞，是機體的起源細胞，是形成人體各種組織、器官的祖先細胞。干細胞的分類按來源分類胚胎干細胞成體干細胞按分化潛能分類

多能干細胞

全能干細胞

專能干細胞

胚胎干細胞和成體干細胞的比較定義:當受精卵分裂發(fā)育成囊胚時，內(nèi)細胞團的細胞就是胚胎干細胞。特點：具有很強的分化能力，可以無限增加，并且可以分化成全身２００多種細胞類型?？偨Y(jié)：它能長成動物的任何組織和器官成體干細胞位于成體的組織和器官特點：在特定條件下，成體干細胞或者產(chǎn)生新的干細胞，或者按一定的程序進行分化，形成新的功能細胞，從而使組織和器官保持生長和衰退的動態(tài)平衡。

第7章干細胞與組織工程上Whatisastemcell?

A:AcellthatcanmakecopiesofitselfANDmakemorespecializedtypesofcellB:AcellthathelpstofightagainstinfectionsC:AcellthatisspecializedD:Acellthatcanproduceallthecelltypesofthebody√第7章干細胞與組織工程上Wherecanscientistsobtainstemcells?A:OnlyfromanembryoB:OnlyfromadulttissuesC:OnlyfromthebrainD:Fromanembryooradulttissues√干細胞是研究的熱點

2006年2月9日，國務院發(fā)布的《國家中長期科學和技術(shù)發(fā)展規(guī)劃綱要(2006-2020年)》部署了四項重大科學研究規(guī)劃，發(fā)育與生殖研究位列其中。2007年歐盟經(jīng)過長時間的辯論后決定撥款資助人類干細胞研究。而此前，美國總統(tǒng)布什首次動用否決權(quán)，駁回胚胎干細胞研究的法案，引起軒然大波。這個事件在科學、倫理和政治的揪扯下，愈演愈烈，最后終于引發(fā)了一場激烈的“文化戰(zhàn)爭”。（視頻1）中國人對胚胎干細胞研究的看法比較一致

大多數(shù)中國人能夠接受此項研究,主要是受儒家思想的影響。儒家很早以前就已經(jīng)指出，人生出來的時候，人才開始。按照大多數(shù)中國人的看法，胚胎還不是人，不涉及人權(quán)問題。7.1胚胎干細胞

（embryonicstemcells,ES細胞）

四個基本問題:什么是ES細胞？（定義）如何分離培養(yǎng)ES細胞（建系）如何鑒定ES細胞？ES細胞有何應用價值？

受精卵裂受精后72h受精后5-7天精子+卵子

合子卵裂球桑椹胚囊胚blastocyst

滋養(yǎng)層

胎盤及胎兒附屬結(jié)構(gòu)囊胚內(nèi)胚層

消化道、呼吸道上皮和腺體；肝；膽；胰。內(nèi)細胞團中胚層

結(jié)締組織；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系統(tǒng)外胚層

體表結(jié)構(gòu)；神經(jīng)系統(tǒng)人早期胚胎發(fā)育第7章干細胞與組織工程上Ablastocystis…

A:AveryearlystageembryoB:AtypeofstemcellC:PartofthebloodsystemD:Atypeofbraincell√定義

胚胎干細胞?????是從早期胚胎內(nèi)細胞團(或生殖脊)分離，并經(jīng)體外抑制分化培養(yǎng)所獲得的干細胞。這些細胞能在體外進行長期培養(yǎng)增殖，且保持高度未分化狀態(tài)和正常二倍體核型，具有發(fā)育的全能性，能分化出成體的所有種類的細胞（組織和器官），包括生殖細胞。胚胎干細胞（embryonicstemcells,ES細胞）胚胎生殖細胞（embryonicgermcells,EG細胞）7.1.1胚胎干細胞的研究歷程1981年，MartinEvans鼠1995年，Thomson猴1998年，Thomson&Gearhart人1981年，英國劍橋大學的MartinEvans等首次于用延遲著床的小鼠囊胚建立起未分化的ES細胞系

JamesA.Thomson在Wisconsin大學領(lǐng)導一個研究小組從人胚胎組織中培養(yǎng)出了干細胞株。他們使用的方法是：人卵體外受精后，將胚胎培育到囊胚階段，提取內(nèi)細胞團，建立細胞株。經(jīng)測試這些細胞株的細胞表面標志和酶活性，證實它們就是胚胎干細胞。(Science,1998

(l282):1145-1147)JohnD.Gearhart在JohnsHopkins大學領(lǐng)導另一個研究小組也從人胚胎組織中建立了干細胞株。他們的方法是：從受精后5－9周人工流產(chǎn)的胚胎中提取原始生殖細胞(primordialgermcell)。由此培養(yǎng)的細胞株，證實具有多能干細胞的特征。(PNAS,1998(l95):13726-13731)ScientistsJamesThomsonandJohnGearhartjoinedpatientadvocateChristopherReevetodiscussstemcellresearch霍金批評歐美人士試圖禁止人類胚胎干細胞研究

※1999年12月，美國《科學》雜志公布了當年世界科學進展的評定結(jié)果，干細胞的研究成果列在舉世矚目耗資巨大的人類基因組工程之前，名列十大科學進展首位?！?002年3月，美國麻省理工學院的科學家宣布，他們首次利用人體胚胎干細胞培育出毛細血管，證明了胚胎干細胞技術(shù)在治療心血管疾病等領(lǐng)域的應用潛力?！壳耙延袌髮S細胞能在適當條件下分化為心肌細胞，胰島細胞，血管內(nèi)皮細胞，肝細胞等。新進展7.1.2胚胎干細胞的生物學特性參見7.1.4ES細胞的鑒定7.1.3胚胎干細胞的建系分離＋培養(yǎng)１分離方法：(1)利用干細胞特征分離(2)免疫外科學方法(3)酶解法(4)顯微外科學方法(1)利用干細胞特征分離

流式細胞儀分離法被Hoechst33342和Rhodamine123低染細胞膜表面特殊標志：SSEA-3SSEA-4TRA-1-60TRA-1-81(2)免疫外科學方法

去除滋養(yǎng)層細胞分離方法(3)酶解法：酶消化去除滋養(yǎng)層細胞后培養(yǎng)(4)顯微外科學方法：去除滋養(yǎng)層細胞后培養(yǎng)２ES細胞的分化抑制培養(yǎng)

在ES細胞的培養(yǎng)過程中，一方面要給以足夠的營養(yǎng)物質(zhì)以滿足其增殖的需要，另一方面要抑制其分化，其中前者由基礎(chǔ)培養(yǎng)基來解決，后者則由分化抑制物來完成。分化抑制物的選擇目前有三種分化抑制物比較常用：飼養(yǎng)層（feederlayer）條件培養(yǎng)基（conditionedmedium，CM）白血病抑制因子（leukemiainhibitoryfactor,LIF）飼養(yǎng)層細胞feeders

是將選用的細胞經(jīng)γ射線照射或經(jīng)絲裂霉素C（mitomycinC）處理而阻斷其有絲分裂所得到的細胞層。常用的有STO（一種已成系的小鼠成纖維細胞）、原代小鼠胎兒成纖維細胞、同源胎兒成纖維細胞和子宮上皮細胞，其中前兩種比較常用。

飼養(yǎng)層細胞要鋪滿抑制分化的因子——白血病抑制因子(leukemiainhibitoryfactor,LIF)ES細胞培養(yǎng)常用含有LIF的培養(yǎng)基（高糖）和飼養(yǎng)層細胞來阻止細胞的分化

條件培養(yǎng)基：是將大鼠肝細胞等細胞培養(yǎng)一定時間后，回收細胞培養(yǎng)液，經(jīng)一系列處理后制為貯存液，使用時以一定比例加到ES細胞培養(yǎng)基中。許多實驗室經(jīng)常用條件培養(yǎng)基取代飼養(yǎng)層來維持ES細胞。其優(yōu)點是使ES細胞直接利用培養(yǎng)細胞分泌到培養(yǎng)液中的生長因子，可消除飼養(yǎng)層細胞的干擾，免受絲裂霉素C致癌劑的影響，而且操作比較簡單。

建系胚胎干細胞建系(flash2)胚胎干細胞集落小結(jié):胚胎干細胞的建系過程（1）細胞形態(tài)特征、取材部位（2）細胞表面的特殊標志（3）細胞內(nèi)干細胞標志基因的表達（4）端粒酶（5）核型分析體內(nèi)分化（6）分化潛能

體外分化嵌合體:小鼠胚胎干細胞已經(jīng)制備嵌合體7.1.4

胚胎干細胞的鑒定形態(tài)學鑒定：典型的ES細胞體積較小，有一個大核，核內(nèi)有一個或多個明顯的核仁，胞質(zhì)較少。細胞之間界限不清晰，緊密聚集呈鳥巢狀克隆。

胚胎干細胞克隆胚胎干細胞的特性細胞內(nèi)干細胞標志基因的表達堿性磷酸酶染色，呈陽性

免疫組織化學染色RT－PCR分析

核型保持正常

分化能力檢測ES細胞具有發(fā)育全能性，這是其區(qū)別于其它細胞的顯著特點。ES細胞一旦脫離飼養(yǎng)層或除去分化抑制物后進行培養(yǎng)，會自發(fā)分化為多種細胞。在某些物質(zhì)的誘導下，一些特定基因的表達會受到調(diào)節(jié)，從而使ES細胞發(fā)生定向分化。分化能力分化能力檢測①體外分化試驗：將所培養(yǎng)的細胞制成懸液在鋪有明膠的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，則貼壁生長的ES細胞會自發(fā)地分化為各種細胞，而懸浮生長的ES細胞會形成簡單類胚體，然后進一步形成囊狀胚體。②體內(nèi)分化試驗：將一定量培養(yǎng)的ES細胞注入同源動物的皮下，過一段時間后會形成組織瘤，且組織瘤內(nèi)有三個胚層的細胞存在。③核移植檢測：將培養(yǎng)的細胞作為核供體注入去核卵母細胞中，觀察重構(gòu)胚是否正常發(fā)育。④嵌合體形成檢測：將培養(yǎng)的細胞與受體胚胎結(jié)合并移植入同期假孕受體，ES細胞可參與受體胚胎的發(fā)育從而得到嵌合體動物，然后通過毛色判斷，或同工酶檢測。胚胎干細胞神經(jīng)細胞脂肪細胞心肌細胞上皮細胞適當條件體外定向分化改變生長環(huán)境處理塑料平皿、加入特定生長因子等（1）加入誘導細胞分化的因子或化學物質(zhì)，如VGEF、bFGF、DMSO和RA等（2）將ES細胞與特定的細胞共培養(yǎng)（3）將某種分化誘導因子的基因轉(zhuǎn)入ES細胞內(nèi)干細胞誘導分化的常用方法胚胎干細胞的體外定向誘導分化：

胎牛血清，骨髓基質(zhì)細胞共培養(yǎng)胚胎干細胞－－－－－－－－－－－－－－－

造血細胞

RA胚胎干細胞－－－－－－－－－－－－－－－神經(jīng)細胞

DMSO胚胎干細胞－－－－－－－－－－－－－－－肌肉細胞

TGF-B1,VEGF,bFGF胚胎干細胞－－－－－－－－－－－－－－－血管和內(nèi)皮細胞

RA+胰島素+T3胚胎干細胞－－－－－－－－－－－－－－－脂肪細胞

BMP-2,BMP-4胚胎干細胞－－－－－－－－－－－－－－－軟骨細胞

地塞米松，磷酸甘油胚胎干細胞－－－－－－－－－－－－－－－骨細胞

基因轉(zhuǎn)染胚胎干細胞－－－－－－－－－－－－－－－胰島素分泌細胞胚胎干細胞誘導分化的途徑

①擬胚體的形成②非擬胚體形成途徑

擬胚體

Embryoidbody在無飼養(yǎng)層系統(tǒng)中培養(yǎng)的ES細胞在體外可以形成擬胚體，擬胚體包含三個胚層來源的細胞，并能分化出三個胚層的細胞。

目標：定向分化定向分化進展:胚胎干細胞育出心臟組織

1）以色列工學院科學家首次從胚胎干細胞中培養(yǎng)出人類心臟組織。他們培育出的心臟組織，可以自然跳動，并且有新生心臟組織的電特性和機械性。這項實驗證明：以細胞移植治療心臟病的可能性是巨大的。此項發(fā)現(xiàn)，對治療世界上最主要的一種致命疾病可能具有重大意義。2）法國科學家16日用老鼠胚胎干細胞成功治療羊心臟病，這是第一次用老鼠干細胞來修復大型動物的心臟損傷2005年英科學家利用胚胎干細胞成功制造軟骨

第7章干細胞與組織工程上Embryonicstemcellscandifferentiateintowhichtypesofcell?

A:OnlybrainstemcellsandspecializedbraincellsB:AlltypesofspecializedcellsinthebodyC:OnlycellsthatcanproduceinsulinD:Onlycellsthatcanproduceartificialskin√騙局:胚胎干細胞美容商品名稱：愛麗璽爾胚胎干細胞因子

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視頻3制備嵌合體

獲得功能基因

構(gòu)建基因打靶載體轉(zhuǎn)染胚胎干細胞獲得基因剔除細胞系

制備嵌合體

篩選進入生殖系小鼠

轉(zhuǎn)基因小鼠（F1）表型分析

選擇單系同胞交配產(chǎn)生（F2）代

篩選純合子的轉(zhuǎn)基因小鼠

胚胎干細胞法建立轉(zhuǎn)基因鼠的實驗程序7.1.5ES細胞的應用前景

及面臨的難題胚胎干細胞研究是把雙刃劍胚胎干細胞研究的意義（應用前景）研究哺乳動物個體發(fā)生發(fā)育規(guī)律研究細胞分化研究基因功能生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物疾病治療與治療性克隆研究細胞癌變機理及新藥物的篩選胚胎干細胞+

體細胞克隆

=治療性克隆(therapeuticcloning)治療性克隆科學家使小鼠、人類的胚胎干細胞發(fā)育成為成熟精子

用人類胚胎干細胞培育出卵子

美國生殖專家曾在2003年從小鼠身上的胚胎干細胞分化出卵子與囊胚，但在人類干細胞的研究則面臨瓶頸。臺大醫(yī)院研究團隊近年可在無血清、無喂養(yǎng)細胞的環(huán)境下培養(yǎng)胚胎干細胞，除了成功培育三株人類胚胎干細胞株外，更于最近進一步分化出卵泡（內(nèi)含有卵子）的構(gòu)造，且具有生殖細胞基因的表現(xiàn)。胚胎干細胞研究面臨的難題增殖與分化的矛盾潛在致癌機制器官形成困難重重倫理沖突倫理沖突ES研究也引發(fā)了當前最為激烈而敏感的倫理之爭。主要圍繞兩個問題而展開：一是如何看待胚胎。ES主要有三個來:

（1）（自然和人工）流產(chǎn)的胚胎；（2）輔助生殖剩余的胚胎；（3）通過體細胞核轉(zhuǎn)移術(shù)得到的胚胎。不管哪一個來源，提取ES必定會損毀胚胎。于是，胚胎是不是生命，是不是人，研究ES是不是“毀滅生命”、“殺人”，很自然地成為爭論的焦點。如何解決倫理矛盾不破壞胚胎的情況下獲取胚胎干細胞成體干細胞橫向分化睪丸細胞：胚胎干細胞的新來源iPS2006年8月24日，美國學者蘭薩領(lǐng)導的研究小組在《自然》雜志發(fā)表文章，宣稱已實現(xiàn)在不破壞胚胎的情況下獲取胚胎干細胞。這一成果如果得到學界承認，將是這一研究領(lǐng)域的一大進步。不再“殺雞取卵”的胚胎干細胞研究將贏得充分的發(fā)展空間。(視頻4)成體干細胞橫向分化已經(jīng)由多項研究證明，之前被認為發(fā)展很有限的特定組織中的成體干細胞在一定的條件下還能夠形成其他組織的細胞類型，這些發(fā)現(xiàn)為干細胞新資源的探索和更廣泛應用奠定了基礎(chǔ)。成體干細胞橫向分化Generationofpluripotentstemcellsfromneonatalmousetestis.

Cell.2004Dec29;119(7):1001-12.

睪丸細胞：胚胎干細胞的新來源精原干細胞培養(yǎng)成胚胎干細胞

日本科學家分離培養(yǎng)新生小鼠的精原干細胞，體外抑制分化培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)這種細胞有分化增殖的現(xiàn)象，并具有多向分化潛能，在體外能誘導分化成各種體細胞，通過囊胚注射獲得了具有種系嵌合能力嵌合體后代。精原干細胞制作為又一種“多能細胞”引起了廣泛關(guān)注。制備嵌合體Pluripotencyofspermatogonialstemcellsfromadultmousetestis.

Nature.2006Mar24

第7章干細胞與組織工程上誘導多能干細胞2006年，Takahashi等通過巧妙的實驗設(shè)計，從24個候基因中篩選出4個與胚胎干細胞多能性更為密切相關(guān)的基因––Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4，并將它們導入到小鼠胚胎成纖維細胞和鼠尾成纖維細胞，成功地將其重編程為具有胚胎干細胞多能性的細胞––誘導多能干細胞

(inducedpluripotentstemcell,iPScell)第7章干細胞與組織工程上十年磨一劍誘導多能干細胞

2007年11月20日，美國威斯康星大學詹姆斯·湯姆森的研究小組在《科學》雜志發(fā)表體細胞轉(zhuǎn)變成“誘導性多能干細胞”（iPS細胞）的成果，而日本京都大學教授山中伸彌領(lǐng)導的研究小組也于同日在《細胞》雜志發(fā)表類似的研究結(jié)果。ips細胞的誕生仿佛給沉寂一時的國際干細胞研究打入了一劑強心劑。

視頻5第7章干細胞與組織工程上JunyingYU,…JamesA.Thomson.InducedPluripotentStemCellLinesDerivedfromHumanSomaticCells.Science,2007,318(5858):1917-1920這項技術(shù)可能會諾貝爾獎，這位在美國研究的中國科學家俞君英博士，出生于浙江諸暨，1997年畢業(yè)于北京大學，赴美國美國賓夕法尼亞大學留學。2003年進威斯康星大學詹姆斯·湯姆森實驗室進行研究工作。如果夢想成真，第一位獲諾貝爾獎的中國籍的學者是俞氏的一位女性。第7章干細胞與組織工程上誘導性多能干細胞(iPScells)定義：iPScells是被重新編程從而進入一個類似胚胎干細胞狀態(tài)的體細胞。

第7章干細胞與組織工程上第7章干細胞與組織工程上第7章干細胞與組織工程上誘導多能干細胞

人iPS誕生僅一月有余，相關(guān)科研成果和技術(shù)革新就屢見報端，一些國家及科學界對這種細胞表現(xiàn)出強烈的關(guān)注，紛紛制訂相關(guān)的研究計劃。第7章干細胞與組織工程上第7章干細胞與組織工程上誘導多能干細胞“ｉPS細胞”具有和胚胎干細胞類似的功能，卻繞開了胚胎干細胞研究一直面臨的倫理和法律等諸多障礙，因此在醫(yī)療領(lǐng)域的應用前景非常廣闊。這一新技術(shù)也被權(quán)威科學雜志《自然》、《科學》分別評為2007年第一大和第二大科學進展，又在2008年榮登Science十大科技進展榜首。第7章干細胞與組織工程上誘導多能干細胞由于一些國家明確反對胚胎干細胞研究，使國際上許多有關(guān)的干細胞研究處于進退兩難的境地。在一些國家陸續(xù)宣布禁止胚胎干細胞研究后，這一干細胞研究領(lǐng)域最有前途的研究道路被逐漸堵死，這也大大打擊了一些國家的科學家對于干細胞研究的積極性。

而“ｉＰＳ細胞”的出現(xiàn)則讓大家站在了公平競爭的起跑線上，“海闊憑魚躍，天高任鳥飛”，國際干細胞研究擺脫了許多顧忌，有關(guān)研究的競爭態(tài)勢日益顯現(xiàn)。

第7章干細胞與組織工程上誘導多能干細胞

“ｉＰＳ細胞”研究成果公布不久，一直對胚胎干細胞研究持反對意見的美國白宮迅速發(fā)表聲明，對這一新成果表示歡迎。似乎是受到了“鼓舞”，美國科學家在這一領(lǐng)域迅速跟進。緊接著美國懷特黑德生物醫(yī)學研究所的科學家利用“ｉＰＳ細胞”治療老鼠的鐮狀細胞血癥獲得進展，這是科學界利用“ｉＰＳ細胞”進行醫(yī)療研究的首次嘗試。美國哈佛大學科學家又宣布直接從志愿者身上提取皮膚細胞，并將其改造成了“ｉＰＳ細胞”。第7章干細胞與組織工程上日本是這場競爭的領(lǐng)跑者日本媒體報道說，圍繞干細胞醫(yī)療應用的國際競爭必將加劇，因此日本政府對“ｉＰＳ細胞”表現(xiàn)了極大的熱情，希望抓住這樣一個能夠提高日本科研競爭力的良機。日本文部科學省決心整合全國的干細胞研究力量，在京都大學設(shè)立“ｉＰＳ細胞”研究中心。文部科學?。玻橙諞Q定明年投入２２億日元