T-CVMA 159-2024 豬鏈球菌通.用型與2型雙重TaqMan實時熒光PCR檢測方法

T/CVMA159—2024豬鏈球菌通用型與2型雙重TaqMan實時熒光PCR檢測方法DetectionmethodofduplextheTaqManreal-timePCRassayforStreptococcussuisGeneralandSerotype22024-5-8發(fā)布2024-5-8實施中國獸醫(yī)協(xié)會發(fā)布I12規(guī)范性引用文件NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范實時熒光PCR：實時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-timepolymerasechainCt值：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號量達到設(shè)定的閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（CyDNA：脫氧核糖核苷酸（Deoxyribonucleicacid）VIC：熒光發(fā)光基團（VioletInvader）BHQ：無熒光淬滅基團（Blackholequencher）DEPC：焦碳酸二乙酯（Diethylpyrocarbonate）ddH2O：雙蒸水（Distillation-DistillationH2O）gdh：谷氨酸脫氫酶（Glutamatedehydrogenacps2J：莢膜多糖（capsularpolysaccharide2J）CVCC：中國獸醫(yī)微生物菌種保藏中心（ChinaVeterinaryCultureCollectionCen5試劑和耗材25.1試劑5.1.5酚/氯仿/異戊醇混合液按5.1.9PCR試劑及DNA凝膠回收試20μL、200μL和1000μL）、冰箱（2℃~8℃和?20℃以下）、組織勻漿器、混勻器。8細(xì)菌核酸的提取38.1血液樣品DNA提取8.2豬鼻/口拭子、唾液、關(guān)節(jié)液及環(huán)境樣品DNA提取重懸，水浴鍋沸水中煮10min，冰浴5min，12000r/min離心1min，取上清作為PCR擴增模板。8.3臨床組織樣品（扁桃體、肺臟等）DNA提取8.3.1用無菌剪刀和鑷子剪取典型病變組織0.5g~1.0g，消化液II，反復(fù)吹吸混勻，置55℃,水浴30min~60min。9.1反應(yīng)體系雙重TaqMan實時熒光定量PCR反應(yīng)體系見9.2反應(yīng)程序雙重TaqMan實時熒光定量PCR反應(yīng)程序見9.3結(jié)果判定9.3.1質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)所有陽性對照的FAM和VIC檢測通道均有典型的S型擴增曲線，陰性對照的FAM和VIC檢測通道9.3.2結(jié)果判定45A.1豬鏈球菌gdh基因片段參考序列（GenBankAccessionNo.AM946016.5'-ATCAAATGCCAAAGCTTACATCCAAGCTTCTTTTGAAGCAGTCAAAGATGAAACAGAATTCCTCCAAGCTGTAGAAGAGCTCTTCTCTACACTTGAGCCTGTTCACCCAGAATACATCGAAGAAAACATCTTGGCTCGTATCGTTGAGCCTGAGCGTATCACCGTGTTCCATGGACAGATAAAGATGGAAATGTTCAAGTCAACCGTGGCTACCGTGTTCAGTTCAACTCAGCTGTAGGTCCTTATAAAGGCGGTCTTCGCTTCCACCCAACTGTAAACCAATCCTTGAAGTTCCTCGGTTTTGAGCAAATCTTCAAAAACGTCTTGACTGGTCTTCAAAGGTGGTTCAGACTTTGATCCTAAAGGAAAAACTGATGCTGAAATCATGCGCTTCCTTCATGACTGAATTGCAAAAACACATCGGACCTTCACTTGACGTCCCTGCTGGTCGGTGGTCGTGAGATCGGTTACATGTACGGTCAATACAAACGCCTCCGCCAGTTGTCTTGACTGGTAAACCTCTTGGCTTCGGTGGTTCATTGATCCGCCCAGAAGCATTTGGTTTACTTCACTGATAACATGTTGGCAGCAAACGGTAAATCCTTCAAAGACCAATTATCTCAGGTTCTGGTAACGTTGCCCAATATGCTGTTCAAAAAGCGACTGAACTTGGTTATTTCTGTTTCAGACTCAAATGGTTACATCATTGACGAAACTGGTATCGACTTCGAGTGGACATCAAAGAAAAACGCCGCGCTCGTTTGACAGAATACGCTGCAGAAAAATCAAGTACTTCAAAGGTTCTGTATGGAACTACGATGGCAAGGCTGATATTGCCCCAAAATGAGATCAACGGCAAACAAGCTGCTGCCCTTGTAAAAAATGGCGTGTAAGGTGCCAACATGCCATCTGACCTTGATGCCATCAAAGTCTACAAGGAAAATGGCGGACTCGCAAAAGCTGCCAACGCTGGTGGTGTAGCTGTATCTGCCCTTGAAATGAGTCAAAAGCCTTCGCTTGTCATGGACTCGTGAAGAAGTAGACGGCCGTCTTAAAGACATCATTTCAACACAGCCAAAGAAACTGCTGAAAAATACGACCTTGGTACAGACTACCTACATCGCAGCCTTTGAACAAATTGCGGATAGCATGATTGCCCAAGGTTTGGTATAA-3'注：下劃線部分為連入pMD-18T載體中的包含豬鏈球菌gdh目標(biāo)檢測片段部分，粗體為引物和探針A.2豬鏈球菌2型cps2J基因片段參考序列（GenBankAccessionNo.FM25TTAGATAGCATTATTTCCCAATCGTATACTAATCTAGAGATTCTTTTGATAGATGACGGTTCTTCAGATTCATCAACGGATATATGTTTGGAATACGCAGAGCAAGATGGTAGAATAAAACTTTTGGTTACCAAATGGTGGTGTTTCAAACGCAAGGAATTACGGTATCAAAAATAGCACAGCTATTATGTTTGTAGATTCTGATGATATTGTTGACGGCAACATTGTTGAGTCCTTATACACCAAAAGAGAATGATAGTGATTTGTCGGGAGGGTTACTTGCTACTTTTGATGGAAATTATCCTGAGCTGCAAAAGTGTCAAATTGATTTGGAAGAGATAAAAGAGGTGCGAGACTTAGAAATTTTCCAAATCATTATATGAGCGGTATCTTTAATAGCCCTTGTTGCAAACTTTATAAATATATAAACAAAGGTTTTGACACTGAACAGTGGTTAGGAGAGGACTTATTATTTAATCTATTTAAAGAATATAAAAAAAGTCAGCTATGTAAACAGAAATCTTTATTTTGCTAGAAGACAAAGTACTACAAATACGTTTAAAAAAGATGTTTTTATTCAATTAGAAAATTTAGAAGA6TTTTGATTTGTTTGTTAAAATATTTGGTGGACAATATGAATTTTCTGTTTTTAAAGGTGGCATATTATTTATTATAGCTTATTAATGTTCAAAAATGGAGATGAATCGCTTCCAAAGATGCATATATTTAAGTATTTATACAATAGGCATTCTTTAGATACTCTAAGTATTAAACGAACTGTTTTTAAAAGAATATGTAAATTAATTGTTGCTAATAATTTGTTTAAAATTTTTTTAAATAATTAGGGAAGAAAAAAATAATGATTAA-3'注：下劃線部分為連入pMD-18T載體中的包含豬鏈球菌cps2J目標(biāo)對特異性引物分別進行單一PCR擴增，P拷貝數(shù)/μL=[6.02×1023×DNA濃度（ng/μL）×10-9]/（DNA堿基數(shù)×660），經(jīng)計算并將重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品A.4陰性對照的制備滅菌生理鹽水：稱取0.9g氯化鈉，溶解在7gdh5’-TGGACAGATAAAGATGGAAA-3’Gdh-R5’–GATGGATTGGTTTACAGTTG-3’Gdh-Probe5’-FAM-AAGTCAACCGTGGCTACCGT-BHQ1-3’cps2Jcps2J-F5’–TCCCAATCGTATACTAATCTA-3’cps2J-R5’–CGGAAAAGTTTTATTCTACC-3’cps2J-Probe5’-VIC-ACGGTTCTTCAGATTCATCAACGGATA-BHQ2-3’8Tris-HCl（pH值8.0）終濃度為10mmol/L；EDTA（pH值8.0）終濃度為250mmol/L；SDS終濃度為200ug/mL；NaCl終濃度為100mmol/L。杯中加入約400mlddH2O均勻混合；將溶液定容到509表D.1雙重TaqMan實時熒光PCR反應(yīng)體體積(μL）終濃度(μM）2×AnimalDetectionU+ProbeqPCRSuperPre25.0注：1.此反應(yīng)體積以AnimalDetectionU+ProbeqPCRSup試劑說明書配制。2.本實驗使用的