實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 豬母系遺傳結(jié)構(gòu)檢測(cè)方法

ICS?FORMTEXT65.020.30FORMTEXTB44DB23DB23/TFORMTEXTXXXXX—FORMTEXTXXXXFORMTEXT?????FORMTEXT實(shí)驗(yàn)動(dòng)物豬母系遺傳結(jié)構(gòu)檢測(cè)方法（征求意見(jiàn)稿）主要起草單位：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所聯(lián)系人：高彩霞聯(lián)系電話系信箱：gaocaixia@FORMTEXT?????FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX發(fā)布FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX實(shí)施FORMTEXT黑龍江省市場(chǎng)監(jiān)督管理局???發(fā)布DBXX/XXXXX—XXXX前??言本標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)GB/T1.1-2009的編寫(xiě)規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由黑龍江省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出。本標(biāo)準(zhǔn)由黑龍江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所、甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)、東北農(nóng)業(yè)大學(xué)、青島農(nóng)業(yè)大學(xué)。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：高彩霞、陳洪巖、趙生國(guó)、劉芳萍、遲良。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物豬母系遺傳結(jié)構(gòu)檢測(cè)方法范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了實(shí)驗(yàn)豬母系遺傳結(jié)構(gòu)檢測(cè)方法的原理、樣品采集、樣品DNA的提取、引物序列、PCR擴(kuò)增、數(shù)據(jù)處理和結(jié)果分析。本標(biāo)準(zhǔn)適用于實(shí)驗(yàn)豬母系遺傳結(jié)構(gòu)的檢測(cè)與分析。規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T35892實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查指南NY/T541動(dòng)物疫病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)采樣方法NY/T1673畜禽微衛(wèi)星DNA遺傳多樣性檢測(cè)技術(shù)規(guī)程原理線粒體DNA是核外唯一的遺傳物質(zhì)，遺傳上具有自主性，呈嚴(yán)格的母系遺傳，記載著母系基因的遺傳史。它由編碼區(qū)和非編碼區(qū)組成，非編碼區(qū)又叫做控制區(qū)(D-loop區(qū))，是線粒體DNA的遺傳高變區(qū)。檢測(cè)方法是采集實(shí)驗(yàn)豬的耳或尾組織，提取基因組DNA，合成一對(duì)特異性引物對(duì)線粒體DNAD-Loop區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，核酸凝膠電泳檢測(cè)目的條帶，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序，分析單倍型多樣度和遺傳多樣性從而確定實(shí)驗(yàn)豬群的母系遺傳結(jié)構(gòu)。樣品采集采樣個(gè)體應(yīng)具備該豬品種的典型特征，每個(gè)品種采集要求三代內(nèi)無(wú)血緣關(guān)系的豬個(gè)體不少于40頭。按照NY/T541采集實(shí)驗(yàn)豬的耳或尾組織，動(dòng)物福利遵循GB/T35892。樣品的采集及保存應(yīng)滿足提取DNA的要求。詳細(xì)記錄材料名稱、來(lái)源、系譜、采集時(shí)間、地點(diǎn)和保存條件。樣品DNA的提取根據(jù)NY/T1673中的苯酚氯仿法，或商品化試劑盒提取樣品DNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度和純度，濃度＞50ng/μL，純度OD260/OD280=1.6～1.8。引物序列D-loopF：5'-CCAAGACTCAAGGAAGGAGA-3'。D-loopR：5'-GGCGCGGATACTTGCATGTG-3'。PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增體系PCR反應(yīng)體系為50μL：Taq酶(5U/μL)0.25μL，10×Taqbuffer(含Mg2+)5μL，dNTPmix(2.5mmol/L)4μL，上、下游引物(10pmol/μL)各1μL，DNA模板2.5μL(約350ng/μL)，ddH2O36.3μL。同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照。PCR擴(kuò)增程序擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，30次循環(huán)；72℃延伸4min。PCR產(chǎn)物檢測(cè)取5μLPCR產(chǎn)物與上樣緩沖液混合，于1%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，紫外燈下出現(xiàn)目的條帶大小約1.5kb且條帶單一清晰，對(duì)照無(wú)條帶。數(shù)據(jù)處理對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序，重復(fù)測(cè)序三次，應(yīng)用生物信息學(xué)軟件分析序列。核對(duì)編輯原始序列，編輯后序列建立數(shù)據(jù)庫(kù)，去除重復(fù)片段、插入和缺失堿基，進(jìn)行同源序列比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)行中介網(wǎng)絡(luò)關(guān)系分析和遺傳多樣性分析。結(jié)果分析所有檢測(cè)豬序列分析中只要出現(xiàn)堿基變異就判