SZDBZ 268-2017 動物產(chǎn)品及飼料中黃牛、水牛和牦牛源性成分實時熒光PCR檢測方法

SZDB/ZSZDB/Z268—2017分實時熒光PCR檢測方法Real-timePCRmethodfordetectionofcattle,buffaloandyak-derive2017-09-12發(fā)布2017-10-01實施深圳市市場監(jiān)督管理局發(fā)布I 1 1 1 1 2 2 3 3 4 5 7 9 1法GB/T27403實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食dNTP：脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasEDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetePBS：磷酸鹽緩沖液（phosphateb2FAM：6-羧基熒光素（6-carbox冰箱（2℃~8℃,-20℃,-80℃);a)上游引物cyt-p1：5’-C(AT)TACACCTTCCTAGAAACATGAAA(CT)-3’b)下游引物cyt-p2：5’-TGG(CT)AGTAC(AG)TA(CT)CCTAT(AG)AATGCTGT(AG)-3’3a)上游引物cox-p1：5’-CTATATTTTAATTTTACCCGG-3’b)下游引物cox-p2：5’-CTATGTATCCGAATTGTTCTT-3’a)黃牛源性成分檢測探針cattle-p：5’-FAM-TAATCCTTCTGCTCAC-BHQ-3’b)水牛源性成分檢測探針buffalo-p：5’-HEX-TAATCTCCCACATTGTA-BHQ-3’c)牦牛源性成分檢測探針yak-p：5’-CY5-TGGAGTAATTCTTCTACTTAC-BHQ-3’），），4c=A×N×50/1000……………（1）c——DNA濃度，單位為微克每微升(μg/μL當(dāng)A9.1反應(yīng)體系配制反應(yīng)體系總體積為25μL。根據(jù)需檢測的牛源性成分種類，加入相應(yīng)的檢測引物和探針溶液各0.5μL，模板液加入2～5μL，再參照選用的PCR檢測試劑盒說明書加入其它相關(guān)試劑和模板液進行體系的PCRMasterMix試劑盒為例，列出反應(yīng)體系配制表，僅供參考）。同時設(shè)置9.2設(shè)置實驗對照9.2.2空白對照9.2.3.1同時檢測黃牛、水牛和牦牛三種源性成9.2.3.2只檢測黃牛、水?；蜿笈Ｆ渲幸环N或兩種源性成分時，則采用需檢測的牛肉種類提取DNA，作9.3.1反應(yīng)條件設(shè)定反應(yīng)程序可根據(jù)具體的熒光PCR檢測儀型號來設(shè)定，在一般反應(yīng)程序基礎(chǔ)上做適當(dāng)調(diào)整。一般程序為：95℃5min；95℃5s，5報告熒光（reportdye）分別按需檢測的牛源性成分探針標(biāo)記物的種類進行設(shè)定，其中黃牛源性檢測選定FAM，水牛源性檢測選定HEX，牦牛源性檢測選定CY5。淬滅熒光（quenchdye）設(shè)定為None?？筛鶕?jù)不同品牌儀器說明等效設(shè)置相關(guān)參數(shù)。的一種或兩種提取的DNA作為模板的陽性對照，應(yīng)只有對應(yīng)的一種或兩種熒光信號的檢出，對應(yīng)的熒光Ct值>38.0或無Ct值且不出現(xiàn)擴增曲線，可判為陰性結(jié)果，表明從樣品中未檢出對應(yīng)牛種類當(dāng)出現(xiàn)35.0<Ct值≤38.0時，判為結(jié)果可疑，需重新檢測。對于可疑結(jié)果的樣品，應(yīng)按本文件第66+++表明從樣品中同時檢出黃++—表明從樣品中同時檢出黃+—+表明從樣品中同時檢出黃 ++表明從樣品中同時檢出水+——只有FAM熒光被檢出，Ct值≤35.0且呈現(xiàn)典型擴增曲線，表明從樣品中只檢出黃牛—+—只有HEX熒光被檢出，Ct值≤35.0且呈現(xiàn)典型擴增曲線，表明從樣品中只檢出水牛——+只有CY5熒光被檢出，Ct值≤35.0且呈現(xiàn)典型擴增曲線，表明從樣品中只檢出牦?！?A.11.0mol/L、pH8.0三（羥甲基）氨Tris飽和苯酚（Tris-Phenol）A.30.5mol/L、pH8.0乙三氯甲烷（CHCl3）48mLA.6磷酸鹽緩沖溶液（0.01mo無水磷酸氫二鈉（Na2HPO4）無水磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.24g氯化鈉（NaCl）8雙蒸水（ddH2O）800mL9B.1同時檢測黃牛、水牛和牦牛的三重實時熒光P在上述配制好的PCR反應(yīng)液中，按實驗設(shè)置，加入下列相應(yīng)的模板液：在上述配制好的PCR反應(yīng)液中，按實驗設(shè)置，加入下列相應(yīng)的模板液：catacaccttcctagaaacatgaaacattggagtaatccttctgctcacagtaatagccacagcactatattttaatttta