【淺析蛋白質(zhì)沉淀分離方法5900字】

淺析蛋白質(zhì)沉淀分離方法目錄TOC\o"1-2"\h\u29699前言 1265521沉淀分離法的基本概念 279161.1概念 2254141.2沉淀分離原理 2137051.3沉淀分離的方法 223702.等電點(diǎn)法沉淀蛋白質(zhì) 3300172.1微觀原理 3265482.2影響因素 4269353.中性鹽沉淀蛋白質(zhì) 496093.1微觀原理 429933.2鹽析的影響因素: 5119873.3中性鹽的選擇原則 540491.所選鹽鹽析作用要強(qiáng)既有較好的分離效果。 5276724.1有機(jī)溶劑沉淀原理 6323034.2有機(jī)溶劑的影響因素與選擇原則 694953.溶液離子強(qiáng)度也在一定程度影響沉淀。 625352總結(jié) 729351參考文獻(xiàn) 7摘要:回顧了蛋白質(zhì)的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)，查找了先前對(duì)蛋白沉淀分離的方法，通過了解蛋白質(zhì)沉淀分離的方法及其所利用的原理和影響因素。得出鹽析沉淀法是目前最普遍的方法，等電點(diǎn)沉淀法的使用主要是對(duì)一些有特殊結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的分離，有機(jī)溶劑法則更多利用于一些結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的蛋白質(zhì)的高要求的分離純化。關(guān)鍵詞:蛋白質(zhì)沉淀分離；鹽析沉淀法；有機(jī)溶劑沉淀法；等電點(diǎn)沉淀法前言蛋白質(zhì)被人們認(rèn)為是第一重要的生命物質(zhì)，其組成元素主要有C,H,O,N,S和其他一些微量元素（P,Fe,Cu,I,Zn,Mo)。蛋白質(zhì)龐大的種類，分別行使這各種不同的生物功能。正是這些高效有序的不同分工，使得有機(jī)體維持著正常的生命活動(dòng)。復(fù)雜的機(jī)體活動(dòng)本身就暗示著其蛋白質(zhì)的復(fù)雜性，從細(xì)胞中眾多中的蛋白質(zhì)中要想單獨(dú)的提取某種特定的蛋白絕非易事。經(jīng)過科學(xué)家們多年的努力，現(xiàn)在已經(jīng)基本形成了一套完整的通過物理，化學(xué)，及生物學(xué)特性分離目標(biāo)蛋白的操作方法。在經(jīng)歷這么多年的沉淀和積累，現(xiàn)如今還有很多的方法來實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的提取，但分離，純化蛋白質(zhì)必須要遵守幾個(gè)基本原則:在提高蛋白質(zhì)純度的同時(shí)，注意提高蛋白質(zhì)產(chǎn)量，并盡可能蛋白質(zhì)活性。為避免蛋白質(zhì)變性或降解，整個(gè)分離純化過程一般要求低溫操作，使用緩沖劑，并加入合適的蛋白酶抑制劑，含巰基試劑等。其中沉淀法是被運(yùn)用最廣泛和最為經(jīng)典的方法。無論是實(shí)驗(yàn)亦或是工業(yè)中其都被引用。沉淀法由于其運(yùn)行成本低，可以獲得較多的目地蛋白。（不會(huì)造成蛋白質(zhì)的生物活性喪失），可以濃縮幾十倍的范圍，實(shí)驗(yàn)步驟簡單易于操作等優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)收集的相關(guān)統(tǒng)計(jì)，在工業(yè)中所采用的蛋白濃縮的方法中其中78%-85%的是沉淀分離的方法，可見沉淀法在當(dāng)今生活中的重要地位。沉淀分離方法有很多種，其中被應(yīng)有的比例大概有機(jī)溶劑沉淀占35%，硫酸銨沉淀56%，等電點(diǎn)沉淀約6%，其他3%左右。由于沉淀法眾多優(yōu)點(diǎn)，使其成為生物下游加工過程中運(yùn)用最廣泛的純化方法。蛋白質(zhì)沉淀分離法就是研究不同物質(zhì)與蛋白質(zhì)形成沉淀的條件和影響因素，此不僅有利于蛋白質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)，生理活性的研究，而且在其他方面也提供依據(jù)。如對(duì)藥物研制，食品工業(yè)，農(nóng)業(yè)等方面都具有重要的實(shí)際意義。1沉淀分離法的基本概念1.1概念沉淀分離主要是指通過向溶液中加入某種溶劑改變?nèi)苜|(zhì)和溶液先前的平衡穩(wěn)定狀態(tài)，使溶質(zhì)存在狀態(tài)發(fā)生變化，由液態(tài)變?yōu)楣虘B(tài)，從原來的溶液中析出沉淀的過程稱為沉淀分離法。此過程是一種物理變化，不涉及原子重組。1.2沉淀分離原理沉淀分離大致存在兩種原理的沉淀產(chǎn)生。第一種是加入的試劑奪取溶液中的水分子，使得溶質(zhì)缺少水分子而相互結(jié)合在一起，而出現(xiàn)沉淀。例如蛋白質(zhì)的鹽析，由于鹽離子與水的親和力大于蛋白質(zhì)與水的親和力，當(dāng)溶液中出現(xiàn)大量的鹽離子時(shí)，水分子都與鹽離子結(jié)合，使的原來被水分子隔開的蛋白質(zhì)分子失去隔離分子而相互結(jié)合產(chǎn)生聚集現(xiàn)象。第二種是加入的試劑通過與溶液中的溶質(zhì)分子特異性的結(jié)合，使得溶質(zhì)分子分子量增大，而沉降下來，出現(xiàn)沉淀的方法。例如利用抗原與抗體特異結(jié)合的特性，將抗體加入溶液中，根據(jù)鎖-鑰學(xué)說的解釋加入的抗體分子像鑰匙那樣專一性地楔入抗原分子內(nèi)，與抗原分子形成新的物質(zhì)，從溶液中析出沉淀。1.3沉淀分離的方法1.3.1鹽析法蛋白質(zhì)是一種微溶于水的物質(zhì)，較低的溶解度并非是固定不變的，當(dāng)往水中加入少量的無機(jī)鹽后蛋白質(zhì)會(huì)出現(xiàn)更好的水溶性，當(dāng)向水中加入大量的無機(jī)鹽后，蛋白質(zhì)又產(chǎn)生沉淀而析出。對(duì)于蛋白質(zhì)的這兩種性質(zhì)，我們稱這兩種現(xiàn)象為鹽溶和鹽析。本文主要論述鹽析沉淀的方法。1.3.2有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)不僅僅可溶于水溶液，稀酸，稀堿，稀鹽，更會(huì)與一些溶于水的有機(jī)溶劑(甲醇，丙酮，乙醇等)發(fā)生沉淀反應(yīng)。由于極性有機(jī)溶劑可以使溶液的電解常數(shù)下降，而中性兩性離子的蛋白質(zhì)在此時(shí)作用力增強(qiáng)，電荷間相互結(jié)合而出現(xiàn)沉淀。另外，極性物質(zhì)對(duì)水的奪取效果，造成蛋白質(zhì)表面的水花膜層被破壞，使蛋白質(zhì)的基團(tuán)漏出，而相互結(jié)合產(chǎn)生聚團(tuán)沉降。此種方法被稱為有機(jī)溶劑沉淀法。1.3.3等電沉淀法氨基酸作為蛋白質(zhì)的基本組成單位，其性質(zhì)自然決定著蛋白質(zhì)的性質(zhì)。氨基酸是一種既有堿性基團(tuán)(-NH3)又有酸性基團(tuán)(-COOH)的兩性物質(zhì)，在自然水溶液中的酸堿性，主要取決于溶液的酸堿度。當(dāng)外界溶液的PH正好使氨基酸的酸堿離子電離相等時(shí)，溶液表現(xiàn)為電中性，此時(shí)的PH被規(guī)定為等電點(diǎn)Pl。在該點(diǎn)處，蛋白質(zhì)分子的凈電荷量為零，使的蛋白質(zhì)分子之間沒有了電荷間的排斥力，而相互聚集成團(tuán)發(fā)生沉淀。因此通過調(diào)節(jié)PH，達(dá)到某一蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，此時(shí)該蛋白質(zhì)的溶解度最小，就可以發(fā)生同類蛋白質(zhì)被分離的目地該方法稱之為等電沉淀法。2.等電點(diǎn)法沉淀蛋白質(zhì)2.1微觀原理由于蛋白質(zhì)的分子的末端存在著α-氨基及α-羧基這兩種酸性和堿性基團(tuán)，所以蛋白質(zhì)是一種兩性離子，以結(jié)構(gòu)最簡單的甘氨酸（CH2（NH2）-COOH）為例，在水溶液中實(shí)際是-COO-作為堿，從水中奪取H+形成正離子，而-NH2＋作為一種酸給H+形成負(fù)離子。所以在蛋白質(zhì)水溶液中存在著正負(fù)離子的一種平衡體系。但–COO–和質(zhì)子結(jié)合的能力與–NH3+給出質(zhì)子的能力不是完全相同的，因此在溶液中正負(fù)離子不是等量的，所以在溶液中加入一些酸或堿從而增加溶液某種離子的量進(jìn)而使得溶液中正負(fù)離子相等。此時(shí)的溶液的PH我們稱之為等電點(diǎn)pl。當(dāng)溶液的PH等于某蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，該蛋白質(zhì)分子所帶的凈電荷為零，此時(shí)，蛋白質(zhì)分子間的同種電荷的排斥作用消失，蛋白質(zhì)間更容易相互結(jié)合聚集在一起發(fā)生沉淀。我們稱此為等電沉淀法。該方法的主要內(nèi)容是通過調(diào)節(jié)溶液的PH，而使的蛋白質(zhì)的溶解度發(fā)生變化。完成分離的前提條件是各蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，對(duì)于較大分子量的蛋白質(zhì)（蛋白質(zhì)側(cè)鏈所帶的酸堿基團(tuán)較多）與相鄰蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的差距較大，該方法較容易實(shí)現(xiàn)，但是一般的蛋白質(zhì)他們之間的等電點(diǎn)都很相近或相同。所以沉淀后所得的蛋白質(zhì)，并非是單一的一種，而更多是以一類有多種蛋白的聚合成的聚集體。因此該方法多被用在以些帶有疏水基團(tuán)的蛋白質(zhì)中例如酪蛋白在等電點(diǎn)時(shí)能形成較大的凝聚物，和一些蛋白質(zhì)的粗分離中引用的較多。2.2影響因素等電點(diǎn)沉淀使用的條件是，溶液中其他雜質(zhì)離子的濃度要低，溶液的酸堿性約等于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。一般是先將溶液透析處理降低其離子濃度，然后調(diào)節(jié)PH。根據(jù)相關(guān)資料可知在正常等。在大量的該方法的記載中條件控制一般選擇都是較為中性的，例如較有代表的鄧國龍等通過等電點(diǎn)法在木薯中蛋白質(zhì)提取的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:當(dāng)PH值為4.0溫度為35℃蛋白質(zhì)濃度為1400mg/L沉淀時(shí)間為3h，木薯黃漿廢水鐘蛋白質(zhì)的沉淀率高達(dá)98.3%，比自然沉淀法73.3%有更好的效果。3.中性鹽沉淀蛋白質(zhì)3.1微觀原理根據(jù)蛋白質(zhì)的基本單位氨基酸的分子結(jié)構(gòu)式，眾所周知，氨基酸的結(jié)構(gòu)是α-碳原子上鏈接有一個(gè)–NH3(堿性基團(tuán))和一個(gè)–COOH(酸性基團(tuán))和一個(gè)R基團(tuán)構(gòu)成。此處以α氨基酸為例說明，其余類型氨基酸其原理是一致的。在α氨基酸中氨基酸之間的區(qū)別主要在α碳原子所鏈接的R基團(tuán)的不同而決定的。該基團(tuán)的作用并不是僅此而已，它還是決定氨基酸溶解性的重要因素。因?yàn)?COO-是極性的離子，所以該基團(tuán)可溶于水，在整個(gè)分子中充當(dāng)親水物質(zhì)。而R基（烴基）是非極性基團(tuán)，不溶于水，在整個(gè)分子中充當(dāng)疏水基團(tuán)。在不同的蛋白質(zhì)中所含的疏水基團(tuán)的個(gè)數(shù)不同，所以在水中的溶解度也就出現(xiàn)了差異。這與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的次級(jí)鍵的敘述是一致的（在蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)中，多肽鏈通過次級(jí)鍵折疊為三級(jí)結(jié)構(gòu)，疏水作用力是最為主要作用力，在形成的三級(jí)結(jié)構(gòu)中疏水氨基酸殘基多集中于分子內(nèi)部，而親水氨基酸殘基多分布在分子表面，蛋白質(zhì)的溶解性主要取決于疏水作用力的大小，也就是疏水基團(tuán)的多少）蛋白質(zhì)在水溶液中時(shí)，當(dāng)往水里加入少量無機(jī)鹽時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度會(huì)明顯增加，這種低濃度增加蛋白質(zhì)溶解度的現(xiàn)象稱之為“鹽溶”。其原因是鹽離子的電荷作用力使蛋白質(zhì)間的靜電力加強(qiáng)，增大了溶解度。如果有大量的中性鹽加入，結(jié)果卻是相反的。蛋白質(zhì)會(huì)從溶液中析出，這種現(xiàn)象又稱之為“鹽析”其原因是大量的中性鹽的加入使水的活度降低，不僅原來溶液中的大部分水用于水化鹽離子，而且蛋白質(zhì)分子表面的水化層也被破壞，使蛋白質(zhì)分子表面的疏水殘基充分暴露，從而發(fā)生聚集而沉淀下來。3.2鹽析的影響因素:3.2.1蛋白質(zhì)濃度（蛋白質(zhì)濃度對(duì)于沉淀分離法的影響是比較大的，通常沉淀較高濃度的蛋白質(zhì)時(shí)，用濃度比較低的飽和硫酸銨溶液就可以完成。但如果蛋白質(zhì)的濃度較高的情況下，需要考慮雜質(zhì)蛋白共沉淀的問題。低濃度的蛋白質(zhì)，一般選用更大飽和度的硫酸銨溶液?？梢允钩恋淼牡鞍踪|(zhì)純度更好，同時(shí)也造成回收率低。在一般的實(shí)驗(yàn)操作中，要求蛋白濃度控制25mg/ML~30mg/ML的范圍。3.2.2PH值溶液中蛋白質(zhì)分子是以正負(fù)離子的共存狀態(tài)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)所帶凈電荷較多時(shí)，此時(shí)蛋白質(zhì)的溶解性較大，這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)相互之間的靜電力的作用。蛋白質(zhì)的帶電情況主要取決于溶液的PH，兩性離子中當(dāng)加入酸時(shí)，蛋白質(zhì)分子中-COO-接受溶液的H+,變?yōu)?COOH,此時(shí)蛋白質(zhì)分子帶正電（NH3+）。當(dāng)向溶液中加入堿時(shí)，此時(shí)蛋白質(zhì)顯電負(fù)性(-COO-)。因此溶液酸堿度對(duì)蛋白質(zhì)的溶解度有重要影響，通常在蛋白質(zhì)沉淀分離中需要將PH調(diào)至等電點(diǎn)的附近，就可以達(dá)到最佳的沉淀效果。3.2.3鹽離子的影響通常選用的中性鹽是硫酸銨，與KCL和NaOH相比，硫酸銨是二價(jià)離子，在同濃度狀態(tài)下其離子強(qiáng)度高，對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的降低效果更有效。硫酸銨溶解度大，溫度系數(shù)小，在低溫狀態(tài)下任然可以高濃度存在，在低溫下處理蛋白質(zhì)可以很好的保持蛋白質(zhì)活性。3.3中性鹽的選擇原則1.所選鹽鹽析作用要強(qiáng)既有較好的分離效果。2.鹽析使用的鹽必須具有較大的溶解度，低溫條件下也需要保持較高溶解度。3.鹽析所選鹽必須與蛋白質(zhì)能形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的惰性鹽。4.有豐富的產(chǎn)源地。4.有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)4.1有機(jī)溶劑沉淀原理某些有機(jī)溶劑由于其組成原子電負(fù)性的差異，從而呈現(xiàn)極性，極性分子的溶解性很大程度上取決于其分子中原子與水分子的作用力。如醇類的溶解度的大小與分子內(nèi)所含羥基的數(shù)目成正比。極性與水任意比混合的有機(jī)溶劑如(甲醇，乙醇，丙酮)在較高濃度下可使蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀的方法。溶于水的有機(jī)溶劑改變了水的介電常數(shù)(介質(zhì)在外加電場會(huì)產(chǎn)生感應(yīng)電荷，而削弱電場，原外加電場與最終介質(zhì)中電場的比值)溶液的介電常數(shù)降低，電場對(duì)蛋白質(zhì)正負(fù)電荷的作用力減小，從而使相反電荷的兩基團(tuán)之間的吸引力增強(qiáng)，相互結(jié)合形成沉淀。4.2有機(jī)溶劑的影響因素與選擇原則1.有機(jī)溶劑通常使用的是甲醇，乙醇，丙酮，異丙醇，氯仿等。有機(jī)溶劑要有較小的電解常數(shù)，電解常數(shù)越小，越易形成沉淀，在藥品及食品的生產(chǎn)中，要選用無毒的溶劑。使用時(shí)注意環(huán)境溫度的影響高，防止高溫蛋白質(zhì)與有機(jī)溶劑的變化。2.由于在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度是最小的通常選擇在等電點(diǎn)附近的PH為實(shí)驗(yàn)酸堿度，在溶液中一般通過緩沖劑控制溶液酸堿環(huán)境。3.溶液離子強(qiáng)度也在一定程度影響沉淀。4.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量與有機(jī)溶劑用量，一般來說，待分離組分的相對(duì)分子質(zhì)量越小，有機(jī)溶劑用量就越多，不同濃度的有機(jī)溶劑能使溶質(zhì)中不同的組分先后沉淀，起到分步沉淀的效果。5.溫度，有機(jī)溶劑存在時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度隨溫度的降低而降低，且蛋白質(zhì)，酶等對(duì)溫度變化較為敏感溫度升高時(shí)，易發(fā)生變性。因此，沉淀蛋白質(zhì)應(yīng)盡量采用低溫操作。選擇原則：水溶性好，不與蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，性質(zhì)穩(wěn)定無毒，操作簡易。大量的實(shí)驗(yàn)表明，在有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)一般選用無毒，易獲得的乙醇為沉淀劑，在乙醇提取蛋白質(zhì)的大量實(shí)驗(yàn)表明，蛋白質(zhì)的沉淀率與所加的乙醇的濃度有關(guān)，一般成正相關(guān)。例如吳海鑰等的有機(jī)溶劑沉淀紅棗的實(shí)驗(yàn)就曾表明乙醇的濃度為80%所沉淀的蛋白質(zhì)的總量是最多的，相比于60%，70%的乙醇。總結(jié)自然界中蛋白質(zhì)的種類有很多種，它們分別有不同的結(jié)構(gòu)和功能，在實(shí)際的生活中它們都不是單獨(dú)存在的，而是與其它一些有機(jī)分子相互結(jié)合。實(shí)際上，要獲得高純度，高活性的蛋白質(zhì)我們一般根據(jù)其蛋白質(zhì)的特殊性，而采用不同的分離方法。一般對(duì)于疏水性較大的蛋白質(zhì)(如酪氨酸)，親水性很強(qiáng)的蛋白質(zhì)(如明膠)通常采用等電點(diǎn)沉淀法。應(yīng)用實(shí)例有大豆蛋白的堿提酸沉，工藝流程為：豆料材料→堿液提取兩次→粗慮→酸性沉淀→打漿→回調(diào)→改性→噴粉→成品。等電點(diǎn)法的優(yōu)點(diǎn)是在實(shí)驗(yàn)中不需要進(jìn)行后續(xù)的除鹽，其缺點(diǎn)是由于操作過程中通過調(diào)節(jié)PH，這樣很容易造成蛋白變性的困擾。鹽析法的使用則主要是對(duì)同類物質(zhì)之間的分離，如酶和蛋白質(zhì)，RNA和DNA等物質(zhì)之間由于分離情況復(fù)雜，一般選用鹽析沉淀分離法。該方法方便簡單，主要用于蛋白質(zhì)的粗提，濃縮等。操作成本低，不需要要特別貴重的儀器設(shè)備，而且對(duì)生物的活性有較好的保護(hù)等優(yōu)點(diǎn)是它成為使用最普遍的沉淀方法。應(yīng)用實(shí)例有雞蛋卵黃免疫球蛋白提取操作步驟：雞蛋材料→混合蛋黃與鹽溶液混合液→調(diào)節(jié)PH→靜置→離心→取上清液→二次降低鹽濃度→沉淀→分離。對(duì)于一些與脂質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)或一些側(cè)鏈較多，不溶于稀酸，稀堿，或稀鹽溶液的蛋白質(zhì)，通過有機(jī)溶劑沉淀法，可以達(dá)到很好的效果。該方法相對(duì)于鹽析法而言具有蛋白質(zhì)分變力好，溶劑易除去等，但其易使蛋白變性，且操作要求較嚴(yán)格的缺點(diǎn)也是限制在實(shí)際使用的主要因素。應(yīng)用實(shí)例有高粱蛋白質(zhì)的提取，其基本工藝流程為：高粱粉→萃取→離心→沉淀→水洗→烘干。參考文獻(xiàn)[1]張?jiān)解?于懿,楊敏慧,祝銘,曹雪慧,朱丹實(shí).蘋果濁汁加工過程中多酚和蛋白質(zhì)參與沉淀形成的研究[A].中國食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì).中國食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì)第十八屆年會(huì)摘要集[C].中國食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì):中國食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì),2022:208-209.[2]鐘為章,楊珂,洪晨,許彬,馮衛(wèi)博,陳賽男,李月,李再興.沉淀法分離青霉素菌渣中蛋白質(zhì)工藝的優(yōu)化[J].環(huán)境工程學(xué)報(bào),2021,15(06):2027-2036.[3]楊珂.嗜熱菌水解青霉素菌渣及蛋白質(zhì)提取研究[D].河北科技大學(xué),2021.[4]聞崇煒,趙燁清,石莉,歐陽臻.聚乙二醇沉淀蛋清蛋白質(zhì)的規(guī)律及在卵白蛋白分離中的應(yīng)用[J].食品科學(xué),2018,39(01):29-35.[5]楊勇,丁洪波,唐建,王健美.不同凍存溫度及時(shí)間對(duì)人血漿蛋白分離沉淀中蛋白質(zhì)的影響[J].生物化工,201