遺傳病致病基因的克隆課件

遺傳病致病基因的克隆和功能研究遺傳病致病基因的克隆遺傳病

遺傳病(geneticdiseases)是由于遺傳物質(zhì)改變而導(dǎo)致的疾病。遺傳物質(zhì)是存在于細(xì)胞內(nèi)的、決定特定性狀的基因。

遺傳病致病基因的克隆疾病基因的定位和克隆疾病基因定位的含義疾病基因定位，是指將致病基因定位到人類(lèi)染色體的某一區(qū)段上。疾病基因克隆疾病基因的克隆是指疾病基因的鑒定，找到導(dǎo)致疾病的致病基因。遺傳病致病基因的克隆

分類(lèi)發(fā)病率(%)

基因病

單基因?。∕onogeneticDisease）2.5

常染色體顯性遺傳病0.9

常染色體隱性遺傳病1.3

性連鎖遺傳病0.3

線(xiàn)粒體病

多基因?。≒olygeneticDisease）18.0

染色體病

0.54

常染色體異常的疾病0.36

性染色體異常的疾病0.182遺傳性疾病的分類(lèi)及發(fā)病率遺傳病致病基因的克隆單基因遺傳病

由于單個(gè)基因突變所引起的疾病，這類(lèi)疾病的遺傳符合Mendel遺傳規(guī)律，如血友病、色盲、白化病。

遺傳病致病基因的克隆多基因遺傳病

由多個(gè)微效基因與環(huán)境因素共同作用所引起的疾病。

如：精神分裂癥、高血壓、冠心病等

遺傳病致病基因的克隆

染色體病

染色體?。╟hromosomaldisorders）由于染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常所引起的疾病，如唐氏綜合，脆性X染色體綜合征。遺傳病致病基因的克隆人體細(xì)胞的遺傳物質(zhì)人的基因組大?。?0億個(gè)堿基對(duì)個(gè)rRNA基因和22個(gè)tRNA基因，13個(gè)編碼蛋白質(zhì)基因，編碼序列占93%。遺傳病致病基因的克隆人類(lèi)的基因數(shù)目遺傳病致病基因的克隆如何克隆遺傳病的致病基因？1.PCR2.DNA多態(tài)性遺傳標(biāo)記遺傳病致病基因的克隆PCR（

PolymeraseChainReaction）KaryMullis1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主1973年獲加州大學(xué)伯克利分校生物化學(xué)博士快速擴(kuò)增目的DNA片段，30次循環(huán)將擴(kuò)增上10億個(gè)靶DNA片段的拷貝遺傳病致病基因的克隆遺傳病致病基因的克隆KaryMullis

在Cetus公司工作期間，他原本是要合成DNA引物來(lái)進(jìn)行測(cè)序工作，但為沒(méi)有足夠多的模板DNA而煩惱。1983年5月一個(gè)星期五的晚上開(kāi)車(chē)去郊外度假的路上聯(lián)想起DNA復(fù)制的過(guò)程，引發(fā)了用兩個(gè)引物（而不是一個(gè)引物）去擴(kuò)增模板DNA的想法。遺傳病致病基因的克隆PCR背后的故事遺傳病致病基因的克隆PCR背后的故事遺傳病致病基因的克隆DNA多態(tài)性

DNA多態(tài)性是指染色體DNA等位基因中核苷酸排列的差異性，分為序列多態(tài)性和序列長(zhǎng)度多態(tài)性。遺傳病致病基因的克隆DNA多態(tài)性遺傳標(biāo)記第一代遺傳標(biāo)記：ABO血型位點(diǎn)標(biāo)記，HLA位點(diǎn)標(biāo)記，限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）第二代遺傳標(biāo)記：微衛(wèi)星標(biāo)記（microsatellitemarker），又稱(chēng)短串聯(lián)重復(fù)（STR）第三代遺傳標(biāo)記：1996年MIT的LanderES提出了SNP(singlenucleotidepolymorphism)遺傳標(biāo)記系統(tǒng)新的遺傳標(biāo)記：拷貝數(shù)變異。遺傳病致病基因的克隆

DNA多態(tài)在醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)中的應(yīng)用

1.基因定位：DNA多態(tài)在人類(lèi)基因定位中起著非常重要的作

用。

2.要確定個(gè)體之間的親緣關(guān)系，DNA多態(tài)分析是最有效的方法，可以通過(guò)檢測(cè)待分析個(gè)體的DNA多態(tài)位點(diǎn)，通過(guò)等位基因

分析確定他們之間的血緣關(guān)系。

3.追蹤額外染色體起源：如在對(duì)21三體患者進(jìn)行病因分析時(shí)

，通常需要分析21三體患者額外的21號(hào)染色體的起源，可以

通過(guò)DNA多態(tài)位點(diǎn)分析進(jìn)行。

4.鑒定細(xì)胞來(lái)源：在進(jìn)行移植時(shí)，通常需要跟蹤移植細(xì)胞在

受體內(nèi)的狀態(tài)，可以采用DNA多態(tài)位點(diǎn)分析確定細(xì)胞來(lái)源。遺傳病致病基因的克隆微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記(shorttandemrepeat，STR)

指重復(fù)單位在2-6bp、并且呈串聯(lián)排列的重復(fù)序列，其重復(fù)次數(shù)在群體中存在變異。如（CTA）n不同等位基因表現(xiàn)為n的差異。遺傳病致病基因的克隆DNA多態(tài)性RFLP（restrictionfragmentlengthpolymorphism，限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)）EcoRI內(nèi)切酶切割GAATTC序列遺傳病致病基因的克隆SNP（singlenucleotidepolymorphism）單核苷酸多態(tài)

一般而言，SNP是指變異頻率大于1％的單核苷酸變異，SNP在基因組中分布相當(dāng)廣泛，人類(lèi)基因組中每300個(gè)堿基對(duì)就出現(xiàn)一次。遺傳病致病基因的克隆

拷貝數(shù)變異(copynumbervariation,CNV)

拷貝數(shù)變異(copynumbervariation,CNV),它是一種大小介于1kb到3Mb之間的DNA片段的缺失、重復(fù)、倒位和易位,在人的基因組中都分布廣泛.遺傳病致病基因的克隆DNA多態(tài)性的檢測(cè)RFLP（restrictionfragmentlengthpolymorphism，限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)）的檢測(cè)遺傳病致病基因的克隆微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記的檢測(cè)

要檢測(cè)個(gè)體的基因型，通常是采用PCR擴(kuò)增結(jié)合變性聚丙烯酰胺凝膠電泳法，即在重復(fù)序列兩側(cè)按單一序列設(shè)計(jì)引物，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物在變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，電泳結(jié)果如圖所示，根據(jù)電泳結(jié)果按片段大小依次命名等位基因1，2，3…遺傳病致病基因的克隆基因拷貝數(shù)變異的檢測(cè)方法

比較基因組雜交芯片（用于全基因組CNVs檢測(cè)）原理：將目的基因和參考基因用不同的熒光進(jìn)行標(biāo)記后與芯片上的DNA片段進(jìn)行雜交而產(chǎn)生不同的熒光信號(hào)比值，從而得到兩者之間拷貝數(shù)的差別SNP芯片法（用于全基因組CNVs檢測(cè)）原理：與比較基因組雜交芯片不同的是，SNP芯片不需要進(jìn)行雙雜交，只需將目的基因與SNP芯片雜交得到雜交信號(hào)強(qiáng)度，然后與已知的參考雜交信號(hào)對(duì)比得出目的基因與參考基因之間拷貝數(shù)的差別。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（針對(duì)單個(gè)基因）原理：分別針對(duì)待檢測(cè)基因上的序列和對(duì)照基因序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物和標(biāo)記不同熒光基團(tuán)的檢測(cè)探針。通過(guò)對(duì)擴(kuò)增后兩個(gè)探針信號(hào)指示的Ct值進(jìn)行比較從而判斷目標(biāo)基因拷貝數(shù)。遺傳病致病基因的克隆單基因病的傳遞方式

（一）常染色體顯性遺傳?。╝utosomaldominantdisease，AD）定義：致病基因位于常染色體上，致病基因?yàn)轱@性基因。遺傳病致病基因的克隆常染色體隱性遺傳?。╝utosomalrecessivediseases，AR）定義：致病基因位于常染色體上，致病基因?yàn)殡[性基因?；蛐团c表現(xiàn)型的對(duì)應(yīng)關(guān)系：基因型：AAAaaa表現(xiàn)型：正常正常（攜帶者）患者遺傳病致病基因的克隆X連鎖隱性遺傳病（X-linkedrecessivediseases，XR）致病基因位于X染色體上，致病基因?yàn)殡[性基因。遺傳病致病基因的克隆X連鎖顯性遺傳?。╔-linkeddominantdiseases，XD）致病基因位于X染色體上，致病基因?yàn)轱@性基因。遺傳病致病基因的克隆Y連鎖遺傳病（Y-linkeddiseases，YL）致病基因位于Y染色體上，隨Y染色體遺傳。遺傳病致病基因的克隆線(xiàn)粒體遺傳病（mitochondrialdiseases）致病基因位于線(xiàn)粒體基因組上，由于受精卵的細(xì)胞質(zhì)主要來(lái)自卵子，存在于細(xì)胞質(zhì)中的線(xiàn)粒體也來(lái)自卵子，所以線(xiàn)粒體遺傳病表現(xiàn)為母系遺傳遺傳病致病基因的克隆克隆單基因遺傳?。ㄎ豢寺〉脑?/p>

定位克隆的基本思路是通過(guò)連鎖分析原理進(jìn)行基因定位。若多態(tài)性遺傳標(biāo)記與待定基因距離較遠(yuǎn)，則它們?cè)谙蜃哟鷤鬟f時(shí)會(huì)發(fā)生自由分離而呈現(xiàn)“連鎖平衡”；反之，則不發(fā)生自由分離，而呈“共分離（Co-segregation）”現(xiàn)象。由此可以在染色體上定位與某一DNA標(biāo)記相連鎖的致病基因。

使用的遺傳標(biāo)記：微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記，精細(xì)定位時(shí)也輔助用到SNP遺傳標(biāo)記遺傳病致病基因的克隆

連鎖分析法（linkageanalysis）

用連鎖分析方法進(jìn)行基因定位是通過(guò)分析擬定位致病基因產(chǎn)生的表型效應(yīng)（如疾?。┡c染色體上多態(tài)位點(diǎn)之間的連鎖關(guān)系。基本原理是位于同一染色體上兩個(gè)基因位點(diǎn)（如致病基因與微衛(wèi)星標(biāo)記）

在減數(shù)分裂的過(guò)程中會(huì)發(fā)生交換與重組，假如兩個(gè)位點(diǎn)相距很近的時(shí)候，遺傳標(biāo)記和致病基因（疾病表型）共分離，那么說(shuō)明致病基因就在遺傳標(biāo)記附近，反之則致病基因不在遺傳標(biāo)記附近。遺傳病致病基因的克隆Lod值

精確分析基因之間的連鎖關(guān)系，通常采用優(yōu)勢(shì)對(duì)數(shù)法，也稱(chēng)Lod計(jì)分法。Lod得分是在一定重組率下兩個(gè)位點(diǎn)相連鎖的似然性與兩個(gè)位點(diǎn)不連鎖的似然性比值的對(duì)數(shù)值在進(jìn)行連鎖分析時(shí)，要計(jì)算

=0.0（不重組）到

=0.5（隨機(jī)分配）的一系列Lod得分。當(dāng)Lod得分為+3或更大時(shí)，肯定連鎖；當(dāng)Lod得分小于或等于-2時(shí)，排除連鎖。Lod得分最大時(shí)的

值被接受為最大似然估計(jì)值。遺傳病致病基因的克隆單基因遺傳病致病基因的定位與克隆的流程遺傳病致病基因的克隆遺傳病致病基因的克隆

單基因遺傳病致病基因克隆的研究策略定位（全基因組連鎖分析）篩選候選基因基因突變的篩查驗(yàn)證（家系成員，正常對(duì)照群體的突變篩查）基因的功能研究，闡明致病機(jī)理遺傳病致病基因的克隆單基因遺傳病致病基因定位的實(shí)驗(yàn)方法

基于遺傳病家系的全基因組掃描，對(duì)覆蓋整個(gè)基因組的微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記，逐個(gè)驗(yàn)證其與疾病表型的連鎖關(guān)系，找到與疾病表型相連鎖的微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記，而將致病基因定位在兩個(gè)或多個(gè)微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記所在的區(qū)域。微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記ABI3100遺傳分析儀遺傳病致病基因的克隆微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記

不同熒光標(biāo)記引物擴(kuò)增覆蓋全基因組的382個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記遺傳病致病基因的克隆ABI3100遺傳分析儀遺傳病致病基因的克隆遺傳病致病基因的克隆新的房顫致病基因NUP155的發(fā)現(xiàn)及其致病機(jī)理研究

遺傳病致病基因的克隆房顫（AF,AtrialFibrillation）是最常見(jiàn)的心律失常疾病之一，15%的中風(fēng)是由房顫引起的。房顫病人正常人房顫遺傳病致病基因的克隆遺傳病致病基因的克隆來(lái)自南美洲的房顫病家系烏拉圭遺傳病致病基因的克隆近親結(jié)婚的隱性遺傳的房顫家系遺傳病致病基因的克隆NUP155基因測(cè)序結(jié)果遺傳病致病基因的克隆遺傳病致病基因的克隆NUP155蛋白

NUP155基因編碼一種分子量為155kDa的核孔蛋白，NUP155蛋白是核孔復(fù)合體的重要成分。遺傳病致病基因的克隆構(gòu)建GFP的融合表達(dá)載體表達(dá)GFP和NUP155融合蛋白突變對(duì)NUP155蛋白定位的影響GFP:綠色熒光蛋白在特定波長(zhǎng)的激光照射下可以發(fā)出綠色熒光遺傳病致病基因的克隆GFP的發(fā)現(xiàn)－2008年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)遺傳病致病基因的克隆突變對(duì)NUP155蛋白定位的影響遺傳病致病基因的克隆NUP155Knockout小鼠模型基因誘捕（genetrap）

β-geoβ-gal+NeoTheBayGenomics/UniversityofCalifornia,Davis遺傳病致病基因的克隆NUP155基因在小鼠心臟組織中的表達(dá)純合子NUP155基因敲除小鼠死于胚胎發(fā)育的8.5天前，雜合子NUP155基因敲除小鼠能存活。RT-PCRWesternBlot遺傳病致病基因的克隆NUP155基因在心肌細(xì)胞中的表達(dá)

免疫染色遺傳病致病基因的克隆小鼠心電圖的記錄DSIFA-20電極的植入遺傳病致病基因的克隆小鼠心電圖的記錄遺傳病致病基因的克隆遺傳病致病基因的克隆NUP155基因?qū)е路款澋臋C(jī)理NUP155基因突變房顫

機(jī)理？NUP155功能：核孔復(fù)合體的成分,與NUP155相互作用的蛋白Gle1B負(fù)責(zé)mRNA的運(yùn)輸房顫發(fā)生的機(jī)理：心臟電活動(dòng)改變（離子通道基因），心臟結(jié)構(gòu)的改變遺傳病致病基因的克隆NUP155基因敲除小鼠心臟組織結(jié)構(gòu)a-actin免疫染色遺傳病致病基因的克隆心房心肌細(xì)胞動(dòng)作電位全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄心肌細(xì)胞動(dòng)作電位遺傳病致病基因的克隆基因敲除小鼠心房組織的電鏡照片遺傳病致病基因的克隆基因敲除小鼠心房組織的電鏡照片NPCNPCNPC遺傳病致病基因的克隆Nup155與HSP70的關(guān)系Gle1蛋白與NUP155蛋白相互作用將Gle1蛋白定位到核孔復(fù)合體上2.Gle1蛋白與核孔蛋白CG1相互作用,介導(dǎo)HSP70mRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)3.小鼠敲除HSP70基因影響小鼠心臟的收縮功能和心肌細(xì)胞鈣離子的動(dòng)態(tài)平衡遺傳病致病基因的克隆NUP155對(duì)HSP70mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)的影響RT-PCR免疫染色NUP155基因敲除小鼠心肌細(xì)胞遺傳病致病基因的克隆房顫致病基因的致病機(jī)理分子機(jī)制突變對(duì)蛋白定位的影響突變對(duì)蛋白功能的影響（HSP70mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)）動(dòng)物模型（基因敲除小鼠）表型，心臟組織結(jié)構(gòu)，細(xì)胞水平（動(dòng)作電位），HSP70mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)。遺傳病致病基因的克隆總結(jié)：房顫致病基因的克隆連鎖分析定位致病基因定位區(qū)域內(nèi)候選基因的突變篩選，發(fā)現(xiàn)致病基因正常對(duì)照人群中突變位點(diǎn)的驗(yàn)證分子，細(xì)胞，動(dòng)物模型等各個(gè)層次闡明致病的機(jī)制遺傳病致病基因的克隆MEF2A基因突變與冠心病遺傳病致病基因的克隆冠心病家系

冠心病是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的簡(jiǎn)稱(chēng)。是指供給心臟營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的血管——冠狀動(dòng)脈發(fā)生嚴(yán)重粥樣硬化或痙攣，使冠狀動(dòng)脈狹窄或阻塞，以及血栓形成造成管腔閉塞，導(dǎo)致心肌缺血缺氧或梗塞的一種心臟病，亦稱(chēng)缺血性心臟病。遺傳病致病基因的克隆連鎖分析定位致病基因遺傳病致病基因的克隆定位區(qū)域內(nèi)的候選基因突變篩選定位區(qū)域內(nèi)含93個(gè)基因，其中43個(gè)已知基因，50個(gè)假想基因MEF2A轉(zhuǎn)錄因子，肌肉細(xì)胞增強(qiáng)因子-2家族成員（MEF2family），mef2a基因在小鼠胚胎發(fā)育的早期的血管中就有表達(dá)遺傳病致病基因的克隆MEF2A基因突變篩選遺傳病致病基因的克隆MEF2A蛋白在細(xì)胞中的定位HVSMC(humanumbilicalvascularendothelialcells)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞

HUVEC(Humanvascularsmoothmusclecells)人血管平滑肌細(xì)胞免疫染色遺傳病致病基因的克隆MEF2A基因突變對(duì)定位的影響遺傳病致病基因的克隆MEF2A基因突變對(duì)轉(zhuǎn)錄的影響ANFpromoterMEF2A,GATA-1LuciferaseAssaySystem螢光素酶檢測(cè)系統(tǒng)遺傳病致病基因的克隆熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)熒光素酶可以催化熒光素生物熒光，通過(guò)熒光測(cè)定儀或液閃測(cè)定儀測(cè)定熒光素氧化過(guò)程中釋放的生物熒光。

通過(guò)熒光素和熒光素酶這一生物發(fā)光體系，可以極其靈敏、高效地檢測(cè)基因的表達(dá)。

通常把感興趣的基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件克隆在luciferase的上游或其他適當(dāng)?shù)牡胤?，?gòu)建成報(bào)告基因質(zhì)粒。然后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，適當(dāng)刺激或處理后裂解細(xì)胞，測(cè)定熒光素酶活性。通過(guò)熒光素酶活性的高低判斷刺激前后或不同刺激對(duì)感興趣的調(diào)控元件的影響。遺傳病致病基因的克隆

總結(jié)

通過(guò)定位克隆的方法，首次發(fā)現(xiàn)冠心病的致病基因Mef2a，21bp的突變影響了MEF2A蛋白的入核，從來(lái)影響了下游靶基因的表達(dá)。遺傳病致病基因的克隆多基因疾病的研究策略

全基因組關(guān)聯(lián)分析是目前研究多基因疾病的常用方法全基因組關(guān)聯(lián)分析(genomewideassociationstudy，GWAS)是應(yīng)用人類(lèi)基因組中數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)為標(biāo)記進(jìn)行病例-對(duì)照關(guān)聯(lián)分析，以期發(fā)現(xiàn)影響復(fù)雜性疾病發(fā)生的遺傳特征的一種新策略遺傳病致病基因的克隆全基因關(guān)聯(lián)分析的基本思路對(duì)全基因組范圍內(nèi)的常見(jiàn)遺傳變異:單核苷酸多態(tài)性(Singlenucleotidepolymorphism,SNP)進(jìn)行總體關(guān)聯(lián)分析的方法。

即在全基因組范圍內(nèi)選擇遺傳變異進(jìn)行基因分型,比較病例和對(duì)照間每個(gè)變異頻率的異差,計(jì)算變異與疾病的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度,選出最相關(guān)的變異進(jìn)行驗(yàn)證并最終確認(rèn)與疾病相關(guān)。

理論依據(jù)：如果人群基因組中一些SNP與某種疾病相關(guān)聯(lián)，理論上這些疾病相關(guān)SNP等位基因頻率在某種疾病患者中應(yīng)該高于未患病對(duì)照人群遺傳病致病基因的克隆多基因遺傳病遺傳病致病基因的克隆遺傳病致病基因的克隆遺傳病致病基因的克隆

2005年，Science雜志首次報(bào)道了視網(wǎng)膜黃斑變性GWAS結(jié)果，在醫(yī)學(xué)界和遺傳學(xué)界引起了極大的轟動(dòng)，此后一系列GWAS陸續(xù)展開(kāi)。